二化螟羧酸酯酶及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二化螟羧酸酯酶和編碼二化螟羧酸酯酶的基因，以及二化螟羧酸酯酶的制備方法和應(yīng)用。該二化螟羧酸酯酶氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，二化螟羧酸酯酶基因如SEQ?ID?No.1所示，本發(fā)明從二化螟4齡幼蟲中克隆到二化螟羧酸酯酶基因，再通過Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)快速產(chǎn)生重組病毒，并在昆蟲細(xì)胞中成功獲得高表達(dá)量和高活性的二化螟羧酸酯酶。本發(fā)明所述二化螟羧酸酯酶不僅可應(yīng)用于農(nóng)藥的檢測(cè)，還可應(yīng)用于農(nóng)藥的降解，解決了目前昆蟲乙酰膽堿酯酶種類缺乏的問題，提供了一種新的農(nóng)藥檢測(cè)途徑。
【專利說明】二化螟羧酸酯酶及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種二化螟羧酸酯酶及其編碼基因、制 備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)藥是人類主動(dòng)大量投放到環(huán)境中的一類具有生物毒性的化學(xué)物質(zhì)。目前，我國 農(nóng)藥過量使用的問題十分嚴(yán)重，大量施用的農(nóng)藥僅約1 %能發(fā)揮藥效，其余大多殘留于土 壤、飄浮于大氣中或通過徑流進(jìn)入水域，嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境和人類食品安全，進(jìn)而損害人類 健康。我國農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留污染十分普遍且相當(dāng)嚴(yán)重，而且我國人群因農(nóng)藥及其殘留污 染而引起的急慢性中毒現(xiàn)象較為普遍。此外，長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥還會(huì)導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗 藥性，使得防效降低或喪失。害蟲抗藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致用藥量和防治成本增加，并趨向于更高 毒性農(nóng)藥使用，進(jìn)而又加重環(huán)境污染，呈現(xiàn)惡性循環(huán)。害蟲抗藥性的形成還使得農(nóng)藥使用期 限大為縮減，這對(duì)新農(nóng)藥創(chuàng)制提出了更高的要求。盡管因不合理使用農(nóng)藥而引發(fā)一系列的 生態(tài)環(huán)境和人類健康等問題，但鑒于有害生物易爆發(fā)成災(zāi)的特點(diǎn)，化學(xué)農(nóng)藥在當(dāng)前乃至今 后的應(yīng)急防治體系中仍將占據(jù)中心地位。所以，加強(qiáng)農(nóng)藥污染監(jiān)測(cè)和控制是全世界各國關(guān) 注的重點(diǎn)問題。
[0003] 目前，常用的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法 和快速檢測(cè)法如膽堿酯酶抑制法及其基礎(chǔ)上發(fā)展形成的酶生物感應(yīng)器等。薄層色譜準(zhǔn)確度 不高；氣相色譜和液相色譜靈敏度好，準(zhǔn)確度高，但需要的儀器設(shè)備投入大，操作復(fù)雜，檢測(cè) 成本高，也不便于現(xiàn)場檢測(cè)。以昆蟲乙酰膽堿酯酶為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)法已應(yīng)用于農(nóng)藥的殘 留檢測(cè)中，昆蟲乙酰膽堿酯酶是一種催化乙酰膽堿分解的水解酶，具有能被〇Ps和CBs類農(nóng) 藥強(qiáng)烈抑制的特性。乙酰膽堿酯酶通過與〇Ps和CBs類農(nóng)藥結(jié)合，來檢測(cè)農(nóng)藥的殘留量，但 是該類檢測(cè)手段常會(huì)受到乙酰膽堿酯酶種類缺乏、以及靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性問題的影 響，最終造成商業(yè)化應(yīng)用受到限制。因此，如何能夠找到穩(wěn)定、高質(zhì)量的酶源解決是上述問 題的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種高表達(dá)量和高活性的二化螟羧酸酯酶。
[0005] -種二化螟羧酸酯酶，具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種編碼所述二化螟羧酸酯酶的基因。
[0007] 優(yōu)選的，所述的基因的堿基序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供了 一種包含所述基因的重組載體和轉(zhuǎn)化子。
[0009] 本發(fā)明又提供了一種所述二化螟羧酸酯酶的制備方法，包括：
[0010] (1)將二化螟羧酸酯酶基因亞克隆到轉(zhuǎn)移載體的多克隆位點(diǎn)中，獲得重組轉(zhuǎn)移載 體；
[0011] (2)將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，提取 重組桿狀病毒穿梭載體；
