專利名稱：一種脂蛋白脂酶基因有效shRNA的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂蛋白脂酶基因有效shRNA的篩選方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾是通過雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的遺傳干涉現(xiàn)象，它能夠特異、有效地降解 mRNA，從而引起基因的沉默。自2001年《Nature》雜志上首次報(bào)道在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過 siRNA成功誘導(dǎo)了靶基因的特異性表達(dá)沉默后，RNA干擾技術(shù)就開始作為一項(xiàng)特異性基因 沉默工具在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上廣泛應(yīng)用。2003年Rubinson等報(bào)道用病毒系統(tǒng)在原代培養(yǎng)的 細(xì)胞、干細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因小鼠上都取得了 RNA干擾成功，更大大擴(kuò)展了這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍。 目前，RNAi已發(fā)展成為調(diào)控生物基因表達(dá)的遺傳學(xué)工具，廣泛應(yīng)用于功能依賴性遺傳篩選、 基因功能研究等后基因組計(jì)劃研究中，并有望成為潛在的基因治療工具。調(diào)控脂質(zhì)代謝的酶有很多種，其中脂蛋白脂酶是關(guān)鍵酶之一。脂蛋白脂酶 (Lipoprotein Lipase,LPL,EC 3. 1. 1.34)是由脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、乳腺細(xì)胞 和巨噬細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的一種?；视退饷福瑥V泛分布于脂肪、肌肉、心臟、 肺、乳腺、腦、胎盤和腎臟等組織，其中在脂肪組織和骨骼肌中含量較高，但是在肝臟不表 達(dá)。LPL合成后在肝素作用下釋放進(jìn)入血液循環(huán)，在毛細(xì)血管內(nèi)皮的腔表面與載脂蛋白結(jié)合 發(fā)揮作用，能催化水解極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)中的甘油三酯(TG)，生成小 分子量的脂肪酸和單酰甘油，以供各種組織貯存和利用。在動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用RNA干擾技術(shù)的另一關(guān)鍵在于有效siRNA序列的篩選。但是截 至目前，篩選有效的RNAi的序列繼而構(gòu)建其腺病毒載體，尚屬空白。因此，現(xiàn)有技術(shù)存在缺陷，需要改進(jìn)完善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種脂蛋白脂酶基因有 效shRNA的篩選方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟A1 編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片段的設(shè) 計(jì)、合成；根據(jù)GenBank公布的西農(nóng)薩能羊LPL序列，設(shè)計(jì)三條LPL_siRNA及1條陰性對照 序列，在siRNA基礎(chǔ)上，將19bp的寡核苷酸以正反向組合，中間添加GAGTACTG的發(fā)夾環(huán)序 列間隔，使單鏈DNA寡核苷酸內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對單鏈DNA寡核苷酸兩端分別帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，其中正義鏈的3’端添加TTTTTT終止信號(hào)，得到shRNA的正、反義鏈模 板；A2 :pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體的構(gòu)建A21 單鏈DNA寡核苷酸退火反應(yīng)生成 雙鏈；將合成的單鏈DNA寡核苷酸序列用滅菌無離子水溶解成濃度為200 u M的溶液，然后 進(jìn)行退火反應(yīng)，退火條件是95°C X4分鐘，取出置室溫逐漸冷卻，即獲得濃度為50 yM的雙 鏈寡核苷酸序列，分別標(biāo)記為ds435、ds876、dsll50 ；再分別取少量稀釋成濃度為5nM的工作濃度，A22 構(gòu)建穿梭載體；用BamH I及Xho I雙酶切pENTR/CMV_GFP/TO載體并切膠回 收，然后將所述ds435、所述ds876和所述dsll50分別與pENTR/CMV_GFP/TO載體酶切回收 產(chǎn)物連接反應(yīng)，反應(yīng)條件為4°C連接過夜，得到連接產(chǎn)物；A23 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化；取lOy L所 述連接產(chǎn)物加入100 U L感受態(tài)DH5 a細(xì)菌，冰浴30分鐘，42°C熱激90秒，置冰浴12分鐘， 加入600 uL LB培養(yǎng)液，37°C溫和震蕩培養(yǎng)45分鐘，將細(xì)菌涂布于含50 u g/mL卡那霉素的 瓊脂平板上，置于37°C溫箱孵育；A24 篩選穿梭載體克??；A3 :pDsRedl-Cl-LPL載體的構(gòu)建A31 構(gòu)建pDsRedl-Cl-LPL克隆載體；將回收的 目的基因片段與PGM-T載體連接，16°C恒溫過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5a菌株， 涂布于含氨芐青霉素和X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)平皿中，于37°C培養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落 搖菌，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR，反應(yīng)結(jié)束后取10 yL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將陽 性克隆菌液利用堿裂解法抽提質(zhì)粒，然后用Xho I和Sal I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切反 應(yīng)體系如下10XH Buffer, 2. 