一種脂肪酶發(fā)酵方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種脂肪酶發(fā)酵方法。
【背景技術】
[0002]脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶，可催化油脂的選擇性水解及其它酯類的轉酯、氨解反應等，是一種高效的生物催化劑，廣泛應用于生物能源、食品、制革、洗滌、醫(yī)藥和有機合成等諸多工業(yè)領域。在眾多脂肪酶中南極假絲酵母固定化脂肪酶B (以下簡稱固定化脂肪酶)的用途最為廣泛，它對非水溶性和水溶性物質都有很強的催化活性。
[0003]全球范圍內，脂肪酶生產和銷售呈每年擴張的趨勢。脂肪酶的主要供應商丹麥諾維信的產能已經達到滿產，而在丹麥，該產品的產能擴大受到成本的限制。國內的脂肪酶生產商缺乏提升產品品質的能力，一直處于低價格低質量的競爭狀態(tài)，且沒有產業(yè)化的固定化脂肪酶。
[0004]國際上適于生物柴油的脂肪酶產品主要有丹麥諾維信公司以及日本天野公司，其中諾維信公司生產的脂肪酶產品在整個酶法有機合成、藥物合成以及生物柴油制備領域占壟斷地位。據估計中國脂肪酶市場容量約為50億元人民幣，鑒于中國生物柴油、造紙、皮革、食品、飼料、醫(yī)藥制造行業(yè)的高速發(fā)展，脂肪酶的應用會越來越廣泛，市場需求越來越大，預計在未來幾年脂肪酶每年將以10%-15%的速度增長。
[0005]中國專利201310116628.3公開了一種制備固定化脂肪酶的方法。該方法，利用耦合固定化技術即吸附、交聯及包埋三種結合的方法對脂肪酶進行固定化。但該方法動力消耗大，產量少，產出率低，成本高，固定化脂肪酶產品質量低，活性不好。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是提供了一種脂肪酶發(fā)酵方法。
[0007]本發(fā)明的技術方案是:
一種脂肪酶發(fā)酵方法，依次包括以下步驟:
1)稱取蛋白胨4g、酵母提取物2g、甘油4g放入燒杯中，然后加入純化水90g溶解，分裝至搖瓶中，每個搖瓶中裝量35ml，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基；
2)將試管菌種分別接入搖瓶培養(yǎng)基中，用八層紗布封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)22?24h，得到搖瓶種子；
3)向一級種子罐中加入甘油0.06kg、蛋白胨0.04kg、酵母浸粉0.03kg、消泡劑3ml，加入水至3L，調節(jié)pH至7.0，滅菌得到一級種子培養(yǎng)基；
4)調節(jié)一級種子罐內溫度至30°C，用壓差法將搖瓶種子接種至一級種子罐內，攪拌lOOrpm，壓力0.03?0.05MPa，控制DO彡30%，培養(yǎng)16?22h，得到一級種子；
5)向二級種子罐中加入甘油1.2kg、氯化鈉0.15kg、硫酸鎂0.3kg、氫氧化鉀0.18kg、硫酸鈣0.0516kg、85%磷酸0.5lkg、消泡劑30 ml，加入水至29L，調節(jié)pH至5.0，滅菌得到二級種子培養(yǎng)基； 6)調節(jié)二級種子罐內溫度至30°C，將一級種子接種至移種至二級種子罐內，攪拌150rpm，壓力0.03MPa，控制D0100%，培養(yǎng)12?18h，得到二級種子；
7)向發(fā)酵罐中加入甘油92kg、氯化鈉1.15kg、硫酸鎂23kg、氫氧化鉀13.8kg、硫酸媽39.lkg、85%磷酸3.956kg、消泡劑4.6 L，加入水至2100L，調節(jié)pH至5.5，滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基;
8)調節(jié)發(fā)酵罐內溫度至30°C，用壓差法將二級種子移種至發(fā)酵罐內培養(yǎng)，移種時，發(fā)酵罐壓力 0.03MPa，攪拌 150 ?250rpm，控制 D0100% ；
9)當發(fā)酵罐內DO( 30%時，升罐壓至0.04?0.05MPa，攪拌150?250rpm ；
10)向補料罐中加入甘油250kg，滅菌；調節(jié)補料罐內溫度至30°C;當發(fā)酵罐中溶氧回升時，對發(fā)酵罐進行補料，控制發(fā)酵罐D030?40% ；
11)當補料罐中甘油<100升時，向發(fā)酵罐補充甲醇，控制D015?25%，調節(jié)發(fā)酵罐內溫度至25 °C ；
12)發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。
[0008]進一步，所述搖瓶培養(yǎng)基、一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補料罐中甘油的滅菌采用蒸汽滅菌，其滅菌步驟為:
A)預熱，40分鐘內升溫至100C；
B)保溫滅菌，20?30分鐘內升溫到121?123°C，保溫20分鐘；
C)一次降溫，30分鐘降溫到100C ;
