一種吡唑[5，6-d]并嘧啶類EGFR抑制劑及其抗腫瘤活性的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種有良好抗腫瘤活性的吡唑 [5,6-d]并嘧啶類化合物。另外，本發(fā)明還涉及含有該種化合物的藥物組合物及其在制備抗 腫瘤藥物中的用途等。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)每年因肺癌導(dǎo)致的死 亡超過100萬人；在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中長期居于首位，其中以非小 細(xì)胞肺癌（NSCLC)最為普遍，占發(fā)病總數(shù)的85%以上。目前，經(jīng)典的手術(shù)切除或放化療往往 存在術(shù)后復(fù)發(fā)率高、毒副作用大、轉(zhuǎn)移和耐藥等多種缺陷。鑒于EGFR信號途徑在誘發(fā)NSCLC 腫瘤生長和血管增生中的重要作用，EGFR已經(jīng)成為NSCLC靶向治療的重要靶點(diǎn)，其相應(yīng)的 小分子抑制劑成為各大醫(yī)藥公司爭相研發(fā)的重要領(lǐng)域。
[0003] 目前，已有近20種EGFR抑制劑藥物進(jìn)入臨床試驗階段或陸續(xù)上市。其中，被認(rèn)為 是第一代EGFR抑制劑的易瑞沙（Gefinitib)、特羅凱（Erlotinib)和我國自主研發(fā)上市的 凱美納（Icotinib，2012年上市）等已在臨床NSCLC病人治療中獲得巨大成功。但經(jīng)6~12 個月的治療后往往會發(fā)生明顯的繼發(fā)性耐藥，極大的限制了患者生存時間的延長，目前研 究認(rèn)為這種耐藥通常是由于EGFR 20號外顯子T790M錯位突變所引起。2013年，Boehringer Ingelheim公司成功開發(fā)了首個第二代EGFR抑制劑Afatinib (BIBW2992)，其主要特點(diǎn)是可 以顯著抑制EGFR??，有效逆轉(zhuǎn)T790M所引起的耐藥。但是，Afatinib同時也強(qiáng)烈抑制野生 型EGFR(EGFR WT)，阻止體內(nèi)正常組織EGFRWT激酶的磷酸化和相關(guān)信號通路的激活，從而帶 來較大的藥物毒副作用，臨床上表現(xiàn)為皮疹、嘔吐等藥物毒副反應(yīng)。因此，開發(fā)具有高特異 性EGFR??突變體抑制劑已成為研發(fā)新一代抑制劑的首要目標(biāo)。
[0004] 目前，EGFR抑制劑的構(gòu)效關(guān)系并不明朗，有的結(jié)構(gòu)差別很小的化合物，其針對 EGFR抑制的效果卻相差很大。本發(fā)明人經(jīng)過艱苦努力，令人意外地設(shè)計并合成出一種新的 吡唑[5,6-d]并嘧啶類化合物，其具有優(yōu)良的EGFR??抑制效果和選擇性，屬于第三代EGFR 抑制劑，能用于治療各種EGFR??高表達(dá)的腫瘤。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供新的EGFR抑制劑類抗腫瘤化合物及其藥物。
[0006] 具體而言，本發(fā)明提供了式（WZ00411)所示的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽：
[0007]
[0008] 化合物（WZ00411)為：
[0009] N6-(1H-吲哚-5)-N2-(4-(4-氮甲基哌嗪苯基）-1Η-吡唑[5,6-d]并嘧啶-4,6-二 胺
[0010] N4-(lH-indol-5-yl)-N6-[4-(4-methylpiperazin-1-yl) phenyl]-ΙΗ-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine-4,6-diamine
[0011] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的含吲哚的嘧啶[5,6-d]并咪唑類化合物 和/或提供其在治療或預(yù)防腫瘤（尤其是EGFR依賴性或EGFR??突變高表達(dá)類腫瘤）方 面的新用途。
[0012] 本發(fā)明的目的之一是提供一種新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶類EGFR抑制劑。
[0013] 本發(fā)明的目的之二是提供一種新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶類EGFR抑制劑的制備 方法及抗腫瘤活性。