0u L ；Xho 1,0. 7u L ；Sal 1,0. 7 u L ；pGM-T-LPL, 10. 0 u L ； ddH20,6.6uL ；總體積20. Oil L ；37°C水浴反應(yīng)過夜，取全部反應(yīng)液在瓊脂糖凝膠上電 泳，回收帶有設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的目的基因片段；A32 構(gòu)建pDsRedl-Cl-LPL表達(dá)載體；A4 :shRNA有效序列的篩選A41 去內(nèi)毒素質(zhì)粒提?。籄42 細(xì)胞的復(fù)蘇；A43細(xì)胞 傳代培養(yǎng)A44 細(xì)胞轉(zhuǎn)染。所述的方法，所述連接反應(yīng)體系為如下印￡^^/^6，2111^(18 oligos,5nM,luL ； 5X退火緩沖液，4ii L ；T4DNA連接酶，1 u L ；不含DNase/Rnase的水，12u L ；總體積20. Oil L所述的方法，所述步驟A24具體執(zhí)行以下操作(1)穿梭載體克隆的質(zhì)粒酶切鑒 定ds oligos的黏性末端與試劑盒提供的線性載體pENTR/TO的黏性末端互補(bǔ)，經(jīng)連接反 應(yīng)后，形成環(huán)形質(zhì)粒；于卡那霉素瓊脂平板上挑取單克隆菌落，轉(zhuǎn)種于4mL的含50 y g/mL卡 那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，取菌液2mL提取質(zhì)粒，大小符合的再進(jìn)行 Sea I及EcoR V雙酶切鑒定，產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察；(2)穿梭載體克隆的測 序鑒定取(1)中雙酶切鑒定正確的單克隆菌液，送測序公司以ABI 377型DNA自動(dòng)熒光序 列分析儀進(jìn)行序列測定，引物為測序引物U6或M13。所述的方法，所述步驟A32具體執(zhí)行以下操作(1)配制pDsRedl-Cl酶切反應(yīng)體 系并進(jìn)行37°C水浴反應(yīng)過夜；(2)酶切反應(yīng)結(jié)束后，取全部反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，回收pDsRedl-Cl載體酶切后的線性化片段；(3)將載體片段與目的基因片段連接，16°C 反應(yīng)過夜；(4)將pDsRedl-Cl-LPL轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含卡那霉素的 平皿，37°C孵育過夜，挑取單菌落搖菌，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR鑒定，然后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒 定。所述的方法，所述酶切反應(yīng)體系為10 XH Buffer，2. Oil L;Xho I,0.7uL;Sal I， 0. 7u L ；pDsRedl-Cl-LPL,5. Ou L ；ddH20,11. 6u L ；總體積 20. Ou L0所述的方法，所述步驟A41具體執(zhí)行以下操作(1)柱平衡向吸附柱中加入 500iiL的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm、13400Xg離心1分鐘，倒掉收集管 中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中， 12000rpm, 13400 Xg離心1分鐘，吸除上清液；(3)向留有菌體沉淀的離心管中加入500 u L 已加入RNa seA的溶液P1，使用渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀；(4)向離心管中加入 500 u L溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解；(5)向離心管中加入700 u L溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm、13400 X g離心10 分鐘，在離心管底部形成沉淀，收集上清液；(6)將(5)中收集的上清液分次加入過濾柱，過 濾柱放入收集管中，12000rpm、13400 X g離心2分鐘，將離心后收集管中得到的溶液分次加 入吸附柱中；(7) 12000rpm、13400 Xg離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集 管中；(8)向吸附柱中加入500 ill去蛋白液，12000rpm、13400 Xg離心1分鐘，倒掉收集管 中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(9)按照3倍體積向漂洗液中加入無水乙醇，向吸附柱 中加入700 y L所述漂洗液，12000rpm、13400Xg離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附 柱放入收集管中；(10)向吸附柱中加入500iiL漂洗液，12000rpm、13400Xg離心1分鐘， 倒掉收集管中的廢液；(11)將吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm、13400Xg離心2分 鐘，將吸附柱中殘余的漂洗液去除；(12)將吸附柱置于一干凈的離心管中，向吸附膜的中 間部位懸空滴加100-300 u L洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，12000rpm, 13400 X g離心1分鐘 后將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。所述的方法，所述步驟A42具體執(zhí)行以下操作(1)從液氮罐中取出1支凍存的 HEK293細(xì)胞，立即放入38°C水浴鍋中，至細(xì)胞完全融化；(2)將凍存管內(nèi)容物轉(zhuǎn)入10mL離 心管中，加入4mL含10% FBS的DMEM，洗脫凍存時(shí)加入的DMS0 ； (3) 1400rpm,離心8分鐘， 棄掉上清液；(4)加入2mL含10% FBS的DMEM，吹勻，轉(zhuǎn)移入塑料培養(yǎng)瓶中，在所述離心管 中再次加入2mL含10% FBS的DMEM，吹勻，將殘余細(xì)胞轉(zhuǎn)入所述塑料培養(yǎng)瓶中；(5)擰松培 養(yǎng)瓶瓶蓋，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述的方法，所述步驟A43具體執(zhí)行以下操作(1)將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入 lmL培養(yǎng)基清洗后吸棄，以除去血清；(2)加入lmL 0. 