酯酶蛋白及其編碼基因以及它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酯酶蛋白，還涉及該酯酶蛋白的編碼基因，含有編碼酯酶蛋白的 基因的重組載體和細(xì)胞，含有該酯酶蛋白的組合物，以及所述酯酶蛋白及其編碼基因的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酯酶（EsteraseE.C.3. 1. 1. 1)是自然界中常見的酯水解酶類，普遍存在于動物、 植物和微生物中，其中微生物來源的酯酶種類最為豐富。不同來源的酯酶基因差別大，同 源性不高，但在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上具有極高的相似性，即a/P折疊酶結(jié)構(gòu)；催化反應(yīng)機(jī) 理都遵循絲氨酸水解酶的反應(yīng)機(jī)制，即催化結(jié)構(gòu)域包含絲氨酸-組氨酸-谷氨酸(或天冬 氨酸）三聯(lián)體活性中心結(jié)構(gòu)并在絲氨酸活性位點附近存在絲氨酸水解酶的特征保守序列 G-X-S-X-G。酯酶和脂肪酶在結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理上具有極高的相似性，其主要區(qū)別：酯酶主要 是水解短鏈水溶性酯底物，催化過程中遵循典型的米氏方程；而脂肪酶能夠催化水解疏水 性長鏈脂肪酸脂底物，并且在催化過程中表現(xiàn)界面活性。
[0003] 微生物來源的酯酶種類最為繁多，根據(jù)的它們的氨基酸序列相似性和基本生物學(xué) 特性，Arpigny于1999年將其系統(tǒng)劃分為8個大的家族；其中家族一為脂肪酶，家族二到八 為酯酶。幾年來隨著大量新的酯酶基因的發(fā)現(xiàn)，目前已提出了 9到15酯酶家族。
[0004] 酯酶/脂肪酶由于其蛋白分子穩(wěn)定、催化反應(yīng)簡單、不依賴輔助因子、底物范圍廣 等優(yōu)點，被廣泛的應(yīng)用于食品加工、洗滌劑，醫(yī)藥、化妝品、化合物制備等行業(yè)。據(jù)初步統(tǒng)計 全球工業(yè)酶產(chǎn)值在2004達(dá)到了 20億，并以每年4-5%的數(shù)率在增長，其中脂肪酶類的使用 占總用酶頻率的10%。近年來隨著手性化合物在制藥、農(nóng)藥、香料、液晶、功能性高分子等工 業(yè)中廣泛的應(yīng)用，酯酶對手性化合物拆分的特性更加凸現(xiàn)出來。相比于脂肪酶，酯酶在手性 拆分上表現(xiàn)著更顯著的效果，例如利用酯酶NP對手性萘普生進(jìn)行拆分可以得到99%光學(xué)純 的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%的對應(yīng)體產(chǎn)物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人基于對來自西藏冰川土壤的分析，意外的發(fā)現(xiàn)了酯酶蛋白及其編 碼基因。另外，本發(fā)明還提供了含有編碼所述酯酶蛋白的基因的重組載體、細(xì)胞，以及含有 所述酯酶蛋白的組合物，以及它們的應(yīng)用。
[0006] 第一方面，本發(fā)明提供了一種酯酶蛋白，其中，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQID No :2所示。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼酯酶蛋白的基因，其中，該基因的核苷酸序列為 能夠編碼SEQIDNo :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0008] 第三方面，本發(fā)明提供了一種引物對，其中，該引物對包括如SEQIDNo :3所示的 上游引物和如SEQIDNo :4所示的下游引物。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有如上所述的基因。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有如上所述的基 因。
[0011] 第六方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其中，該組合物含有如上所述的酯酶蛋白。
[0012] 第七方面，本發(fā)明提供了如上所述的酯酶蛋白、如上所述的基因、如上所述的重組 載體、如上所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和如上所述的組合物在降解硝基苯酚酯和/或在食品、洗滌 用品、醫(yī)藥、化妝品中的應(yīng)用。
[0013] 由實施例可以看出，本發(fā)明的提供的酯酶蛋白具有較高的酯酶活性，能夠有效地 降解硝基苯酚酯。并且具有廣泛的pH值耐受性、低溫耐受性以及耐鹽的特性。
[0014] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0015] 附圖是用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0016] 圖1為表達(dá)純化的各個階段中重組蛋白溶液的SDS-PAGE電泳圖；M :蛋白Marker ; 1:對照酶液；2:重組菌粗酶液；3 :Ni-NDA His-Bind Column第一次純化后得到的重組蛋白 溶液；4:Ni-NDA His-Bind Column第二次純化后得到的重組蛋白溶液。
[0017] 圖2顯示了重組蛋白對不同底物的比活。
[0018] 圖3顯示了重組蛋白在不同溫度下的比活。
[0019] 圖4顯示了重組蛋白在不同pH下的比活。
[0020] 圖5顯示了重組蛋白在不同NaCl濃度下的比活。
【具體實施方式】
[0021] 以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0022] 第一方面，本發(fā)明提供了一種酯酶蛋白，其中，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No :2所示。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，所在酯酶蛋白可以由人工合成獲得，也可以通過該酯酶蛋白的氨基 酸序列獲得其編碼基因，然后再進(jìn)行相應(yīng)的生物表達(dá)獲得。
[0024] 基于此，第二方面，本發(fā)明提供了一種編碼如上酯酶蛋白的基因。
[0025] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，遺傳密碼子具有簡并性，因此，在了解如上酯酶蛋白的氨基 酸序列的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)的技術(shù)手段能夠獲得核苷酸序列不同的、且能 夠編碼如上酯酶蛋白編碼基因。優(yōu)選的情況下，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0026] 第三方面，本發(fā)明提供了一種引物對，其中，該引物對包括如SEQ ID No :3所示的 h游引物（5' -GCGGGATCCATGACTGTGAATCCTC-3' )和如 SEQ ID No :4所示的下游引物（5'-GC GGAGCTCGGACTATTTTTGTCCCAG-3' )。
