一種人腸道羧酸酯酶活性檢測的熒光探針底物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人腸道羧酸酯酶活性檢測的熒光探針底 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 羧酸酯酶（Carboxylesterase，CE)是機體內(nèi)重要的I相代謝酶，它能夠催化多種 內(nèi)源性和外源性的酯類化合物發(fā)生酯鍵斷裂，水解后釋放出極性較大的醇分子和羧酸分子 片段，后者進而被體內(nèi)細胞色素 P450(CYP450)或尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGTs)等 其他代謝酶所繼續(xù)催化代謝，使藥物分子更有效地被排出體外。多種結(jié)構(gòu)中含有酯鍵的藥 物分子，如鹽酸伊立替康（irinotecan，CPT-11)、奧司他韋（達菲）、氯批格雷、貝諾酯等均 被羧酸酯酶催化進行活化或代謝消除。
[0003] 人體內(nèi)介導(dǎo)藥物代謝的羧酸酯酶主要分為兩個亞型：羧酸酯酶1 (hCEl)和羧酸酯 酶2 (hCE2)。兩種羧酸酯酶具有不同的組織分布特異性及底物選擇性，人的肝臟中主要分布 表達hCEl，而小腸中則基本以hCE2為主，只有極少量的hCEl分布。因此，人羧酸酯酶2亦 稱為人腸道羧酸酯酶（Human intestine carboxylesterase)。近年來發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞 中hCE2的表達水平上調(diào)，可借助此特征設(shè)計經(jīng)hCE2特異性水解的抗腫瘤前體藥物實現(xiàn)靶 向選擇性殺傷腫瘤細胞的目的。此外，多數(shù)口服前藥需先經(jīng)過腸道才能被吸收進入血液循 環(huán)，因此腸道中羧酸酯酶2酶對酯類藥物的代謝被認為是其首過代謝的重要組成部分，羧 酸酯酶2酶活的差異對于前體藥物的生物利用度具有十分重要的影響。此外，有些經(jīng)靜脈 給藥的前體藥物，如鹽酸伊立替康，會經(jīng)過膽汁排泄被分泌到腸道中，繼而被腸道中的hCE2 催化水解釋放出毒性代謝產(chǎn)物SN-38,后者被認為是導(dǎo)致伊立替康遲發(fā)型腹瀉副作用的主 要原因。因而，建立基于熒光探針的高通量技術(shù)手段，對于高通量篩選hCE2的強效抑制劑 并將其應(yīng)用于減緩伊立替康導(dǎo)致的遲發(fā)型腹瀉，以及hCE2功能的實時定量檢測進而預(yù)測 潛在的藥物-藥物相互作用都十分重要。
[0004] 本發(fā)明提供了一類（E)-2-(4-(4-羥基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋 喃-2 (5H)-亞基）丙二腈酯類衍生物作為hCE2熒光探針底物的應(yīng)用，其經(jīng)hCE2水解后可 生成具有良好熒光屬性的水解產(chǎn)物。該酶促反應(yīng)具有選擇性高、代謝產(chǎn)物易檢測、酶活及抑 制活性評價快速高效等特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一類可定量檢測人腸道羧酸酯酶活性的熒光探針底物及 其應(yīng)用，該探針底物的水解產(chǎn)物具有良好的熒光屬性。利用該探針反應(yīng)可對多種生物體系 中hCE2的分布和功能進行定量評價。
[0006] -種人腸道羧酸酯酶（hCE2)的特異性熒光探針底物，該底物為（E)-2-(4-(4-羥 基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2(5H)_亞基）丙二腈（簡寫為TCF)的芳香酯 (簡寫為TCFE)，其結(jié)構(gòu)通式為：
[0007]
[0008] 其中，R為苯基、對甲基苯基、對乙基苯基、對丙基苯基、對己基丙基、對硝基苯基、 對氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基或4-乙氧基苯基取代基中的任意 一種。
[0009] -種人腸道羧酸酯酶（hCE2)的特異性熒光探針底物在生物檢測中的應(yīng)用，所述 熒光探針底物可被人腸道羧酸酯酶特異性催化并生成水解產(chǎn)物TCF，該產(chǎn)物具有熒光發(fā) 射屬性，可采用熒光檢測器實現(xiàn)產(chǎn)物的快速超靈敏檢測；TCF熒光檢測條件為：激發(fā)波長 560nm，在590~675nm進行熒光發(fā)射譜的檢測；該熒光探針底物可用作人腸道羧酸酯酶活 性快速定量檢測，以及人腸道羧酸酯酶抑制劑的快速篩選與評估。
[0010] 人腸道羧酸酯酶活性快速定量檢測方法為：以TCFE水解反應(yīng)作為hCE2的特異性 探針反應(yīng)，hCE2特異性催化TCFE并生成水解產(chǎn)物TCF，該產(chǎn)物具有良好的熒光屬性，可通過 定量檢測單位時間內(nèi)熒光強度的變化測定hCE2的真實活性。
[0011] 人腸道羧酸酯酶抑制劑的快速篩選與評估方法為：以TCFE水解反應(yīng)作為hCE2的 特異性探針反應(yīng)，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態(tài)下單位時間內(nèi)水解產(chǎn)物TCF的生成 量評估該生物體系中hCE2的殘余活性，進而實現(xiàn)hCE2抑制劑的快速篩選及抑制能力的定 量評價。
[0012] 人腸道羧酸酯酶活性快速定量檢測的具體步驟如下：
[0013] (1)使用常用緩沖液，反應(yīng)溫度為20°C至60°C之間；孵育體系pH介于5. 5~10. 5 之間；
[0014] (2)以（E) -2- (4- (4-羥基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亞基） 丙二腈酯類衍生物作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10~lOKm;