25%的ATV，置于鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞飽 滿后吸棄ATV ； (3)加入2mL含10% FBS的DMEM，吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分散，將細(xì)胞懸 液分裝至2-3個(gè)新培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。所述的方法，所述步驟A44具體執(zhí)行以下操作將低血清Opti-MEM培養(yǎng)液及Li pofectamine 2000于室溫條件下平衡；按2 1比例將Lipofectamine 2000及質(zhì)粒分別 加入250 u L低血清Opt i-MEM中，輕彈管壁使混勻，室溫靜置5min，將質(zhì)粒DNA/低血清 Opti-MEM混合物加入Lipofectamine 2000低血清Opti-MEM混合物中，輕彈管壁使之混勻， 室溫孵育20min ；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻、緩慢地加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕旋培養(yǎng)皿混勻液體，將 細(xì)胞放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。本發(fā)明在構(gòu)建重組腺病毒載體之前先在HEK 293細(xì)胞中驗(yàn)證所設(shè)計(jì)序列的干擾 效果，以節(jié)省時(shí)間及成本，將干擾載體及靶基因表達(dá)載體分別用綠色熒光和紅色熒光標(biāo)記， 共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光及紅色熒光的強(qiáng)度就可以判斷干 擾載體的轉(zhuǎn)染效率及靶基因的干擾效率，由于采用紅光和綠光兩種不同熒光分別標(biāo)記干擾 載體及靶基因，使得干擾序列篩選過程省時(shí)高效，結(jié)果更直觀可靠，而且可以同時(shí)篩選多條 序列。


圖1為pENTR/CMV-GFP/TO-shRNA質(zhì)粒凝膠電泳分析
圖 2 為 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 酶切鑒定 圖3為pGM-T-LPL雙酶切鑒定
圖4為pDsRedl-Cl-LPL陽性轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定；圖 5 為 pDsRedl-Cl-LPL 酶切鑒定；圖6為RNA干擾序列的篩選(200 X)，其中A組、B組、C組、D組分別為shRNA_NC、 shRNA-435、shRNA-1150、shRNA-876 序列的干擾效果檢測；1 (Al、Bl、CI、Dl)、2 (A2、B2、C2、 D2)分別為pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA干擾載體與pDsRedl-Cl-LPL靶基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染 HEK 293細(xì)胞48小時(shí)后熒光顯微鏡下綠色熒光及紅色熒光表達(dá)情況；3 (A3、B3、C3、D3)為 對照組，即單獨(dú)轉(zhuǎn)染pDsRedl-Cl-LPL靶基因表達(dá)載體48小時(shí)后熒光顯微鏡下紅色熒光表 達(dá)情況。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。第一步編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)、合成；根據(jù)GenBank公布的西農(nóng)薩能羊LPL序列，利用在線s iRNA選擇程序(http:// jura. wi. mit. edu/bioc/siRNAext/home. php)設(shè)計(jì)三條LPL-siRNA及 1 條陰性對照序列，即 siRNA-435 :GGCGGATGAATTTAACTAT(SEQID NO 1) ；siRNA-876 :CCGGTGCAATTCCAAAGAA(SEQ ID NO 2) ；siRNA-1150 :CCTGAAGTCTCCACAAATA(SEQ ID NO 3)；陰性對照 siRNA-NC ACTACCGTTGTTATAGGTG (SEQ ID NO :4)。在siRNA基礎(chǔ)上，將19bp的寡核苷酸以正反向組合， 中間添加GAGTACTG(含Sea I酶切位點(diǎn)，以便載體構(gòu)建中進(jìn)行鑒定)的發(fā)夾環(huán)序列間隔，使 寡核苷酸內(nèi)部可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對寡核苷酸兩端分別帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，其 中正義鏈的3’端添加TTTTTT終止信號(hào)，即得到shRNA的正、反義鏈模板，見表1 :表1LPL特異的編碼shRNA的寡核苷酸序列 2. 1單鏈寡核苷酸退火反應(yīng)生成雙鏈；先將合成的單鏈寡核苷酸序列用滅菌無離子水溶解成濃度為200i!M的溶液，然 后進(jìn)行退火反應(yīng)，退火反應(yīng)體系為退火條件是95°C X4min，取出置室溫逐漸冷卻，即獲 得濃度為50 ii M的雙鏈寡核苷酸序列(dsoligos)，分別標(biāo)記為:ds435、ds876、dsll50。再 分別取少量稀釋成濃度為5nM的工作濃度，為進(jìn)行連接反應(yīng)準(zhǔn)備，其余置-20°C保存。200 u M 正義鏈5u L200 u M 反義鏈5u L10 X退火緩沖液2iiL不含 DNase/Rnase 的水 8u L_總體積20. Oil L2. 2連接反應(yīng)_構(gòu)建穿梭載體用BamH I及Xho I雙酶切pENTR/CMV_GFP/TO載體并切膠回收，然后將退火產(chǎn)物 濃度為5nM的ds435、ds876、dsll50分別與pENTR/CMV_GFP/U6載體酶切回收產(chǎn)物連接，連
