本發(fā)明公開(kāi)了一種采用氧化酶拆分α-羥酸酯的方法，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

α-羥酸酯(alpha-hydroxy esters)是α-羥酸與醇酯化脫水后得到產(chǎn)物，在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，如丹參素與異丙醇脂化后生成的丹參素異丙酯等。

化學(xué)合成的外消旋α-羥酸酯常用的酶拆分的方法是采用脂肪酶或酯酶水解方案，如一種酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法(中國(guó)專利201510212293.4)、豬胰脂肪酶作水解拆分甘油丁酸酯(縮水甘油丁酸酯的對(duì)映選擇性酶促水解.華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，25(2)：209～212)、Novozym 435對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯的不對(duì)稱水解(脂肪酶催化外消旋對(duì)羥基苯甘氨酸甲酯水解制備對(duì)映體純D-對(duì)羥基苯甘氨酸的新方法.催化學(xué)報(bào)，2005，26(2)：106～110)等。但脂肪酶的立體選擇性不高，很難在高回收率下得到99％以上的光學(xué)純產(chǎn)品。

本發(fā)明采用α-羥酸氧化酶進(jìn)行α-羥酸酯的手性拆分，α-羥酸氧化酶家族已知成員有：乳酸氧化酶、乙醇酸氧化酶、扁桃酸氧化酶和長(zhǎng)鏈α-羥酸氧化酶等。這些酶通常被用于外消旋α-羥酸的手性拆分(中國(guó)專利201210109290.4)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

α-羥酸氧化酶拆分外消旋α-羥酸酯的步驟為：稱取外消旋α-羥酸酯加入到反應(yīng)器中使外消旋α-羥酸酯的初始反應(yīng)濃度為1-40mM，再加入pH為4-10的反應(yīng)緩沖液和α-羥酸氧化酶形成反應(yīng)體系，α-羥酸氧化酶用量為1-100μg/ml，在20-50℃下水浴搖床150r/min振蕩，反應(yīng)時(shí)間為1-24小時(shí)，α-羥酸氧化酶氧化其對(duì)應(yīng)的α-羥酸酯。按照此方法進(jìn)行拆分，對(duì)映體過(guò)量高達(dá)到99.9％，產(chǎn)率最高接近50％。

產(chǎn)物(R)-α-羥酸酯的光學(xué)純度通過(guò)對(duì)映體過(guò)量值(％e.e)來(lái)評(píng)價(jià)。

當(dāng)采用L-α-羥酸氧化酶拆分時(shí)，得到光學(xué)純的(R)-α-羥酸酯(D-α-羥酸酯)

對(duì)映體過(guò)量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

(R)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

當(dāng)采用D-α-羥酸氧化酶拆分時(shí)，得到光學(xué)純的(S)-α-羥酸酯(L-α-羥酸酯)

對(duì)映體過(guò)量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_R+S_S)]×100％

(S)-α-羥酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_S為反應(yīng)后(S)-對(duì)映體的峰面積，S_R為反應(yīng)后(R)-對(duì)映體的液相色譜峰面積，S₀為反應(yīng)前(S)-和(R)-對(duì)映體的液相色譜峰面積總和。

產(chǎn)物測(cè)定的液相色譜條件為：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流動(dòng)相體積比為正己烷：異丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20μL。

所述的α-羥酸酯為下列之一：丹參素冰片酯、丹參素異丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸異丙酯、對(duì)羥基苯乳酸冰片酯、對(duì)羥基苯乳酸異丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸異丙酯、丹參素細(xì)辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸細(xì)辛醇酯、對(duì)羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯、乳酸乙醇酯、α-羥基丁酸丙醇酯。所述的α-羥酸酯，可以根據(jù)中國(guó)專利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本發(fā)明所用的α-羥酸氧化酶有：L型和D型兩類。

L型α-羥酸氧化酶有：鼠肝α-羥酸氧化酶(根據(jù)文獻(xiàn)制備得到：Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification and properties.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)–Enzymology,1968,167:9-22)，雞肝α-羥酸氧化酶(根據(jù)文獻(xiàn)制備得到：Purification and some characteristics of chicken liver L-2-hydroxyacid oxidase A.FEBS Lett.1990,266:183-6)，Pediococcus sp.乳酸氧化酶(購(gòu)自sigma),Aerococcus viridans乳酸氧化酶(購(gòu)自日本Asahi Kasei Pharma Corporation)，Lactococcus lacti乳酸氧化酶(根據(jù)文獻(xiàn)制備得到：Gene cloning,purification,and characterization of a lactate oxidase from Lactococcus lactis subsp.cremoris IFO3427，Journal of Fermentation and Bioengineering，1998,85(5),507-510)。

D型α-羥酸氧化酶有：Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶(根據(jù)文獻(xiàn)制備得到：Cellular localization of D-lactate dehydrogenase and NADH oxidase from Archaeoglobus fulgidus，Archaea.2002；1(2):95-104),Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶(根據(jù)文獻(xiàn)制備得到：A novel flavin adenine dinucleotide(FAD)containing d-lactate dehydrogenase from the thermoacidophilic crenarchaeota Sulfolobus tokodaii strain 7:purification,characterization and expression in Escherichia coli.J Biosci Bioeng.2008，106(1):16-21)，

