自然酶活性脂蛋白相關(guān)磷脂酶a2及制備過程的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂蛋白相關(guān)憐脂酶A2化ipoprotein-associatedphospholipaseA2,LP-PLA2)是 憐脂酶家族中PLA2的一種，有441個氨基酸殘基的分泌蛋白（45KDa)，W酶活性形式循環(huán)在 血液中。LP-PLA2是絲氨酸依賴的憐脂酶，其催化活性不需要巧離子。LP-PLA2酶活性區(qū) 域位于蛋白C端，S273,D296,冊51氨基酸殘基組成酶催化活性核屯、位點；189-239氨基酸殘 基形成片成結(jié)構(gòu)，參與控制酶底物的特異性，并為低密度脂蛋白（LDL)結(jié)合區(qū)域；367-370 氨基酸殘基參與高密度脂蛋白（皿L)結(jié)合。
[0003] 血液中LP-PLA2來源有兩類，一是由單核細胞、淋己細胞W及肥大細胞產(chǎn)生和分 泌到血液中；另一來源是由處于活動狀態(tài)動脈血管硬化灶中的單核細胞，吞隧細胞產(chǎn)生并 分泌到血液中，其分泌量與動脈血管硬化灶活動程度相關(guān)。血液中LP-PLA2與LDL和皿L 相關(guān)，其中80%LP-PLA2與氧化低密度脂蛋白（OX-LDL)結(jié)合，10-20%LP-PLA2與DHL結(jié)合。 LP-PLA2憐脂酶能水解憐醋sn-2位短醋酷鏈中的醋鍵，血液中LP-PLA2能水解血小板活 化因子（Platelet-activatingfactor,PAF)，短鏈憐脂和氧化憐脂等。
[0004]屯、腦血管疾病是最常見的中老年疾病，現(xiàn)在也是首位引起人類死亡原因。近些 年，隨著生活水平的提高，屯、腦血管發(fā)病率呈年輕化趨勢。研究表明，動脈硬化可累及冠 狀動脈、腦動脈及其它動脈，是冠狀動脈性屯、臟病，腦血栓和其它血栓疾病的病理基礎(chǔ)。動 脈硬化是一種慢性炎癥反應(yīng)性疾病，炎癥反應(yīng)在動脈粥樣斑塊形成的起始、發(fā)展、破裂，脫 落等過程中起著重要作用，而LP-PLA2參與在動脈硬化炎癥反應(yīng)全過程并加重炎癥反應(yīng)。 組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，活動性動脈硬化斑塊內(nèi)，斑塊壞死中屯、、易損及破裂斑塊周圍，LP-PLA2濃 度顯著升高?；顒有詣用}血管硬化灶內(nèi)LP-PLA2水解與LDL結(jié)合氧化卵憐醋（0X-PC)，成為 溶血憐脂酷膽堿（IysoPC)和氧化游離脂肪酸（OX肥PAS)。運兩個分解物是很強的炎癥因 子，有單核巨隧細胞趨化因子作用，又能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞分泌細胞粘附因子，促進單核細 胞移動到動脈血管硬化灶內(nèi)，轉(zhuǎn)化為巨隧細胞和泡沫細胞，損傷血管功能；運些聚集的巨隧 細胞和泡沫細胞產(chǎn)生更多的LP-PLA2,加重動脈硬化灶部位發(fā)炎，增生，導(dǎo)致血小板在此 部位積聚，脫落，形成血栓；同時，動脈血管硬化灶中的LP-PLA2大量分泌到血液中，增加 血液中LP-PLA2濃度。由此可見，LP-PLA2直接參于動脈硬化灶內(nèi)炎癥反應(yīng)過程，血液中增 高LP-PLA2濃度和酶活性代表動脈硬化灶活動程度，也能代表血栓發(fā)生的可能性。
[0005] 流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，血液中LP-PLA2濃度或酶活性增高人群，其屯、血管疾病發(fā)病 率增加。去除其它屯、血管疾病危險因素，與低濃度LP-PLA2人群相比，高濃度LP-PLA2人 群發(fā)生屯、血管疾病可能性增加2倍W上。又有研究發(fā)現(xiàn)，高血壓人群，同時血液中LP-PLA2 濃度增高，發(fā)生屯、血管疾病可能性增加7倍W上。絕經(jīng)后的婦女，伴有血液中LP-PLA2濃 度增高，發(fā)生血栓可能性增加64%。Gerber等人測定病人屯、肌梗死發(fā)生時血液中LP-PLA2 酶活性，比低LP-PLA2酶活性屯、肌梗死病人，高LP-PLA2酶活性屯、肌梗死病人死亡率增加 5. 35倍；有高LP-PLA2酶活性屯、肌梗死病人復(fù)發(fā)率增加兩倍多。運些結(jié)果表明，血液中增 高LP-PLA2酶活性和濃度能預(yù)測屯、肌梗塞和腦血栓的發(fā)生，預(yù)后，及復(fù)發(fā)，需要開發(fā)測定血 液中LP-PLA2酶活性或濃度的試劑盒。