接反應(yīng)體系為如下pENTR/U62 u Lds oligos(5nM)1 u L5 X退火緩沖液4iiLT4DNA 連接酶1 P L不含 DNase/Rnase 的水12 uL_總體積20. Ou L反應(yīng)條件為4°C連接過夜，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化或置-20°C保存。2. 3連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化取10 ii L連接產(chǎn)物加入100 u L感受態(tài)DH5 a細(xì)菌，冰浴30分鐘，42°C熱激90秒， 快速置冰浴1-2分鐘，加入600 yL LB培養(yǎng)液，37°C溫和震蕩培養(yǎng)45分鐘。將細(xì)菌涂布于 含50 y g/mL卡那霉素的瓊脂平板上，置于37°C溫箱孵育。2. 4篩選穿梭載體克隆(1)穿梭載體克隆的質(zhì)粒酶切鑒定ds oligos的黏性末端與試劑盒提供的線性載體pENTR/TO的黏性末端互補(bǔ)，經(jīng)連 接反應(yīng)后，形成環(huán)形質(zhì)粒。于卡那霉素瓊脂平板上挑取單克隆菌落，轉(zhuǎn)種于4mL的含50 y g/ mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，取菌液2mL提取質(zhì)粒，大小符合的再
9進(jìn)行Sea I及EcoR V雙酶切鑒定，產(chǎn)物以1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察。(2)穿梭載體克隆的測序鑒定取雙酶切鑒定正確的單克隆菌液，送南京金思瑞生物技術(shù)有限公司以ABI 377型 DNA自動(dòng)熒光序列分析儀進(jìn)行序列測定，引物為測序引物U6 (或M13)。第三步PDsRedl-Cl-LPL載體的構(gòu)建3. 1 構(gòu)建 pDsRedl-Cl-LPL 克隆載體將回收的目的基因片段與pGM-T載體連接，16°C保溫過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài) E. coli DH5a菌株，涂布于含氨芐青霉素和X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)平皿中，于37°C培養(yǎng)過 夜，挑取白色單菌落搖菌，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR，反應(yīng)結(jié)束后取10 y L反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳鑒定。將陽性克隆菌液利用堿裂解法抽提質(zhì)粒，然后用Xho I和Sal I內(nèi)切酶進(jìn)行 雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如下10 XH Buffer2. 0 u LXho I0. 7u LSal I0. 7u LpGEM-T-LL10. 0 u LddH206. 6 u L_Total20.0 u L37°C水浴反應(yīng)過夜，取全部反應(yīng)液在瓊脂糖凝膠上電泳，回收帶有設(shè)計(jì)酶切位 點(diǎn)的目的基因片段。3. 2 構(gòu)建 pDsRedl-Cl-LPL 表達(dá)載體由于目的基因片段兩端帶有Xho I與Sal I內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將pDsRedl-Cl進(jìn)行 同樣的雙酶切反應(yīng)，回收載體片段并與基因片段連接。(1)配制pDsRedl-Cl酶切反應(yīng)體系并進(jìn)行37°C水浴反應(yīng)過夜；10XH Buffer2. 0 u LXho I0. 7u LSal I0. 7u LpDsRedl-Cl5. 0 u LddH2011. 6u L_總體積20.0iiL(2)酶切反應(yīng)結(jié)束后，取全部反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收pDsRedl-Cl載 體酶切后的線性化片段；(3)將載體片段與目的基因片段連接，16°C反應(yīng)過夜；(4)將pDsRedl-Cl-LPL轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含卡那霉素的平 皿，37°C孵育過夜，挑取單菌落搖菌，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR鑒定，然后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒 定，酶切反應(yīng)體系如上所述。 第四步shRNA有效序列的篩選； 4. 1 挑取 pDsRedl-Cl-LPL 陽性單克隆及 4 個(gè) pENTR/CMV_GFP/U6_shRNA 干擾載體(包括陰性對照)分別接種于4mL LB培養(yǎng)基中(10iig/mL kan)，37°C、200rpm搖菌過夜， 按1 50比例轉(zhuǎn)搖至10mL LB培養(yǎng)基中，37°C、230rpm搖菌16h，提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒。具體 操作步驟如下溶液P1在使用前先加入RNaseA，混勻，置于2_8°C保存，第一次使用前應(yīng)按照試劑 瓶標(biāo)簽的說明先在漂洗液中加入無水乙醇。(1)柱平衡步驟向吸附柱中加入500 PL的平衡液，吸附柱放入收集管中， 12000rpm(13400 Xg)離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，盡量 使用當(dāng)天處理過的柱子。(2)取5-15mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12000rpm(13400Xg)離心lmin，盡 量吸除上清；優(yōu)選的，菌液較多時(shí)可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中，菌體 量以能夠充分裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會(huì)降低質(zhì)粒的提取效率；(3)溶液P1中加入RNaseA，向留有菌體沉淀的離心管中加入500 y L溶液P1，使用 渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀；注意務(wù)必徹底懸浮細(xì)菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取 量和純度偏低；(4)向離心管中加入500 u L溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次使菌體充分裂解。