[0014] 在本發(fā)明中，我們首先利用化學(xué)方法合成了一種新型的吡唑[5,6-d]并嘧啶類化 合物WZ00411。利用體外激酶層次上的活性篩選實驗證實了化合物WZ00411具有強(qiáng)烈的 EGFR??抑制活性，同時對EGFR "具有一定選擇性并對其他激酶抑制活性較弱，具備良好的 激酶選擇性和第三代EGFR抑制劑特點(diǎn)（詳情見實施例1)。細(xì)胞層面上實驗也證實該化合 物可以有效抑制EGFR及其下游信號p-Akt和p-Erk的磷酸化水平（詳情見實施例2)。
【附圖說明】：
[0015] 這里所列舉的化合物只是為了更好地說明本發(fā)明的化合物類別和結(jié)構(gòu)形式，并非 限制本發(fā)明。
[0016] 圖1說明合成的化合物WZ00411化學(xué)結(jié)構(gòu)；
[0017] 圖2說明激酶選擇性抑制測試；
[0018] 圖3說明化合物細(xì)胞水平上化合物的抗腫瘤活性驗證。
[0019] 圖4說明化合物在H1975細(xì)胞水平上對下游信號通路蛋白磷酸化抑制作用。
[0020] 實施例1化合物體外抑制EGFR的活性和選擇性
[0021] EGFR激酶體外活性篩選：實驗采用方法為Caliper Mobility Shift Assay，該方 法是以微流體芯片技術(shù)的迀移率檢測技術(shù)為核心的檢測平臺。實驗步驟：配置1. 25x激酶 反應(yīng)緩沖液（62. 5mmol/L HEPES，pH 7. 5 ;0· 001875% Brij-35 ;12· 5mmol/LMgC12 ;2· 5mM DTT)和激酶反應(yīng)終止液（100mmol/L HEPES，pH 7· 5 ;0· 015 % Brij-35 ;0· 2 % Coating Reagent#3);在5 μ 1的5x濃度的化合物溶液中（用DMS0溶解，用水稀釋10倍）加入10 μ 1 的2. 5χ的FGFR1激酶溶液（在1. 25χ激酶反應(yīng)緩沖液中加激酶），室溫孵育10min后再加 入10 μ 1的2. 5x底物肽溶液（在1. 25x激酶反應(yīng)緩沖液中加 FAM標(biāo)記肽和ATP)，在28°C下 反應(yīng)特定的時間后加入25 μ 1激酶反應(yīng)終止液。在Caliper上測試收集數(shù)據(jù)，對激酶活性 的抑制率=(max-conversion) / (max-min) *100。"max" 為未加化合物的 DMSO 對照，"min" 為低對照。測定IC5。時每種樣品設(shè)10個稀釋度各2個復(fù)孔，3次重復(fù)。
[0022] 激酶選擇性抑制測試：將WZ00411依照上述激酶抑制活性測定方法，測定對 VEGFR1、EGFR、TOGFR、FGFR1~2和C-Met等6種常見激酶的抑制活性，同時比較EGFRWT/ EGFR??激酶1C 5?；钚员戎?，以表征這些化合物對EGFR WT和其他激酶的選擇性。以表征該 化合物對激酶的選擇性。
[0023] 激酶實驗表明：化合物WZ00411對EGFRWT/EGFR??抑制1C 5。分別為21. 33和 1156. 62nMol。對其它常見5種激酶的抑制活性均大于5000nMol (實驗數(shù)據(jù)見圖2)，因此具 有良好的EGFR??抑制活性和EGFR WT/EGFR?°M及其他激酶選擇性。（見圖2)
[0024] 實施例2細(xì)胞水平上化合物的抗腫瘤活性驗證
[0025] 采用MTT法化合物WZ00411在細(xì)胞層面上的抗腫瘤活性，選用含EGFR??高表達(dá) 的人NSCLC細(xì)胞株〇11975)46?1^高表達(dá)的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株（A549)以及EGFR原發(fā)性 錯位突變的人肺癌細(xì)胞株（HCC827)等7種細(xì)胞進(jìn)行增殖抑制活性測試。測定時以PBS為 空白對照，EGF為陰性對照，（EGF+WZ4002)為陽性對照，（EGF+待測樣品）為實驗組，每種樣 品設(shè)6個濃度梯度，計算IC 5。值。
[0026] 活性化合物對胞內(nèi)EGFR促增殖信號通路的影響：選取化合物WZ00411，用EGF聯(lián) 合不同濃度的WZ00411分別處理含EGFR??高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞；提取細(xì)胞 總蛋白后，經(jīng)Western blotting檢測細(xì)胞內(nèi)EGF/EGFR信號通路中促增殖信號分子EGFR、 ERK和AKT磷酸化水平的變化。