[0012] (3)用重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并分離獲得重組桿狀 病毒；
[0013] (4)將重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，并培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的昆蟲細(xì)胞，分離、純化二化螟 羧酸酯酶。
[0014] 所述轉(zhuǎn)移載體為pFastBac-HTB。該供體質(zhì)粒含有mini_Tn7轉(zhuǎn)座子可在大腸桿菌 DHlOBac中將該質(zhì)粒中含有二化螟羧酸酯酶基因的表達(dá)框移至桿狀病毒穿梭載體Bacmid 中，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌內(nèi)重組病毒的構(gòu)建。
[0015] 所述宿主細(xì)胞為昆蟲Τη細(xì)胞、Sf細(xì)胞和Bm細(xì)胞中的一種。
[0016] 本發(fā)明還提供了所述二化螟羧酸酯酶在農(nóng)藥檢測(cè)或降解上的應(yīng)用。
[0017] 具體的，所述農(nóng)藥為有機(jī)磷、氨基甲酸酯或擬除蟲菊酯殺蟲劑。
[0018] 具體的，所述農(nóng)藥為氯氰菊酯。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0020] 本發(fā)明從二化螟4齡幼蟲中克隆到二化螟羧酸酯酶基因，再通過Bac-to-Bac桿狀 病毒表達(dá)系統(tǒng)快速產(chǎn)生重組病毒，并在昆蟲細(xì)胞中成功獲得高表達(dá)量和高活性的二化螟羧 酸酯酶。
[0021] 本發(fā)明所述二化螟羧酸酯酶不僅可應(yīng)用于農(nóng)藥的檢測(cè)，還可應(yīng)用于農(nóng)藥的降解， 解決了目前昆蟲乙酰膽堿酯酶種類缺乏的問題，提供了一種新的農(nóng)藥檢測(cè)途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是重組轉(zhuǎn)移載體PCR鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0023] 圖2是純化后二化螟羧酸酯酶的SDS-PAGE電泳圖和Western印跡圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明中的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac-HTB、大腸桿菌DHlOBac菌株、 CELLFECTIN、昆蟲High Five細(xì)胞、Sf9細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900II SFM和Expres s Five SFM 以及 Trizol 試劑均為 Life Technologies(Invitrogen)公司產(chǎn)品。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] 使用Trizol試劑從二化螟4齡幼蟲中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)合成cDNA ;設(shè) 計(jì)含有酶切位點(diǎn)的特異性引物，采用高保真DNA聚合酶，以合成的cDNA為模板擴(kuò)增獲得2 端帶有酶切位點(diǎn)的開放閱讀框完整的二化螟羧酸酯酶基因，BamHI和Xhol雙酶切后，連接 至經(jīng)相同酶切的轉(zhuǎn)移載體pFastBac-HTB中。
[0027] 引物序列如下：
[0028] F_CsC0E026-BamHI ：5/ -CGGGATCCATGTTCGAATATTTG-3;；
[0029] R_CsC0E026-XhoI :5^ -CCGCTCGAGTTATTTCTTTATTGT-3'。
[0030] 二化螟羧酸酯酶基因 CsC0E026的堿基序列如SEQ ID No. 1所示。
[0031] 將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，并在含有50 μ g/mL卡那霉 素、7yg/mL慶大霉素、10yg/mL 四環(huán)素、100yg/mL X-gal 和 20yg/mL IPTG 的 LB 平板上， 37°C條件下培養(yǎng)24-48h，挑選白色菌落，37°C振蕩培養(yǎng)過夜后，抽提獲得重組病毒穿梭載體 Bacmid〇
[0032] 將重組病毒穿梭載體Bacmid用于轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。在6孔組織培養(yǎng)板中接種 2ml9X10 5Sf9 細(xì)胞/ 孔，27°C 貼壁 2h。5yL重組Bacmid(約 lyg)和 6yL CELLFECTIN 分 別用SF900II SFM稀釋成lOOyL，室溫置45min。細(xì)胞用2mL SF900II SFM培養(yǎng)基淋洗1 次；轉(zhuǎn)染混合液中補(bǔ)加〇. 8mLSF900II SFM培養(yǎng)基，滴加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)板孔中，27°C培 育7h，換為2mL含抗生素（100 μ g/mL氨芐青霉素和100 μ g/mL鏈霉素）的SF900IISFM培 養(yǎng)基，27°C培育72h，收集孔板中含重組桿狀病毒的培養(yǎng)液，1000rpm/min離心5min以去除 細(xì)胞及較大的碎片，收集上清即得到重組桿狀病毒。