需 要指出的是注意，上述步驟中要溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免污染基因組DNA ；此時(shí)菌 液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞；如果未變得清亮，可能由 于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量；(5)向離心管中加入700 iiL溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí) 會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm(13400Xg)離心lOmin，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。需要 注意P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀；如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離 心后取上清；(6)將上一步收集的上清液分次加入過濾柱，過濾柱放入收集管中， 12000rpm(13400Xg)離心2min，小心地將離心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中， 吸附柱放入收集管中，另外，如果過濾柱中有殘余的液體說明步驟(5)吸取的上清中雜質(zhì) 過多，可以延長離心的時(shí)間；如果離心后收集管底部有少量的沉淀，盡量地吸取上清；(7) 12000rpm(13400Xg)離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管 中；(8)向吸附柱中加入500iil去蛋白液，12，000rpm(13400Xg)離心lmin，倒掉收集
管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(9)向吸附柱中加入700 y L漂洗液，漂洗液使用前應(yīng)按照3倍體積加入無水乙醇， 12000rpm (13400 Xg)離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；優(yōu)選的，加 入漂洗液后，室溫靜置2-5min，可更好地去除雜質(zhì)；(10)向吸附柱中加入500iiL漂洗液，12000rpm(13400Xg)離心lmin，倒掉收集管 中的廢液；(11)將吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm(13400Xg)離心2min，目的是將 吸附柱中殘余的漂洗液去除。優(yōu)選的，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、 PCR等)實(shí)驗(yàn)，為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，將吸附柱開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(12)將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 100-300 iiL洗脫緩沖液，室溫放置2min，12000rpm (13400 Xg)離心lmin后將質(zhì)粒溶液收集 到離心管中；優(yōu)選的，為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中， 重復(fù)步驟(12)；洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響；若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值 在7. 0-8. 5范圍內(nèi)，pH值低于7. 0會(huì)降低洗脫效率；洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于100y L，體積 過小影響回收效率，且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20°C，防止降解。4. 2細(xì)胞的復(fù)蘇；(1)從液氮罐中取出1支凍存的HEK293細(xì)胞，立即放入38°C水浴鍋中，至細(xì)胞完 全融化為止；(2)將凍存管內(nèi)容物轉(zhuǎn)入10mL離心管中，加入4mL含10% FBS的DMEM，洗脫凍存 時(shí)加入的DMS0 ；(3) 1200rpm,離心 lOmin，棄掉上清；(4)加入2. 5mL含10% FBS的DMEM，吹勻，轉(zhuǎn)移入是塑料培養(yǎng)瓶中，在離心管中再 次加入2. 5mL含10% FBS的DMEM，吹勻，將殘余細(xì)胞轉(zhuǎn)入同一塑料培養(yǎng)瓶中；(5)擰松培養(yǎng)瓶瓶蓋，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4. 3細(xì)胞傳代培養(yǎng)(1)將培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入lmL培養(yǎng)基清洗后吸棄，以除去血清；(2)加入lmL 0. 25%的ATV，置于鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞飽滿后吸棄ATV ；(3)加入2mL含10% FBS的DMEM，吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分散，將細(xì)胞懸液分 裝至2-3個(gè)新培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4. 