具有β?木糖苷酶和β?葡萄糖苷酶雙重活性的糖基水解酶突變體及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一系列糖基水解酶LXYL?P1突變體蛋白，這些突變體蛋白具有β?木糖苷酶和/或β?葡萄糖苷酶活性，均能專一性地從7?木糖紫杉烷類化合物上水解去除木糖基，本發(fā)明涉及這些突變體的氨基酸序列以及編碼這些氨基酸序列的核苷酸序列，以及這些突變體蛋白及其產生菌的應用。
【專利說明】
具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶雙重活性的糖基水解酶突變 體及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種雙功能糖基水解酶(GH)的一系列突變 體。這些突變體的β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性較之其野生型有所提高，并且均能專 一性地從7-木糖紫杉烷類化合物上水解去除木糖基，本發(fā)明涉及這些突變體的氨基酸序列 以及編碼這些氨基酸序列的核苷酸序列，以及這些突變體蛋白及其產生菌的應用。 技術背景
[0002]糖基水解酶(glycoside hydrolases，GH;glycosidases，EC3 · 2 · 1 .X)可催化糖苷 化合物的水解反應，在食品、造紙、藥品、飼料及生物能源等領域具有廣泛的用途。根據其氨 基酸序列和結構特征進行分類，GH目前累計有100多個家族(http://www.cazy .org/)，而 GH3是上述100多個家族中最大的家族之一，已發(fā)現2400余個成員木糖苷酶（0-〇-xylosidases，EC3.2.1.37)作用于木糖苷化合物和木寡糖或木二糖的非還原末端，釋放出 β-D-木糖和相應的配基^已發(fā)現的β-木糖苷酶屬于糖基水解酶的3、30、39、43、52和54家族 [Brunzelle,J.S.et al. Structure of the two-subsite beta-D-xylosidase from Selenomonas ruminantium in complex with 3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino] propane.Arch Biochem Biophys.2008,474:157-166]，而真菌來源的β-木糖苷酶目前見于 GH3、43 和 54家方矣[Knob，A·et al.β-xylosidase from filamentous fungi : an overview.World J Microb Biot ·2010,26:389_407] 葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidases， EC3.2.1.21)，則作用于纖維素、纖維二糖和葡萄糖苷化合物的非還原末端，釋放出β-D-葡 萄糖和相應的配基。已發(fā)現的β-葡萄糖苷酶屬于糖基水解酶的1、3、5、9、30、116家族 [Michlmayr,H.et al.β-Glucosidase activities of lactic acid bacteria : mechanisms, impact on fermented food and human health.FEMS Microbiol Lett. 2013，352(1): 1-10.]，而真菌來源的β-葡萄糖苷酶見于GH3家族[Tiwari，P.et al .β-Glucosidases from the fungus Trichoderma:an efficient cellulase machinery in biotechnological applications.BioMed Res Int.2013,2013:203735.doi:10.1155/ 2013/203735L有些糖基水解酶則同時具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的雙重活性，例如， 克隆自香菇(Lentinula edodes)的兩個糖基水解酶(代號LXYL-P1-1、LXYL-P1_2,兩者的氨 基酸序列一致性為97%，后者活性較前者高)不僅具有β-木糖苷酶活性，能專一性地水解去 除7-木糖紫杉烷類化合物上的木糖基(故又稱之為7-木糖紫杉烷糖基水解酶），還能水解β-葡萄糖苷，是一典型的雙功能酶[Cheng，H.L.et al .Cloning and characterization of the glycoside hydrolases that remove xylosyl group from 7-0-xylosy1-10-deacetyltaxol and its analogues.Mol Cell Proteomics.2013，12(8):2236_2248]。其 中，活性較高的LXYL-P1-2氨基酸序列及其應用已申請發(fā)明專利:朱平，程海立，趙瑞玉，程 克棣，何慧霞，孟超，朱慧新.具有β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的新的糖基水解酶及其 應用.專利號ZL 201180031238.5;PCT國際公布號W0 2011/160484 Α1(美國專利公布號US 2013/0130330 Al)〇