[0033] 將重組桿狀病毒大量感染High Five細(xì)胞，觀察到細(xì)胞感染跡象時(shí)，收集細(xì)胞。將 細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后離心取上清，將上清液利用Ni-NTA柱分離純化獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并通 過SDS-PAGE以及Western blot分析純蛋白純度。結(jié)果在67kD處有條帶并且純度達(dá)到了 90 %以上，表明了重組二化螟羧酸酯酶表達(dá)成功。
[0034] 采用酶標(biāo)儀，以4-硝基苯基乙酸酯（pNPA，美國Sigma公司）為底物測(cè)定羧酸 酯酶活性。測(cè)定方法如下：在96孔板的加樣孔中依次加入199 μ L0. lmol/L磷酸緩沖液 (ρΗ7· 4)和10 μ L酶液；30°C保溫5min后，快速加入1 μ L10mmol/L pNPA，并置于多功能酶 標(biāo)儀Synergy HT(美國Bio-Tek公司）中，30°C下于405nm處測(cè)定15min內(nèi)的吸光值變化。 反應(yīng)重復(fù)3次。抑制中濃度的測(cè)定是將酶液與以不同濃度稀釋的殺蟲劑液混勻于酶標(biāo)板加 樣孔中，30°C下放置5min，測(cè)定羧酸酯酶的剩余活力。
[0035] 計(jì)算方法為，以羧酸酯酶活力抑制率的機(jī)率值為縱坐標(biāo)，以殺蟲劑濃度對(duì)數(shù)為橫 坐標(biāo)，得到一條直線并計(jì)算求得線性回歸方程，取機(jī)率值為5求得抑制酶50%活力時(shí)的殺 蟲劑濃度對(duì)數(shù)，反對(duì)數(shù)即得抑制中濃度（1 5〇)。測(cè)定結(jié)果為有機(jī)磷殺蟲劑（對(duì)氧磷）和氨 基甲酸酯殺蟲劑（滅多威）對(duì)表達(dá)的羧酸酯酶酶液的抑制中濃度各為〇. 11±〇. 01 μ Μ和 37. 29±5. 81μΜ。
[0036] 采用高效液相色譜法檢測(cè)二化螟羧酸酯酶重組蛋白對(duì)氯氰菊酯的活性。測(cè)定方 法如下：反應(yīng)體系總體積100 μ L，反應(yīng)溫度30°C，設(shè)置5個(gè)反應(yīng)，分別在反應(yīng)0min、30min、 60min、90min、120min時(shí)依次加入分析純乙腈，終止各反應(yīng)的進(jìn)行，分別將得到的反應(yīng)液離 心取上清，上樣高效液相色譜儀（安捷倫1200series)以測(cè)定反應(yīng)液中殘余氯氰菊酯的濃 度。每個(gè)反應(yīng)均重復(fù)3次。檢測(cè)條件：Eclipse XDB-C18(4.6X150mmX5yL)色譜柱，流動(dòng) 相為乙腈：0.5%冰醋酸，流速1111171^11，檢測(cè)波長21〇11111，柱溫3〇1：，進(jìn)樣量21^。測(cè)定結(jié)果 為表達(dá)的羧酸酯酶對(duì)氯氰菊酯的代謝活性為9· 14±1· 27μ mol/min/μ mol。
[0001] _序列 表_ SEQUENCE LISTING <丨丨1>浙江大學(xué) <120>二化螟羧酸酯酶及其編碼基因、制備方法和應(yīng)用 <130> <160> 4 ^170^ Patcntln version 3.3 <210> 1 <211> 1671 <212> DNA <21> 二化螟 <400> 1 atgttcgaat atttgttatt tettatagtt gtatctaatg tgttttgtga agatgtggcc 60 gattccagga ttgtcgaact gccagaaggc gatgtgcaag gcgcaaaata ctggaatggg 120 gatatttatg aattetaegg ggtgccatat gcgactgcgc cgaaggggcg cgacagattt 180 aagccccctc ttccagtcac accaagaaaa actattctaa cagcggacaa acaatcaatt 240 atgtgccatc aaacgtttta cacaggcgaa gatgaagaag aaatattcct gaatggtgaa 300
[0002] gaggactgtc tagtcatgaa cattctcgta cctcttattg caaacaggac gaatttagta 360 ccagtggttg tatacatcca cagcggggca ttcgccggtg gcagtgctaa tatgggcaag 42() cttcattacc tagcaagatt aggtgtagta gccattactt tcaactacag agttggagct 480 gtagggttcg cttgcctagg tacagaagaa attcccggta acgctggtct taaagatcaa 540 ttggctgcat tgaaatggat caaaaagaat attggaagat ttggtggaga ccctgataaa (00 attacgctgg ctggttacag tgttggtgca accatggcag aaatacacgc attatcaaaa (()0 cacaaacaca ctaatggatt gttcgataag ctaattttgg acagtggatc agcattaacc 720 ccttttgcaa tcaacagaca tccaataaca acagcaagga acattgcatt gtcttttggc 780 tacaatattii caggaaatat caaagattta acagagttct atttiiaacgc tacagataca