4細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，接種生長狀況良好的293細(xì)胞于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù) 大約5 X 105個(gè)；次日，待細(xì)胞生長至90 %融合度時(shí)將構(gòu)建好的4個(gè)pENTR/CMV-GFP/ U6-shRNA干擾載體分別與含目標(biāo)基因的pDsRedl-Cl-LPL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空 白對照、單獨(dú)轉(zhuǎn)染僅含目標(biāo)基因質(zhì)粒的對照，整個(gè)篩選重復(fù)進(jìn)行3次；轉(zhuǎn)染體系為pENTR/ CMV-GFP/U6-shRNA 質(zhì)粒 3 ii g，pDsRedl-Cl-LPL 質(zhì)粒 1 ii g，轉(zhuǎn)染過程參照 Invitrogen 公司 的Lipofectamine 2000試劑使用說明書；轉(zhuǎn)染48h后，在熒光顯微鏡下觀察熒光的表達(dá)情 況。轉(zhuǎn)染過程如下將低血清Opti-MEM培養(yǎng)液及Lipofectamine 2000于室溫 條件下平衡；10 P L的Lipofectamine2000及5 y g質(zhì)粒(按2 1比例，即2 y L Lipofectamine2000 g質(zhì)粒DNA)分別加入250 u L低血清Opti-MEM中，輕彈管壁使混 勻，室溫靜置5min，將質(zhì)粒DNA/低血清Opti-MEM混合物加入Lipofectamine2000低血清 Opti-MEM混合物中，輕彈管壁使之混勻，室溫孵育20min ；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻、緩慢地加入 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕旋培養(yǎng)皿混勻液體，將細(xì)胞放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育；轉(zhuǎn)染后6-8h更換 新鮮培養(yǎng)液。第五步結(jié)果驗(yàn)證；5. lpENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 載體的構(gòu)建；退火后得到的shRNA-435、shRNA-876, shRNA-1150 及 shRNA_NC 雙鏈寡核苷酸與pENTR/CMV-GFP/TO載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂平板、挑單克隆、抽提質(zhì)粒后，結(jié)果見圖1 ；經(jīng) 過Sea I及EcoR V雙酶切后出現(xiàn)2個(gè)片段，大小與預(yù)期結(jié)果相吻合，見圖2;測序結(jié)果表 明 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-435、pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA_876、pENTR/CMV-GFP/U6_s hRNA-1150、pENTR/CMV-GFP/U6-s hRNA-NC載體中插入的序列與所設(shè)計(jì)的序列完全一致，證 明載體構(gòu)建成功。5. 2pDsRedl-Cl_LPL 載體的構(gòu)建；5. 2. lpGEM-T-LPL陽性轉(zhuǎn)化子的菌液PCR篩選與雙酶切鑒定；利用本實(shí)驗(yàn)室保存的LPL基因的菌液，利用LPLF1和LPLR1引物進(jìn)行菌液PCR擴(kuò) 增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)1437bp的目的基因片段，對陽性克隆提取質(zhì)粒后，利用Sal I和Xho I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切分析，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，見圖3，獲得1437bp的目的基因 片段，回收目的片段并將其與pDsRedl-Cl載體連接。5. 2. 2pDsRedl-Cl-LPL陽性轉(zhuǎn)化子的菌落PCR篩選與雙酶切鑒定；連接至pDsRedl-Cl載體上的LPL基因，利用pDsRedLPLFl和pDsRedLPLRl引物進(jìn) 行菌落PCR擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)1437bp的目的基因片段，結(jié)果見圖4 ；提取 質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切分析，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，獲得目的基因片段，結(jié)果見圖5，表明已成 功構(gòu)建pDsRedl-Cl-LPL載體。5. 3shRNA序列的篩選；將表達(dá)干擾序列的在pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體分別與含相應(yīng)脂蛋白脂酶基 因片段的載體(pDsRedl-Cl-LPL)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞48h后，在熒光顯微鏡下觀察到各組中 綠色熒光蛋白表達(dá)量基本相同，但與陰性對照相比pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-435、pENTR/ CMV-GFP/U6-shRNA-1150轉(zhuǎn)染組紅色熒光蛋白表達(dá)量有所降低，其中pENTR/CMV_GFP/ U6-shRNA-876轉(zhuǎn)染組降低最為明顯；pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA_NC組與不轉(zhuǎn)染干擾載體的 對照組基本相同，見圖6 ；試驗(yàn)中紅色熒光蛋白與脂蛋白脂酶基因部分功能域形成融合蛋 白，因此紅色熒光蛋白表達(dá)量降低說明設(shè)計(jì)的干擾序列對脂蛋白脂酶基因具有干擾效果。