[0003] 本發(fā)明的申請者針對LXYL-P1-1與LXYL-P1-2中理化性質差異較大的氨基酸殘基 進行由LXYL-P1-1向LXYL-P1-2的定點及定點組合突變，發(fā)現針對特定氨基酸殘基進行突變 后，所制備得到的一些突變體的木糖苷酶和/或葡萄糖苷酶活性較之LXYL-P1-1有顯著 提高;針對LXYL-P1-2進行的定向進化研究，也獲得了β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性 顯著高于LXYL-P1-2的突變體;進一步研究發(fā)現，將野生型LXYL-P1-1和LXYL-P1-2以及上述 所有突變體的第220位亮氨酸殘基突變成甘氨酸殘基(L220G突變），獲得的所有L220G突變 體(或稱L220G突變型）的β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性顯著高于突變前的對照（第 220位氨基酸殘基為亮氨酸殘基）。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明解決的技術問題是提供一類糖基水解酶LXYL-P1 (即本發(fā)明所述的糖基水 解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2)系列突變體蛋白、編碼該突變體蛋白的核苷酸序列、含有該核 苷酸序列的重組質粒、含有該核苷酸序列或重組質粒的重組細胞，以及以上所述的突變體 蛋白、其核苷酸序列、其重組質?；蛑亟M細胞在水解去除糖苷化合物上木糖基和/或水解去 除葡萄糖基方面的應用。
[0005] 為解決本發(fā)明的技術問題，提供如下技術方案：
[0006] 本發(fā)明技術方案的第一方面是提供糖基水解酶LXYL-P1 (即本發(fā)明所述的糖基水 解酶LXYL-P1-1和LXYL-P1-2)系列突變體蛋白，所述突變體蛋白的氨基酸序列為SEQ ID Ν0 3~SEQ ID NO 13,以及上述氨基酸序列SEQ ID NO 3~SEQ ID NO 13和LXYL-P1-1的氨基 酸序列SEQ ID NO l、LXYL-Pl-2的氨基酸序列SEQ ID NO 2的L220G突變型。
[0007] 本發(fā)明技術方案的第二方面是提供編碼第一方面所述突變體蛋白的核苷酸序列， 優(yōu)選SEQ ID N0 16~SEQ ID N0 26所示的核苷酸序列，以及上述核苷酸序列SEQ ID N0 16 ~SEQ ID NO 26和Lxyl-pl-1的核苷酸序列SEQ ID NO 14、Lxyl-pl-2的核苷酸序列SEQ ID NO 15在C658T659C66°-G658G 659A66° 或 G658G659T66° 或 G658G659C66° 或 G658G659G66° 的密碼子突變型。
[0008] 本發(fā)明技術方案的第三方面是提供含有第二方面所述核苷酸序列的重組質粒。
[0009] 本發(fā)明技術方案的第四方面是提供含有第二方面所述核苷酸序列或第三方面所 述重組質粒的重組細胞。
[0010] 構成該重組細胞的宿主細胞既可以是含有Lxyl-pl-Ι和Lxyl-pl-2野生型基因的 香燕（Lent inula edodes)細胞，也可以是異源宿主細胞。適宜的宿主生物包括細菌、放線 菌、絲狀真菌、酵母菌、植物細胞、動物細胞，舉例如下：大腸埃希氏菌屬（Escherichia species)、芽胞桿菌屬(Bacillus species)、鏈霉菌屬（Streptomyces species)、酵母菌 屬（Saccharomyce species)、畢赤酵母菌屬（Pichia species)、裂殖酵母菌屬 (Schizosaccharomyce species)、曲霉屬（Aspergillus species)、木霉屬（Trichoderma species)、青霉屬（Penicillium species)、口蘑屬（Tricholoma species)、香燕屬 (Lentinula species)、傘菌屬(Agaricus species)、雙子葉植物(dicotyledon)、以及昆蟲 細胞等。優(yōu)選下列宿主：大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、變鉛青鏈霉菌 (S. lividans)、釀酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、粟 酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A. oryzae)、構巢曲 霉（A.Nidulans)、里氏木霉（T · reesei )、綠色木霉（T · Viride)，產黃青霉（Penici 11 ium chrysogenum)、口蘑（Tricholoma mongolicum)、香燕（L. edodes)、雙抱蘑燕（Agaricus bisporus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、以及草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda) Sf9細胞。