[0027] 本發(fā)明提供的上述引物對能夠特異性的擴(kuò)增SEQIDNo:1所示的基因。所述特異 性擴(kuò)增是指所述引物對能夠擴(kuò)增SEQIDNo.1所示的核酸、并產(chǎn)生特定大小的目標(biāo)條帶，所 述引物對不能夠擴(kuò)增SEQIDNo.1所示的核酸以外的核酸或者擴(kuò)增不能產(chǎn)生特定大小的目 標(biāo)條帶。
[0028] 另外，根據(jù)本發(fā)明，為了便于該引物對所擴(kuò)增的基因片段能夠有效地與載體相連， 所述引物對上還設(shè)計有酶切位點，如SEQ ID No :3所示的上游引物下劃線部分為BamHI的 酶切位點，SEQ ID No :4所示的下游引物下劃線部分為SacI的酶切位點。
[0029] 本發(fā)明需要說明的是，本發(fā)明提供的所述引物中的酶切位點并不能夠作為對本發(fā) 明的引物的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)預(yù)定的與所述引物對擴(kuò)增的基因相連的載體上的酶 切位點，能夠相應(yīng)的設(shè)計具有不同酶切位點的引物對。
[0030] 第四方面，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有如上所述的基 因。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明，所述重組載體具體可以為重組表達(dá)載體?？梢杂矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu) 建含有所述基因的重組表達(dá)載體。為了增強(qiáng)目的基因的轉(zhuǎn)錄，在使用所述基因構(gòu)建重組表 達(dá)載體時，可以在其轉(zhuǎn)錄起始密碼子前添加任何一種本領(lǐng)域常規(guī)的增強(qiáng)型啟動子或組成型 啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結(jié)合使用。此外，為了進(jìn)一步增強(qiáng)目的基因的轉(zhuǎn) 錄和/或翻譯，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還可使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和/或翻譯增 強(qiáng)子。
[0032] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū) 域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明，上述啟動子以及增強(qiáng)子可以為本領(lǐng)域常規(guī)的啟動子和增強(qiáng)子，在此 不再詳細(xì)贅述。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明，所述"載體"可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種質(zhì)粒、粘 粒、噬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等。優(yōu)選地，所述載體為pET28a質(zhì)粒。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，為了便于目的蛋白的分離與純化，在構(gòu)建所述載體時，還可以加入表 達(dá)如表1所不的標(biāo)簽的核昔酸序列，在目的蛋白中，表1所不的標(biāo)簽連接在目的蛋白的氣基 末端或羧基末端。
[0036] 表1標(biāo)簽的序列
【主權(quán)項】
1. 一種酯酶蛋白，其特征在于，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。
2. -種編碼酯酶蛋白的基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列為能夠編碼SEQID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其中，該基因的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。
4. 一種引物對，其特征在于，該引物對包括如SEQIDNo:3所示的上游引物和如SEQ IDNo:4所示的下游引物。
5. -種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權(quán)利要求2所述的基因。
6. -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為原核細(xì)胞。
8. -種組合物，其特征在于，該組合物含有權(quán)利要求1所述的酯酶蛋白。
9. 權(quán)利要求1所述的酯酶蛋白、權(quán)利要求2所述的基因、權(quán)利要求5所述的重組載體、 權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和權(quán)利要求8所述的組合物在降解硝基苯酚酯和/或在食 品、洗滌用品、醫(yī)藥、化妝品中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述硝基苯酚酯為對硝基苯酚乙酸酯，對硝基 苯酚丙酸酯，對硝基苯酚丁酸酯，對硝基苯酚己酸酯、對硝基苯酚辛酸酯和對硝基苯酚癸酸 酯中的一種或多種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酯酶蛋白，其中，該酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。另一方面，本發(fā)明還提供了一種編碼酯酶蛋白的基因，其中，該基因的核苷酸序列為能夠編碼SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，本發(fā)明還提供了如上所述的酯酶蛋白及其編碼基因的應(yīng)用。由實施例可以看出，本發(fā)明的提供的酯酶蛋白具有較高的酯酶活性，能夠有效地降解硝基苯酚酯。
【IPC分類】C12P7-40, C12P7-52, C12N9-18, C12N15-11, C12P7-54, C12N15-63, C12N1-21, C12N15-55, C12P13-00
【公開號】CN104762276
【申請?zhí)枴緾N201410008456
【發(fā)明人】薛燕芬, 翟磊, 馬延和
【申請人】中國科學(xué)院微生物研究所
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2014年1月8日