應(yīng)當(dāng)理解的是，本說明書就具體操作步驟為例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，而對本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬 于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種脂蛋白脂酶基因有效shRNA的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟A1編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)、合成；根據(jù)GenBank公布的西農(nóng)薩能羊LPL序列，設(shè)計(jì)三條LPL-siRNA及1條陰性對照序列，在siRNA基礎(chǔ)上，將19bp的寡核苷酸以正反向組合，中間添加GAGTACTG的發(fā)夾環(huán)序列間隔，使單鏈DNA寡核苷酸內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，每對單鏈DNA寡核苷酸兩端分別帶有BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)，其中正義鏈的3’端添加TTTTTT終止信號(hào)，得到shRNA的正、反義鏈模板；A2pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體的構(gòu)建A21單鏈DNA寡核苷酸退火反應(yīng)生成雙鏈；將合成的單鏈DNA寡核苷酸序列用滅菌無離子水溶解成濃度為200μM的溶液，然后進(jìn)行退火反應(yīng)，退火條件是95℃×4分鐘，取出置室溫逐漸冷卻，即獲得濃度為50μM的雙鏈寡核苷酸序列，分別標(biāo)記為ds435、ds876、ds1150；再分別取少量稀釋成濃度為5nM的工作濃度，A22構(gòu)建穿梭載體；用BamH I及Xho I雙酶切pENTR/CMV-GFP/U6載體并切膠回收，然后將所述ds435、所述ds876和所述ds1150分別與pENTR/CMV-GFP/U6載體酶切回收產(chǎn)物連接反應(yīng)，反應(yīng)條件為4℃連接過夜，得到連接產(chǎn)物；A23連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化；取10μL所述連接產(chǎn)物加入100μL感受態(tài)DH5α細(xì)菌，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，置冰浴12分鐘，加入600μL LB培養(yǎng)液，37℃溫和震蕩培養(yǎng)45分鐘，將細(xì)菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的瓊脂平板上，置于37℃溫箱孵育；A24篩選穿梭載體克??；A3pDsRed1-C1-LPL載體的構(gòu)建A31構(gòu)建pDsRed1-C1-LPL克隆載體；將回收的目的基因片段與pGM-T載體連接，16℃恒溫過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α菌株，涂布于含氨芐青霉素和X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)平皿中，于37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色單菌落搖菌，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR，反應(yīng)結(jié)束后取10μL反應(yīng)液進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將陽性克隆菌液利用堿裂解法抽提質(zhì)粒，然后用Xho I和Sal I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系如下10×H Buffer，2.0μL；Xho I，0.7μL；Sal I，0.7μL；pGM-T-LPL，10.0μL；ddH2O，6.6μL；總體積20.0μL；37℃水浴反應(yīng)過夜，取全部反應(yīng)液在1％瓊脂糖凝膠上電泳，回收帶有設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)的目的基因片段；A32構(gòu)建pDsRed1-C1-LPL表達(dá)載體；A4shRNA有效序列的篩選A41去內(nèi)毒素質(zhì)粒提??；A42細(xì)胞的復(fù)蘇；A43細(xì)胞傳代培養(yǎng)A44細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述連接反應(yīng)體系為如下pENTR/TO， 2u L ;ds oligos，5nM，liiL ;5X 退火緩沖液，4iiL ;T4DNA 連接酶，liiL ；不含 DNa se/Rna se 的水，12 ii L ；總體積 20. 0 ii L
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A24具體執(zhí)行以下操作(1)穿 梭載體克隆的質(zhì)粒酶切鑒定ds oligos的黏性末端與試劑盒提供的線性載體pENTR/TO的 黏性末端互補(bǔ)，經(jīng)連接反應(yīng)后，形成環(huán)形質(zhì)粒；于卡那霉素瓊脂平板上挑取單克隆菌落，轉(zhuǎn) 種于4mL的含50 u g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，取菌液2mL提 取質(zhì)粒，大小符合的再進(jìn)行Sea I及EcoR V雙酶切鑒定，產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀 察；(2)穿梭載體克隆的測序鑒定取(1)中雙酶切鑒定正確的單克隆菌液，送測序公司以 ABI377型DNA自動(dòng)熒光序列分析儀進(jìn)行序列測定，引物為測序引物U6或M13。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A32具體執(zhí)行以下操作(1)配 制pDsRedl-Cl酶切反應(yīng)體系并進(jìn)行37°C水浴反應(yīng)過夜；(2)酶切反應(yīng)結(jié)束后，取全部反應(yīng) 液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收pDsRedl-Cl載體酶切后的線性化片段；(3)將載體片段與目的基因片段連接，16°C反應(yīng)過夜；⑷將pDsRedl-Cl-LPL轉(zhuǎn)化至E. coliDH5 a感受態(tài)細(xì) 胞，涂布含卡那霉素的平皿，37°C孵育過夜，挑取單菌落搖菌，同時(shí)進(jìn)行菌落PCR鑒定，然后 提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶切反應(yīng)體系為10XHBuffer, 2. 