脂蛋白磷脂酶a2免疫層析定量檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領域，具體涉及一種高靈敏度脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測試紙條。
【背景技術】
[0002]脂蛋白磷脂酶A2 (Lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp_PLA2)是磷醋酶A2 (phospholipase A2，PLA2)超家族中的一員，由441個氨基酸殘基組成的一種絲氨酸脂酶，相對分子質量為45.4kD。Lp-PLA2作為一種新的炎性反應標志物，在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的幾個主要階段中均起著作用。
[0003]Lp-PLA2主要由巨噬細胞和淋巴細胞產生，在早期的關于Lp_PLA2與As的研宄中因Lp_PLA2能水解致炎因子如血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)及結構相關的氧化磷脂，因此曾被認為能抑制炎性反應，甚至能抑制動脈粥樣硬化的形成，故也被稱為血小板活化因子乙酰水解酶(platelet activating factor acetylhydrolase，PAF-AH)。但是近年來的研宄已證實Lp-PLA2更大的作用在于促進動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生與發(fā)展。
[0004]目前，關于Lp-PLA2的實驗研宄及流行病學研宄已經表明，Lp_PLA2具有促進冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的作用，是一個新的AS的危險標志物，能獨立預測AS的風險，在未來的臨床決策中可能成為一個獨立的測量指標。
[0005]目前檢測脂蛋白磷脂酶A2的常用方法有:
[0006]I酶聯免疫吸附法
[0007]酶聯免疫吸附測定法，是以免疫學反應為基礎，將抗原抗體特異性結合與酶底物的高效催化產物作用相結合的一種敏感性很高的實驗技術。利用Lp-PLA2抗原性制備特異性抗體，通過免疫學方法直接測定血液中酶的蛋白質含量。
[0008]2免疫透射比濁法
[0009]免疫透射比濁法是實驗室常用檢測方法。免疫透射比濁法也是一種微量的免疫沉淀測定法。其與速率散射比濁法不同的是以測定透過溶液的光量來反映待測抗原的含量。當光線透過反應體系時，溶液中的抗原抗體免疫復合物可對光線加以吸收和反射，使透射光減少。免疫復合物越多，吸收的光線越多，透射光越少，這種變化可用吸光度表示。若抗體量固定，所測吸光度與免疫復合物的量成正比，也與待測抗原的量成正比。以一系列已知濃度的抗原標準品作對照，即可以測出受檢物含量。
[0010]生物素-親和素系統(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應放大系統。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫(yī)學各領域。將該系統應用于免疫組化，酶聯免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術中，可顯著地提高以上技術方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進行大規(guī)模流行病學調查，成為研宄免疫反應的有力工具。由于BAS檢測系統經濟快速，又無放射物質污染，不需復雜儀器，充分顯示了此系統的巨大潛力和應用的可能性。
[0011]生物素-親和素系統檢測原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎上，結合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結合常數高達1015M-1)。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學特性的一種蛋白質，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結合一個生物素，因幾乎所有用于標記的物質均可以同親和素或鏈霉親合素結合。利用生物素-親和素系統研制脂蛋白磷脂酶A2檢測試快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內容】
[0012]本實用新型的目的，在于提供一種脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側向層析和生物素-鏈霉親和素放大系統，提供高靈敏度脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩(wěn)定性，降低了非特異性結合，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0013]本實用新型解決其技術問題的解決方案是:脂蛋白磷脂酶A2免疫層析定量檢測試紙條，其包括底板，所述底板上依次設有樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標記物結合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標記物結合墊上，所述熒光標記物結合墊上固定有生物素標記的脂蛋白磷脂酶A2單克隆抗體和鏈霉親和素標記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內的硝酸纖維素膜上固定有識別脂蛋白磷脂酶A2另外一個表位的單克隆抗體構成的檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構成的質控線。
[0014]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光標記物結合墊包括層疊的第一熒光標記物結合墊和第二熒光標記物結合墊，所述第一熒光標記物結合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標記物結合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0015]作為上述技術方案的進一步改進，所述第一熒光標記物結合墊中插入樣品墊下方的一端設有定位條，所述樣品墊的下端面設有能容納定位條的定位槽。
[0016]作為上述技術方案的進一步改進，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標記物結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內，所述卡殼殼面上對應于硝酸纖維膜的位置設有觀察窗，卡殼殼面上對應于樣品墊的位置設有加樣孔。
[0017]作為上述技術方案的進一步改進，所述觀察窗為長方形孔。
[0018]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0019]作為上述技術方案的進一步改進，所述樣品墊為經表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構件。
[0020]作為上述技術方案的進一步改進，所述底板為聚苯乙烯構件或者聚乙烯構件。
[0021]作為上述技術方案的進一步改進，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0022]本實用新型與現有技術相比，具有如下優(yōu)點:
[0023](I)本實用新型將熒光蛋白作為標記物，此標記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn)定性。
[0024](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結合，有利于提高試劑盒性能。
[0025](3)利用本實用新型進行降鈣素原的檢測時間不大于10分鐘，檢測線性范圍為
0.10ng/ml?100.00ng/ml，極大地提高了檢測效率。
[0026](4)本實用新型可通過熒光免疫分析儀對結果進行判讀，可實現自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結果。
[0027](5)本使用新型卡殼設有樣品進入的加樣孔和供觀測結果的觀察窗，根據分析儀器判定結果，準確可靠。
[0028](6)本實用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0029](7)本實用新型檢測成本較低。
[0030](8)本實用新型可批量生產，適用于臨床快速診斷和現場快速診斷；易于保存，有利于基層單位推廣。
【附圖說明】
[0031]為了更清楚地說明本實用新型實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單說明。顯然，所描述的附圖只是本實用新型的一部分實施例，而不是全部實施例，本領域的技術人員在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他設計方案和附圖。
[0032]圖1是本實用新型實施例一的結構示意圖；
[0033]圖2是本實用新型實施例二的結構示意圖；
[0034]圖3是本實用新型實施例三的結構示意圖；