[0015] (3)反應(yīng)時間為5~120分鐘，在確保水解產(chǎn)物達到定量限且底物轉(zhuǎn)化率在 0. 1 %~20%之間終止反應(yīng)；
[0016] (4)定量測定單位時間內(nèi)水解產(chǎn)物生成量代入標(biāo)準(zhǔn)曲線后換算獲得hCE2的活性 及酶量。
[0017] 人腸道羧酸酯酶抑制劑的篩選與評估方法具體步驟為：
[0018] (1)使用常用緩沖液，反應(yīng)溫度為20°C至60°C之間；孵育體系pH介于5. 5~10. 5 之間；
[0019] (2)以（E) -2- (4- (4-羥基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亞基） 丙二腈酯類衍生物作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/1〇~ι〇Μ尤選&;
[0020] (3)加入不同濃度的抑制劑并設(shè)置空白對照組，孵育5~120分鐘，并在水解產(chǎn)物 達到定量限且底物轉(zhuǎn)化率在〇. 1 %~20%之間終止反應(yīng)；
[0021] (4)定量測定單位時間內(nèi)水解產(chǎn)物的熒光值并計算加入抑制劑組對熒光值減少的 百分?jǐn)?shù)作為抑制活性評估標(biāo)準(zhǔn)。
[0022] 本發(fā)明所述特異性檢測人腸道羧酸酯酶（hCE2)活性的熒光探針底物的應(yīng)用領(lǐng) 域，包括但不限于重組表達的hCE2酶、含有hCE2的細胞及組織制備物等生物樣品中hCE2 活性的定量測定。
[0023] 本發(fā)明提供的特異性檢測人腸道羧酸酯酶（hCE2)活性的熒光探針底物的應(yīng)用， 需注意所述底物消除率或水解產(chǎn)物的生成率應(yīng)介于〇. 1%~20%之間。
[0024] 本發(fā)明提供的特異性檢測人腸道羧酸酯酶（hCE2)活性的熒光探針底物的應(yīng)用， 探針分子的水解產(chǎn)物具有良好的熒光屬性，可采用熒光檢測器實現(xiàn)產(chǎn)物及底物的快速靈敏 檢測；熒光檢測條件為：激發(fā)波長560nm，在590~675nm進行熒光發(fā)射譜的檢測。此外，該 特異性探針底物及相應(yīng)hCE2活性檢測過程不會受生物體系基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾，可用于各 種生物體系中hCE2酶活的定量測定。
[0025] 該特異性探針反應(yīng)可用于重組羧酸酯酶、細胞或組織制備液等多種生物體系中 hCE2酶活的定量測定，還可用于快速篩選hCE2酶的抑制劑及抑制能力的定量評價。
[0026] 采用hCE2單酶或肝微粒體孵育體系進行考察，通過相關(guān)性分析，特異性抑制實 驗，重組單酶代謝反應(yīng)，以及酶反應(yīng)動力學(xué)等多方面的證據(jù)，證明（E)-2-(4-(4-羥基苯乙 烯基）-3-氰基_5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亞基）丙二腈酯類衍生物可特異性的經(jīng)羧酸酯 酶hCE2代謝生成相應(yīng)的水解產(chǎn)物（如圖5-圖8所示）。
[0027] 選用本發(fā)明所述hCE2的特異性探針底物檢測hCE2酶體外活性具有以下突出優(yōu) 勢：
[0028] (1)高特異性：(E) -2- (4- (4-羥基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋 喃-2 (5H)-亞基）丙二腈酯類衍生物可被hCE2高特異性地代謝成單一代謝產(chǎn)物，其它人體 酯酶或具有水解活性的蛋白不參與其類化合物的水解。
[0029] (2)高靈敏度：產(chǎn)物伍)-2-(4-(4-羥基苯乙烯基）-3-氰基-5,5-二甲基呋 喃-2 (5H)-亞基）丙二腈具有良好的熒光屬性，具有較長的熒光發(fā)射波長（最大發(fā)射波長 在612nm)，可減少生物樣本自身背景熒光，增強檢測的靈敏度，在生物樣本中具有良好的應(yīng) 用前景。
[0030] (3)高準(zhǔn)確性：通過繪制代謝產(chǎn)物熒光強度與酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及日內(nèi)差和 日間差研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物TCF的熒光強度與hCE2的酶濃度具有良好的線性關(guān)系，對不同生物 樣品中hCE2活性的定量檢測誤差小于5%。
[0031] (4)高通量：利用該類熒光探針底物可實現(xiàn)96, 386孔板的快速檢測，可實現(xiàn)每日2 萬個樣品的高通量檢測，具有單個測試成本低廉（〈0.5元）的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0032] 圖1. (E)-2-(4-(4-羥基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亞基）丙 二腈酯類衍生物的結(jié)構(gòu)通式；
[0033] 圖2. (E)-2-(4-(4-苯甲酰氧基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亞 基）丙二腈的1H-NMR譜圖；
[0034] 圖3. (E)-2-(4-(4-苯甲酰氧基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (5H)-亞 基）丙二腈的13c-nmr譜圖；
[0035] 圖4. (E)-2-(4-(4-苯甲酰氧基苯乙烯基）-3-氰基-5, 5-二甲基呋喃-2 (