[0006] LP-PLA2是激發(fā)動脈硬化灶內(nèi)炎癥反應(yīng)重要因子，促發(fā)血栓形成。開發(fā)LP-PLA2酶 活性抑制劑是阻斷脈硬化灶內(nèi)炎癥反應(yīng)有效途徑，能減少血栓發(fā)生。在國外，葛蘭素史克 公司研發(fā)出LP-PLA2酶活性抑制劑（Darapladib),能與LP-PLA2酶活性功能區(qū)絲氨酸殘基 作用，并有效阻斷血液中LP-PLA2酶活性，降低動脈硬化灶內(nèi)炎癥反應(yīng)，減少血栓的發(fā)生。 在國內(nèi)，需要開發(fā)LP-PLA2酶活性抑制劑，用于預(yù)防和減少血栓發(fā)生。
[0007] 在臨床檢驗中，檢測血液中LP-PLA2濃度方法主要是夾屯、酶聯(lián)免疫法，及直接測 定血液LP-PLA2酶活性方法，兩個測定方法都需要純化LP-PLA2作為標(biāo)準(zhǔn)品，此標(biāo)準(zhǔn)品要 有LP-PLA2自然酶活性和抗原性。制備出具有自然酶活性和抗原性純化LP-PLA2蛋白有 幾個途徑。一是從人體血液中大量提取自然LP-PLA2,運種方法是不可行，原因是血液來 源受限制，血液中有多種感染因子，制備過程和標(biāo)準(zhǔn)品是不安全。再用基因工程方法表達 和純化LP-PLA2標(biāo)準(zhǔn)品，用基因工程細菌表達LP-PLA2蛋白沒有酶活性，蛋白結(jié)構(gòu)與自然 LP-PLA2有很大差異，不能作為LP-PLA2標(biāo)準(zhǔn)品；用人體細胞表達LP-PLA2基因重組蛋白 符合LP-PLA2標(biāo)準(zhǔn)品的要求，但培養(yǎng)人體細胞要求條件高，產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高；而本發(fā)明 采用昆蟲細胞系統(tǒng)表達LP-PLA2,昆蟲細胞近似于人體細胞，但產(chǎn)量高，成本低，適合大量生 產(chǎn)，純化出LP-PLA2具有自然酶活性和抗原性，作為檢測LP-PLA2酶活性和濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0008] 測定血液中LP-PLA2濃度方法是雙抗體夾屯、酶聯(lián)免疫法，利用抗原和抗體特異性 結(jié)合的原理。此法簡單，易操作，得到廣泛應(yīng)用。但運種方法測定血液中LP-PLA2的含量， 間接表明血液中LP-PLA2酶活性，而動脈硬化活動狀況與血液中LP-PLA2酶活性相關(guān)，有時 LP-PLA2含量與LP-PLA2活性是不相關(guān)，如LP-PLA2基因變異人群及血液中有LP-PLA2抑 制物的人群；另外，制備測定LP-PLA2雙抗體夾屯、酶聯(lián)免疫法試劑盒需要幾種LP-PLA2單克 隆抗體，成本高；同時，雙抗體夾屯、酶聯(lián)免疫法步驟多，需要時間較長，準(zhǔn)確性差等缺點。
[0009] 直接測定血液LP-PLA2酶活性方法是利用LP-PLA2為憐脂酶，能水解氧化憐 醋sn-2位短醋酷鏈中的醋鍵，在實驗研究工作中，用合成LP-PLA2酶底物，直接測定 LP-PLA2酶活性。其方法是直接加LP-PLA2酶底物到血清/血漿中，其中LP-PLA2分解合成 反應(yīng)底物，生成顏色反應(yīng)產(chǎn)物，再測算出LP-PLA2酶活性。運種方法優(yōu)點為簡潔，快速。缺 點是血液一些成分直接影響檢測LP-PLA2酶活性法的結(jié)果，如血紅素，膽紅素，代謝產(chǎn)物， 藥物等；血液或細胞液中還有LP-PLA2類似PLA2憐脂酶存在，也能水解LP-PLA2酶底物，測 定酶活性結(jié)果一部分為PLA2憐脂酶的活性，降低檢測血液LP-PLA2酶活性的特異性。
[0010] 一些植物提取物中的小分子能與LP-PLA2-C端酶活性區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，并抑制 LP-PLA2酶活性，成為LP-PLA2酶活性抑制劑，為了開發(fā)出植物中小分子LP-PLA2酶抑制劑， 需要一種檢測LP-PLA2-小分子復(fù)合物酶活性方法。
[0011] 雙抗體夾屯、酶聯(lián)免疫法是用于測定樣品中LP-PLA2含量，不能測定LP-PLA2酶活 性，不能用于篩選LP-PLA2酶活性抑制劑。用酶底物直接測定樣品中LP-PLA2酶活性方法， 可用于篩選植物提取物L(fēng)P-PLA2酶活性抑制劑，但有很大缺陷，主要是植物提取物可能降 低LP-PLA2酶活性檢測結(jié)果，不能確定運些物是干擾酶底物，還是影響LP-PLA2酶功能，不 能確定是LP-PLA2特異性抑制物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的是提供LP-PLA2-N端抗體，能特異性LP-PLA2-N端，不干擾LP-PLA2 C端酶催化結(jié)構(gòu)區(qū)域酶活性，適合進行抗體撲獲LP-PLA2酶活性測定試驗，撲獲出血液中 LP-PLA2,或LP-PLA2-小分子復(fù)合物，再特異性測定LP-PLA2酶活性的自然酶活性脂蛋白相 關(guān)憐脂酶A2及制備過程。