S40 gatctggcaa taaaaagttt aaattttttc ttgcccaata gtacttttgg tttttctcct 900 tgtattgaaa gtatagaaaa taaccctgaa ccttatttga ctgaatcgcc attiigaaact 9( 0 ttgaagagag gagatgtaaa acaattagct attttgattg ggttcacaaa aatggaagga 1020 ctaagtagat ccggtcaatt tggtgcatgg aaaaaaaaga tgaatgaiiaa ctttgctgag 1080 gttttaccag cagatttgat cttcaaagat gacaaaacga aggaagaaat tgccaaaatg 1140 gtgaaacatt attattttaa ggatgatgaa gtaacaaatg ataagaaaaa ggaatacgtt 1200 gattatttta gtgactctat gtttaaatat ccaataataa agtcgctgat gttacaaaga 1260
[0003] gcaatcacaa caagaccgtt ttacgtttat gagttttcat acgttggtga attaagcacg 1320 ccacatcatt ttatggatac tattaaaggt gccactcata gagaccaaga ticgtatatt 1380 tgggatttct atggcttcac aaaaaatcca gaagatatgg acacaagaga tcgcatgaca 1440 tacatgtgga cggattttgt aaagtttgaa aacccgaccg catatgaaag cgacttgata 1500 gatacaaaat ggaaggtata ctcaaggcaa catccctact acctttcgat tgacagaaaa 1560 ctggaattga aggtggaccc ggttcccgaa tcttatcagt tttgggacaa gttgtacgaa 1620 aaatattact gggacccaac acatcagaag ccagacacaa taaagaaata a 1671 <210> 2 <211> 556 <212> PRT <213>二化螟 ，400> 2 Met Phc Cilu Tyr Leu Leu Phe Leu lie Val Val Ser Asn Val Phe Cys 15 10 15 Glu Asp Val Ala Asp Scr Arg lie Val Glu Leu Pro Glu Gly Asp Val 20 25 30 Gin Gly Ala Lys Tyr Tip Asn Gly Asp lie Tyr Glu Phe Tyr Gly Val 35 40 45 Pro Tyr Ala Thr Ala Pro Lys Gly Arg Asp Arg Phe Lys Pro Pro Leu 50 55 60
[0004] Pro Val Thr Pro Arg Lys Thr !lc LeuThr Ala Asp Lys Gin Scr He 65 70 75 80 Met Cys His Gin Thr Phe Tyr Thr Gly Glu Asp Glu GIu Glu lie Phc 85 90 95 Leu Asn Gly Glu Glu Asp Cys Leu Val Met Asn lie Leu Val Pro Leu 100 105 110 lie Ala Asn Arg Thr Asn Leu Val Pro Val Val Val Tyr lie His Ser 115 120 125 GlyAlaPhe Ala Gly Gly Scr Ala Asn Met Gly Lys Leu His Tyr Leu 130 135 140 Ala Arg Leu Gly Val Vd\ Ala lie Thr Phe Asn Tyr Arg Val Giy Ala 145 150 155 160 Val Gly Phc Ala Cys Leu Gly Thr Glu Glu lie Pro Gly Asn Ala Gly 165 170 175 Leu Lys Asp Gin Leu Ala Ala Leu Lys Tip lie Lys Lys Asn Me Gly 180 185 190 Arg Phe Gly Gly Asp Pro Asp Lys Me Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Val 195 200 205 Gly Ala Thr Met Ala Glu lie His Ala Leu Scr Lys His Lys His Thr 210 215 220 Asn Gly Leu Phe Asp Lys Leu lie Leu Asp Scr Gly Scr Ala Leu Thr 225 230 235 240 Pro Phe Ala Me Asn Arg His Pro lie Thr Thr Ala Arg Asn lie Ala 245 250 255 Leu Ser Phc Gly Tyr Asn lie Thr Gly Asn Me Lys Asp Leu Thr Glu 260 265 270 Phe Tyr Leu Asn Ala Thr Asp Thr Asp Leu Ala I le Lys Scr Leu Asn 275 280 285 Phe Phc Leu Pro Asn Ser Thr Phc Gly Phe Scr Pro Cys lie Glu Scr 290 295 300