D)二次降溫，120分鐘降溫至30°C。
[0009]進一步，所述一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐、補料罐皆設置有空氣分過濾器；在使用一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐、補料罐前先對空氣分過濾器進行滅菌，滅菌時，蒸汽的壓力為0.10?0.13MPa，保壓時間為30?40分鐘。
[0010]進一步，在步驟3中，使用氫氧化鈉調節(jié)pH。
[0011]進一步，在步驟5、7中，使用氨水調節(jié)pH。
[0012]本發(fā)明在脂肪酶提取過程中不使用大量有機溶劑和其他有害原料，減少了對操作人員的傷害；不用對菌體進行分離破碎，減少了動力消耗；脂肪酶的產出率高，產量高，成本低，脂肪酶產品質量好，活性高。提高了固化酶活性，提高產品的使用批次達200或以上。
【具體實施方式】
[0013]下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。
[0014]一種脂肪酶發(fā)酵方法，依次包括以下步驟:
1)稱取蛋白胨4g、酵母提取物2g、甘油4g放入燒杯中，然后加入純化水90g溶解，分裝至搖瓶中，每個搖瓶中裝量35ml，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基；
2)將試管菌種分別接入搖瓶培養(yǎng)基中，用八層紗布封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)22?24h，得到搖瓶種子；
3)向一級種子罐中加入甘油0.06kg、蛋白胨0.04kg、酵母浸粉0.03kg、消泡劑3ml，加入水至3L，使用氫氧化鈉調節(jié)pH至7.0，滅菌得到一級種子培養(yǎng)基；
4)調節(jié)一級種子罐內溫度至30°C，用壓差法將搖瓶種子接種至一級種子罐內，攪拌lOOrpm，壓力0.03?0.05MPa，控制DO彡30%，培養(yǎng)16?22h，得到一級種子； 5)向二級種子罐中加入甘油1.2kg、氯化鈉0.15kg、硫酸鎂0.3kg、氫氧化鉀0.18kg、硫酸鈣0.0516kg、85%磷酸0.51kg、消泡劑30 ml，加入水至29L，使用氨水調節(jié)pH至5.0，滅菌得到二級種子培養(yǎng)基；
6)調節(jié)二級種子罐內溫度至30°C，將一級種子接種至移種至二級種子罐內，攪拌150rpm，壓力0.03MPa，控制D0100%，培養(yǎng)12?18h，得到二級種子；
7)向發(fā)酵罐中加入甘油92kg、氯化鈉1.15kg、硫酸鎂23kg、氫氧化鉀13.8kg、硫酸媽39.lkg、85%磷酸3.956kg、消泡劑4.6 L，加入水至2100L，使用氨水調節(jié)pH至5.5，滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基；
8)調節(jié)發(fā)酵罐內溫度至30°C，用壓差法將二級種子移種至發(fā)酵罐內培養(yǎng)，移種時，發(fā)酵罐壓力 0.03MPa，攪拌 150 ?250rpm，控制 D0100% ；
9)當發(fā)酵罐內DO( 30%時，升罐壓至0.04?0.05MPa，攪拌150?250rpm ；
10)向補料罐中加入甘油250kg，滅菌；調節(jié)補料罐內溫度至30°C;當發(fā)酵罐中溶氧回升時，對發(fā)酵罐進行補料，控制發(fā)酵罐D030?40% ；
11)當補料罐中甘油<100升時，向發(fā)酵罐補充甲醇，控制D015?25%，調節(jié)發(fā)酵罐內溫度至25 °C ；
12)發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。
[0015]所述搖瓶培養(yǎng)基、一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補料罐中甘油的滅菌采用蒸汽滅菌，其滅菌步驟為:
A)預熱，40分鐘內升溫至100C；
B)保溫滅菌，20?30分鐘內升溫到121?123°C，保溫20分鐘；
C)一次降溫，30分鐘降溫到100C ;
D)二次降溫，120分鐘降溫至30°C。
[0016]所述一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐、補料罐皆設置有空氣分過濾器；在使用一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐、補料罐前先對空氣分過濾器進行滅菌，滅菌時，蒸汽的壓力為0.10?0.13MPa，保壓時間為30?40分鐘。
[0017]經檢驗得到的固定化堿性脂肪酶活力為12100U/g。