[0027] 細(xì)胞實驗表明：化合物WZ00411體現(xiàn)了良好的EGFRWT/EGFR?° M選擇性。對EGFR ?°M 激酶抑制活性均達(dá)到20nMol，具有潛在的優(yōu)化前景，并且擁有比WZ4002更優(yōu)秀的激酶選 擇性，化合物WZ00411對EGFR WT/EGFR?°M選擇性為55倍（見圖3)。此外，WZ00411具有較 好的抗腫瘤增殖活性，并在1、10、100和ΙΟΟΟηΜοΙ四種濃度下均可強(qiáng)烈抑制H1975細(xì)胞中 p-EGFR，ρ-ΑΚΤ 和 p-ERK 水平（見圖 4)。
【主權(quán)項】
1. 具有下列化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物及其可藥用鹽：化合物（WZ00411)為： N6- (1H-日引噪-5) -N2- (4- (4-氮甲基贓嗦苯基）-1H-化挫[5,6-d]并喀晚-4,6-二胺護(hù)- (lH-indol-5-yl) -妒- [4- (4-methylpiperazin-1-yl) phenyl] -IH-pyrazolo [3,4-d] pyrimi dine-4,6-diamine 譜圖表征為： iHNMR 化OOMHz，DMS0-d6) δ (ppm) :12. 758(s，IH，-NH-)，11. 079(s，IH，-NH-)，9. 484(s， IH，-NH-)，8. 786(s，IH，-NH-)，8. 031 (s，IH，-NH-)，7. 629(d，J = 7. 2Hz，2H，Ar-H)， 7. 391 (d，J = 8. 4Hz，3H，Ar-H)，7.352(s，lH，Ar-H)，6. 83 (d，J = 8. 4Hz，2H，Ar-H)，6. 415 (s， IH，Ar-H)，3. 135 (s，4H，N-CH2-) ,2.730 (s，4H，N-CH2-) ,2.412 (s，3H，N-Og.ESI-MS m/z : (M+Hr，calcd for〔2化5成:440. 33。2. 權(quán)利要求上述化合物，其用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）相關(guān)的疾病。3. 用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或與腫瘤相關(guān)的疾病的藥物組合物，其包括權(quán) 利要求1所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。4. 權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其被制成片劑、膠囊、口服液、注射劑、粉劑、膏劑或 外用藥液。5. 權(quán)利要求1中所述的化合物在制備用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或與腫瘤相 關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。6. 用于治療腫瘤（如，肺癌、乳腺癌等）或與腫瘤相關(guān)的疾病的方法，其包括向患者施 用有效量的權(quán)利要求1中之任一所述的化合物。7. 權(quán)利要求3、4所述的化合物、藥物組合物、權(quán)利要求5所述的應(yīng)用或權(quán)利要求6所 述的方法，其中腫瘤或與腫瘤相關(guān)的疾病是由表皮生長因子受體巧GFR)或T790M突變體 巧GFR??)超出正常量表達(dá)和釋放而導(dǎo)致的疾病。8. 權(quán)利要求1所述的化合物、權(quán)利要求3所述的藥物組合物、權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或 權(quán)利要求7所述的方法，其中腫瘤或與腫瘤相關(guān)的疾病選自肺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、 骨肉瘤、皮膚癌、陰莖癌、膀脫癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮肌瘤、膽管癌、膜腺癌、肝癌、胃癌、 大腸癌、腎癌、鼻咽癌、食管癌、白血病、腦膜瘤、淋己瘤及其并發(fā)癥。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種EGFR抑制劑類具有抗腫瘤作用的吡唑[5，6-d]并嘧啶類化合物。另外，本發(fā)明還提供了該化合物的藥物組合物以及抗腫瘤用途等。
【IPC分類】A61P35/00, A61P35/02, C07D487/04, A61K31/519
【公開號】CN105566329
【申請?zhí)枴緾N201410635578
【發(fā)明人】張穎, 張喬喬, 葉清清, 何帆, 潘愷凌, 劉志國, 梁廣, 李校堃
【申請人】溫州醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年11月7日