0u L ； Xho 1,0. 7u L ； Sal 1,0. 7u L ；pDsRedl-Cl-LPL, 5. 0 u L ； ddH20,11. 6u L ；總體積 20. Oil L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A41具體執(zhí)行以下操作(1) 柱平衡向吸附柱中加入500 u L的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm、13400Xg離 心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；(2)取5-15mL過夜培養(yǎng)的 菌液加入離心管中，12000rpm，13400Xg離心1分鐘，吸除上清液；(3)向留有菌體沉淀的 離心管中加入500 u L已加入RNaseA的溶液P1，使用渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀； ⑷向離心管中加入500 yL溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解；(5)向離 心管中加入700 y L溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀， 12000rpm、13400Xg離心10分鐘，在離心管底部形成沉淀，收集上清液；(6)將(5)中收 集的上清液分次加入過濾柱，過濾柱放入收集管中，12000rpm、13400X g離心2分鐘，將離 心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中；(7) 12000rpm、13400Xg離心1分鐘，倒掉收 集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(8)向吸附柱中加入500 ill去蛋白液，12000rpm、 13400 Xg離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(9)按照3倍體積向 漂洗液中加入無水乙醇，向吸附柱中加入700iiL所述漂洗液，12000rpm、13400Xg離心1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；(10)向吸附柱中加入500 yL漂洗液， 12000rpm、13400Xg離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液；(11)將吸附柱重新放回收集管中置 于12000rpm、13400Xg離心2分鐘，將吸附柱中殘余的漂洗液去除；(12)將吸附柱置于一 干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300 P L洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘， 12000rpm、13400Xg離心1分鐘后將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A42具體執(zhí)行以下操作(1)從 液氮罐中取出1支凍存的HEK293細(xì)胞，立即放入38°C水浴鍋中，至細(xì)胞完全融化；(2)將 凍存管內(nèi)容物轉(zhuǎn)入10mL離心管中，加入4mL含10% FBS的DMEM，洗脫凍存時(shí)加入的DMS0 ； (3) 1400rpm,離心8分鐘，棄掉上清液；(4)加入2mL含10% FBS的DMEM，吹勻，轉(zhuǎn)移入塑料 培養(yǎng)瓶中，在所述離心管中再次加入2mL含10% FBS的DMEM，吹勻，將殘余細(xì)胞轉(zhuǎn)入所述塑 料培養(yǎng)瓶中；(5)擰松培養(yǎng)瓶瓶蓋，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A43具體執(zhí)行以下操作(1)將 培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入lmL培養(yǎng)基清洗后吸棄，以除去血清；(2)加入lmL 0.25%的 ATV,置于鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞飽滿后吸棄ATV ； (3)加入2mL含10% FBS的DMEM，吹打貼壁細(xì) 胞，使細(xì)胞均勻分散，將細(xì)胞懸液分裝至2-3個(gè)新培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟A44具體執(zhí)行以下操作將 低血清Opti-MEM培養(yǎng)液及Lipofectamine 2000于室溫條件下平衡；按2 1比例將 Lipofectamine 2000及質(zhì)粒分別加入250 u L低血清Opti-MEM中，輕彈管壁使混勻，室溫靜 置5min，將質(zhì)粒DNA/低血清Opti-MEM混合物加入Lipofectamine 2000低血清Opti-MEM 混合物中，輕彈管壁使之混勻，室溫孵育20min ；將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻、緩慢地加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕旋培養(yǎng)皿混勻液體，將細(xì)胞放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂蛋白脂酶基因有效shRNA的篩選方法，其包括以下步驟A1編碼目的shRNA的單鏈DNA寡核苷酸片段的設(shè)計(jì)、合成；A2pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA載體的構(gòu)建；A3pDsRed1-C1-LPL載體的構(gòu)建；A4shRNA有效序列的篩選；由于采用紅光和綠光兩種不同熒光分別標(biāo)記干擾載體及靶基因，使得干擾序列篩選過程省時(shí)高效，結(jié)果更直觀可靠，而且可以同時(shí)篩選多條序列。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101857902SQ20101020413
公開日2010年10月13日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者孫雨婷, 滕炎玲, 王偉, 羅軍, 趙旺生 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)