[0018]凡在不脫離本發(fā)明核心的情況下做出的簡單的變形或修改均落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)稱取蛋白胨4g、酵母提取物2g、甘油4g放入燒杯中，然后加入純化水90g溶解，分裝至搖瓶中，每個搖瓶中裝量35ml，滅菌得到搖瓶培養(yǎng)基； 2)將試管菌種分別接入搖瓶培養(yǎng)基中，用八層紗布封口，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)22?24h，得到搖瓶種子； 3)向一級種子罐中加入甘油0.06kg、蛋白胨0.04kg、酵母浸粉0.03kg、消泡劑3ml，加入水至3L，調節(jié)pH至7.0，滅菌得到一級種子培養(yǎng)基； 4)調節(jié)一級種子罐內溫度至30°C，用壓差法將搖瓶種子接種至一級種子罐內，攪拌lOOrpm，壓力0.03?0.05MPa，控制DO彡30%，培養(yǎng)16?22h，得到一級種子； 5)向二級種子罐中加入甘油1.2kg、氯化鈉0.15kg、硫酸鎂0.3kg、氫氧化鉀0.18kg、硫酸鈣0.0516kg、85%磷酸0.5lkg、消泡劑30 ml，加入水至29L，調節(jié)pH至5.0，滅菌得到二級種子培養(yǎng)基； 6)調節(jié)二級種子罐內溫度至30°C，將一級種子接種至移種至二級種子罐內，攪拌150rpm，壓力0.03MPa，控制D0100%，培養(yǎng)12?18h，得到二級種子； 7)向發(fā)酵罐中加入甘油92kg、氯化鈉1.15kg、硫酸鎂23kg、氫氧化鉀13.8kg、硫酸媽39.lkg、85%磷酸3.956kg、消泡劑4.6 L，加入水至2100L，調節(jié)pH至5.5，滅菌得到發(fā)酵培養(yǎng)基; 8)調節(jié)發(fā)酵罐內溫度至30°C，用壓差法將二級種子移種至發(fā)酵罐內培養(yǎng)，移種時，發(fā)酵罐壓力 0.03MPa，攪拌 150 ?250rpm，控制 D0100% ； 9)當發(fā)酵罐內DO( 30%時，升罐壓至0.04?0.05MPa，攪拌150?250rpm ； 10)向補料罐中加入甘油250kg，滅菌；調節(jié)補料罐內溫度至30°C;當發(fā)酵罐中溶氧回升時，對發(fā)酵罐進行補料，控制發(fā)酵罐D030?40% ； 11)當補料罐中甘油<100升時，向發(fā)酵罐補充甲醇，控制D015?25%，調節(jié)發(fā)酵罐內溫度至25 °C ； 12)發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。
2.根據權利要求1所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:所述搖瓶培養(yǎng)基、一級種子培養(yǎng)基、二級種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補料罐中甘油的滅菌采用蒸汽滅菌，其滅菌步驟為: A)預熱，40分鐘內升溫至100C； B)保溫滅菌，20?30分鐘內升溫到121?123°C，保溫20分鐘； C)一次降溫，30分鐘降溫到100C ; D)二次降溫，120分鐘降溫至30°C。
3.根據權利要求1或2所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:所述一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐、補料罐皆設置有空氣分過濾器；在使用一級種子罐、二級種子罐、發(fā)酵罐、補料罐前先對空氣分過濾器進行滅菌，滅菌時，蒸汽的壓力為0.10?0.13MPa，保壓時間為30?40分鐘ο
4.根據權利要求3所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:在步驟3中，使用氫氧化鈉調節(jié)pH。
5.根據權利要求3所述的脂肪酶發(fā)酵方法，其特征在于:在步驟5、7中，使用氨水調節(jié)pHo
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪酶發(fā)酵方法，其步驟為1）制取搖瓶培養(yǎng)基；2）接種脂肪酶試管菌種，培養(yǎng)得到搖瓶種子；3）制取一級種子培養(yǎng)基；4）接種搖瓶種子，培養(yǎng)得到一級種子；5）制取二級種子培養(yǎng)基；6）接種一級種子，培養(yǎng)得到二級種子；7）制取發(fā)酵培養(yǎng)基；8）移種二級種子，發(fā)酵培養(yǎng)130h，得到脂肪酶成品。本發(fā)明在脂肪酶提取過程中不使用大量有機溶劑和其他有害原料，減少了對操作人員的傷害；不用對菌體進行分離破碎，減少了動力消耗；脂肪酶的產出率高，產量高，成本低，脂肪酶產品質量好，活性高。提高了固化酶活性，提高產品的使用批次達200或以上。
【IPC分類】C12N9-20
【公開號】CN104762278
【申請?zhí)枴緾N201510196047
【發(fā)明人】林楠棋, 張欣, 王悅璋, 詹艷艷
【申請人】焦作健康元生物制品有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月23日