[0013] 本發(fā)明的步驟是： 提取THP-IRNA，合成THP-IcDNA基因庫，用PCR擴增出LP-PLA2DNA，構(gòu)建P化 1392-Flag-LP-PLA2 載體； P化1392-Flag-LP-PLA2載體與線性AcNPVDNA共轉(zhuǎn)染至IjSF9細胞，產(chǎn)生重組Flag-LP-PLA2AcNPV； 重組Flag-LP-PLA2AcNPV感染SF9細胞并表達出帶有8個氨基酸殘基短膚LP-PLA2 ; 用Anti-FlagM2affinityagarose純化出具有自然酶活性和抗原性Flag-LP-PLA2 蛋白； 構(gòu)建pVL1392-His-LP-PLA2-N載體，產(chǎn)生重組His-LP-PLA2-NAcNPV,感染SF9 細胞并 表達出帶有6個氨基酸殘基短膚LP-PLA2-N; His-SelectHFNickelaffinityGel純化出His-LP-PLA2-N端蛋白并制備成His-LP-PLA2-N端蛋白親和層析柱； Flag-LP-PLA2免疫動物產(chǎn)生LP-PLA2抗血清，用His-LP-PLA2-N端蛋白親和層析柱，分 離和純化出抗LP-PLA2-N端抗體。
[0014] 本發(fā)明P化1392-Flag-LP-PLA2載體的構(gòu)建：提取THP-I細胞RNA，用于 合成cDNA，用PCR擴增出LP-PLA2DNA，其核酸序列84-1326 ;選用昆蟲細胞表達載 體pVL1392-Flag-----9. 64化，有化Iyhe化in啟動子，在昆蟲細胞中表達外源性蛋 白；帶有部分AcNPVDNA序列，用于產(chǎn)生基因重組昆蟲病毒；此載體插入8個氨基酸殘 基--DY邸孤DK短膚DNA序列，用于表達Flag融合蛋白；用內(nèi)切酶NdeIAbaI切割 LP-PLA2DNA和pVL1392-Flag，將LP-PLA2DNA連接到pVL1392-FlagNdeI/甜al部位，構(gòu) 建成pVL1392-Flag-LP-PLA2 載體。
[001引 本發(fā)明P化1392-His-LP-PLA2-N載體構(gòu)建：P化1392-His載體插入6個組 氨基酸殘基短膚DNA序列，用于表達His融合蛋白，用內(nèi)切酶Ndel/Bglll切割 P化 1392-Flag-LP-PLA2,將獲得LP-PLA2-N端DNA連接到pVL1392-HisNdel/BamHI部位， 構(gòu)建成pVL1392-His-LP-PLA2-N載體。
[0016] 本發(fā)明His-LP-PLA-N端蛋白親和層析柱的制備：P化1392-His-LP-PLA2-N載體與 AcNPV線性DNA共轉(zhuǎn)染SF9細胞，產(chǎn)生重組化S-LP-PLA2-NAcNPV;用此病毒感染SF9細胞， 表達出His-LP-PLA2-N端蛋白，用純化His-LP-PLA2-N端蛋白進行SDS-PAGE電泳，再做銀 染法，連接His-LP-PLA2-N端蛋白到N服活化親和層析柱上，制備His-LP-PLA-N端蛋白親 和層析柱。
[0017] 本發(fā)明表達LP-PLA2-N端蛋白呈現(xiàn)32-183氨基酸殘基，N端帶有His標(biāo)記短膚， 用His-SelectHFNickelaffinityGel純化出His-LP-PLA2-N端蛋白。
[0018] 本發(fā)明提供測定LP-PLA2酶活性方法能快速，簡單，高效地從植物提取物或合成 小分子混合物中篩選出特異性LP-PLA2酶活性抑制劑。測定LP-PLA2酶活性方法具有特異 性強，應(yīng)用廣泛，檢測靈敏度高的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0019]圖 1 是DNA內(nèi)切酶切割pVL1392-Flag-LP-PLA2DNA載體； Lanel;EcoRI切割pVL1392-Flag-LP-PLA2DNA載體 Lane2巧amHI切割pVL1392-Flag-LP-PLA2 DNA載體L曰ne3 ；DNA M曰rker ; 圖2是銀染法測定LP-PLA2純度和濃度； Lanel-6; 0.1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1.Omg/mlBSA; Lane7;純化Flag-L