[0005] lie Glu Asn Asn Pro Glu Pro Tyr Leu Thr Giu Ser Pro Leu Cilu Thr 305 310 315 320 Leu Lys Arg Gly Asp Vai Lys Gin Leu Ala He Leu lie Gly Phe Thr 325 330 335 Lys Met Glu Gly Leu Ser Arg Ser Gly Gin Phe Gly Ala Tip Lys Lys 340 345 350 Lys Met Asn Giu Asn Phe Ala Glu Val Leu Pro Ala Asp Leu lie Phe 355 360 365 Lys Asp Asp Lys Thr Lys Glu Glu lie Ala Lys Met Val Lys His Tyr 370 375 380 Tyr Phe Lys Asp Asp Glu Val Tin* Asn Asp Lys Lys Lys Glu Tyr Val 385 390 395 400 Asp Tyr Phe Scr Asp Scr Met Phe Lys Tyr Pro lie lie Lys Scr Leu 405 410 415 Met Leu Gin Arg Ala lie Thr Thr Arg Pro Phe Tyr Val Tyr Glu F^e 420 425 430 Ser Tyr Val Gly Glu Leu Ser Thr Pro His His Phe Met Asp Thr Me 435 440 445 Lys Gly Ala Thr His Arg Asp Gin Asp Ser Tyr Me Tip Asp Phe Tyr 450 455 460 Gly Phe Thr Lys Asn Pro Glu Asp Met Asp Thr Arg Asp Arg Met Thr 465 470 475 480 Tyr Met Tip Thr Asp Phe Val Lys Phe Glu Asn Pro Thr Ala Tyr Glu 485 490 495 Scr Asp Leu lie Asp Thr Lys Trp Lys Val Tyr Ser Arg Gin His Pro 500 505 510 Tyr Tyr Leu Ser He Asp Arg Lys Leu Glu Leu Lys Val Asp Pro Val 515 520 525 Pro Glu Scr Tyr Gin Phe Trp Asp Lys Leu Tyr Glu Lys Tyr Tyr Trp 530 535 540
[0006] Asp Pro Thr His G!n Lys lJro Asp Thr lie Lys Lys 545 550 555 <210 3 <211〉 23 <212> DNA <213>人:丨:合成序列 <400〉 3 cgggatccat gttcgaatat ttg 23 <210〉 4 <211〉 24 <212〉DNA <213>人工合成序列 <400〉 4 ccectceaet tatttcttta ttixt 24
【權(quán)利要求】
1. 一種二化螟羧酸酯酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述二化螟羧酸酯酶的基因。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，堿基序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 一種包含權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體或轉(zhuǎn)化子。
5. -種如權(quán)利要求1所述二化螟羧酸酯酶的制備方法，其特征在于，包括： (1) 將二化螟羧酸酯酶基因克隆到轉(zhuǎn)移載體的多克隆位點(diǎn)中，獲得重組轉(zhuǎn)移載體； (2) 將重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，提取重組 桿狀病毒穿梭載體； (3) 用重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)后分離獲得重組桿狀病毒； (4) 將重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)后分離得到二化螟羧酸酯酶。
6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)移載體為pFastBac-HTB。
7. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為昆蟲Τη細(xì)胞、Sf細(xì)胞 或Bm細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求1所述二化螟羧酸酯酶在農(nóng)藥殘留檢測(cè)或降解中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述農(nóng)藥為有機(jī)磷、氨基甲酸酯或擬除蟲菊 醋殺蟲劑。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述農(nóng)藥為氯氰菊酯。
【文檔編號(hào)】C12N9/18GK104087566SQ201410314237
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】姚洪渭, 巨青松, 葉恭銀 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)