本發(fā)明的有益之處：本專利所指的氧化酶均以FAD或FMN為輔酶，與以NAD或NADP為輔酶的羥酸脫氫酶或乳酸脫氫酶相比，逆反應(yīng)極微弱，無(wú)論提取的酶液或α-羥酸氧化酶的基因工程菌全細(xì)胞均適用于規(guī)?；苽涫中约?chǔ)?羥酸酯。同時(shí)該方法解決了脂肪酶水解拆分法光學(xué)選擇性差的缺點(diǎn)，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋丹參素異丙酯濃度為40mM，L型鼠肝α-羥酸氧化酶濃度為100μg/ml，pH6，30℃水浴搖床150r/min振蕩24小時(shí)，測(cè)定(R)-丹參素異丙酯的對(duì)映體過(guò)量為99.9％，產(chǎn)率為49.9％。

實(shí)施例2

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋丹參素冰片酯濃度為1mM，L型雞肝α-羥酸氧化酶濃度為1μg/ml，pH7，35℃水浴搖床150r/min振蕩1小時(shí)，測(cè)定(R)-丹參素冰片酯的對(duì)映體過(guò)量為85.2％，產(chǎn)率為36.2％。

實(shí)施例3

配制10ml反應(yīng)體系，外消旋丹參素細(xì)辛醇酯濃度為5mM，L型Pediococcus sp.乳酸氧化酶濃度為50μg/ml，pH 8，40℃水浴搖床150r/min振蕩12小時(shí)，測(cè)定(R)-丹參素細(xì)辛醇酯的對(duì)映體過(guò)量為99.7％，產(chǎn)率為49.8％。

實(shí)施例4

配制10ml反應(yīng)體系，外消旋乳酸冰片酯濃度為10mM，L型Aerococcus viridans乳酸氧化酶濃度為5μg/ml，pH 4，40℃水浴搖床150r/min振蕩8小時(shí)，測(cè)定(R)-乳酸冰片酯的對(duì)映體過(guò)量為73.1％，產(chǎn)率為38.5％。

實(shí)施例5

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋苯乳酸冰片酯濃度為20mM，L型Lactococcus lacti乳酸氧化酶濃度為10μg/ml，pH 5，45℃水浴搖床150r/min振蕩8小時(shí)，測(cè)定(R)-苯乳酸冰片酯的對(duì)映體過(guò)量為95.2％，產(chǎn)率為44.4％。

實(shí)施例6

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋苯乳酸異丙酯濃度為30mM，D型Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶濃度為20μg/ml，pH 6，50℃水浴搖床150r/min振蕩4小時(shí)，測(cè)定(S)-苯乳酸異丙酯的對(duì)映體過(guò)量為91.9％，產(chǎn)率為40.5％。

實(shí)施例7

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋對(duì)羥基苯乳酸冰片酯濃度為1mM，D型Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶濃度為30μg/ml，pH 7，20℃水浴搖床150r/min振蕩2小時(shí)，測(cè)定(S)-對(duì)羥基苯乳酸冰片酯的對(duì)映體過(guò)量為99.9％，產(chǎn)率為49.9％。

實(shí)施例8

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋對(duì)羥基苯乳酸異丙酯濃度為5mM，L型鼠肝α-羥酸氧化酶濃度為40μg/ml，pH 8，25℃水浴搖床150r/min振蕩4小時(shí)，測(cè)定(R)-對(duì)羥基苯乳酸異丙酯的對(duì)映體過(guò)量為79.6％，產(chǎn)率為38.9％。

實(shí)施例9

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋扁桃酸冰片酯濃度為10mM，L型雞肝α-羥酸氧化酶濃度為50μg/ml，pH 9，30℃水浴搖床150r/min振蕩6小時(shí)，測(cè)定(R)-扁桃酸冰片酯的對(duì)映體過(guò)量為99.9％，產(chǎn)率為49.9％。

實(shí)施例10

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋扁桃酸異丙酯濃度為20mM，L型Pediococcus sp.乳酸氧化酶濃度為60μg/ml，pH 6，35℃水浴搖床150r/min振蕩8小時(shí)，測(cè)定(R)-扁桃酸異丙酯的對(duì)映體過(guò)量為99.9％，產(chǎn)率為49.9％。

實(shí)施例11

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋苯乳酸細(xì)辛醇酯濃度為30mM，L型Aerococcus viridans乳酸氧化酶濃度為100μg/ml，pH 7，40℃水浴搖床150r/min振蕩10小時(shí)，測(cè)定(R)-苯乳酸細(xì)辛醇酯的對(duì)映體過(guò)量為95.9％，產(chǎn)率為46.9％。

實(shí)施例12

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋乳酸對(duì)羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯濃度為1mM，L型Lactococcus lacti乳酸氧化酶濃度為30μg/ml，pH 8，45℃水浴搖床150r/min振蕩12小時(shí)，測(cè)定(R)-對(duì)羥基苯乳酸細(xì)辛醇酯的對(duì)映體過(guò)量為99.9％，產(chǎn)率為49.9％。

實(shí)施例13

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋乳酸乙醇酯濃度為40mM，D型Archaeoglobus fulgidus乳酸氧化酶濃度為30μg/ml，pH 9，50℃水浴搖床150r/min振蕩14小時(shí)，測(cè)定(S)-乳酸乙醇酯的對(duì)映體過(guò)量為99.9％，產(chǎn)率為49.9％。本實(shí)施例中液相測(cè)定所用的檢測(cè)器為視差檢測(cè)器。

實(shí)施例14

配制5ml反應(yīng)體系，外消旋α-羥基丁酸丙醇酯濃度為1mM，D型Sulfolobus tokodaii乳酸氧化酶濃度為20μg/ml，pH 7，30℃水浴搖床150r/min振蕩20小時(shí)，測(cè)定(S)-α-羥基丁酸丙醇酯的對(duì)映體過(guò)量為99.9％，產(chǎn)率為49.9％。本實(shí)施例中液相測(cè)定所用的檢測(cè)器為視差檢測(cè)器。