[0011]本發(fā)明技術方案的第五方面是提供本發(fā)明第一方面所述突變體蛋白、第二方面所 述核苷酸序列、第三方面所述重組質粒、第四方面所述重組細胞在水解去除糖苷化合物上 木糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的應用。
[0012]本發(fā)明還提供所述cDNA序列的應用，即將所述突變體蛋白的編碼基因（cDNA)片段 與適當表達載體連接，構建重組質粒，后者被導入合適的宿主細胞，轉化后的重組細胞，通 過其產生的重組酶(即所述的突變體蛋白）用于水解糖苷化合物底物方面的應用。
[0013] 優(yōu)選的作為底物的糖苷化合物選自含有木糖基的化合物和/或含有葡萄糖基的化 合物。其中，優(yōu)選的含有木糖基的糖苷化合物選自紫杉烷木糖苷類化合物;所述的紫杉烷木 糖苷類化合物，優(yōu)選7-木糖紫杉烷，可以是天然形成的、或是非天然產生的，如化學或生物 合成的、或半合成的。
[0014] 本發(fā)明提供所述的重組酶或含有該酶的重組細胞，在水解去除木糖基方面的應 用，包括但不限于用于7-木糖紫杉烷的生物轉化或生物催化，所述的7-木糖紫杉烷底物包 括但不限于:7_木糖紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇、7-木糖三尖杉寧堿、7-木糖-10-去 乙酰三尖杉寧堿、7-木糖紫杉醇C、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇C、7-木糖巴卡亭III和7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III;這些底物單獨、或彼此混合被催化，或與其他紫杉烷相混合被催化。 水解去除木糖基后得到的產物包括但不限于:紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙酰三尖杉寧堿、紫杉醇C、l〇-去乙酰紫杉醇C、巴卡亭III和10-去乙酰巴卡亭III。
[0015] 本發(fā)明的糖基水解酶LXYL-P1系列突變體蛋白在應用方面的技術方案優(yōu)選為:所 述的突變體蛋白在以7-木糖紫杉烷為原料制備7-羥基紫杉烷時的應用。
[0016] 其中，所述的7-木糖紫杉烷原料選自帶有木糖基的紫杉烷類的混合物，進一步優(yōu) 選的，紫杉烷類的混合物選自紅豆杉屬(Taxus)植物組織，這些紅豆杉屬植物包括:歐洲紅 豆杉（T.baccata)、短葉紅豆杉（T.brevifolia)、喜馬拉雅紅豆杉（T.wallichiana)、曼地亞 紅豆杉（T.media)、中國紅豆杉（T. chinensis)、南方紅豆杉（T · chinensis var .mairei)、云 南紅豆杉(T.yunnanensis)、以及東北紅豆杉(T.cuspidate)，或者是這些植物的細胞培養(yǎng) 物，或者是能夠產生7-木糖紫杉烷類化合物的微生物細胞培養(yǎng)物。這里所述的植物組織包 括植物的根、針葉、樹皮以及整個苗木。
[0017]發(fā)明詳述：
[0018]下面對本發(fā)明的技術方案做進一步的說明：
[0019]本發(fā)明提供的糖基水解酶LXYL-P1系列突變體蛋白，其野生型蛋白LXYL-P1 -1和 LXYL-P1-2 系由一種口蘑科（1'1'；[(3110101]1&代〇6&6)真菌香燕（1^111:;[11111&6(10(168]\195.33)產 生。所述突變體蛋白的編碼基因（cDNA)被導入宿主細胞后，所形成的突變體蛋白，可位于細 胞內或分泌到細胞外，用于轉化7-木糖紫杉烷為紫杉醇或其類似物。
[0020]本發(fā)明所述的cDNA序列，可以用來構建各種不同類型的重組表達質粒，后者可被 轉移到真菌細胞、或者被轉移到原核細胞(包括大腸桿菌、放線菌）、植物細胞和動物細胞等 宿主細胞，所述突變體基因的表達可以使這些宿主獲得將7-木糖紫杉烷水解為7-羥基紫杉 烷的能力。重組的宿主還可以用于其他含糖化合物的生物轉化。
[0021] 本發(fā)明提供了所述突變體蛋白的應用。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種紫杉醇及其類似物的生物轉化制備方法：以7-木糖紫杉烷為 原料，用上述重組細胞(如重組畢赤酵母)水解去除原料上的木糖基，得到紫杉醇或其類似 物。
[0023]本發(fā)明所述的溶解底物的溶劑，除非有明確說明，一般是指:水、甲醇、乙醇、乙酸 乙酯、丙酮、正己烷、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMS0)。
[0024] 本發(fā)明提供的方法中制備的紫杉醇或其類似物(產物），以及所用的C-7-木糖紫杉 烷原料(底物），其結構特征如通式I所示。
[0025]
[0026]
[0027] 注:Ph為苯基，Bz為苯甲?；珹c為乙?；?br>[0028] 有益技術效果
[0029] 本發(fā)明獲得的糖基水解酶LXYL-P1系列突變體基因，當被導入上述宿主細胞后，能 夠表達出β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性比突變前更高的突變體蛋白；該突變體蛋白、 或含有該突變基因的重組細胞在水解去除糖苷化合物上木糖基和/或水解去除葡萄糖基方 面比突變前發(fā)揮更高的效率，可應用于對7-木糖紫杉烷底物的生物轉化或生物催化，生成 相應的7-羥基紫杉烷，后者可被應用于紫杉醇或其類似物的半合成。
【附圖說明】
[0030] 圖1 LXYL-P1-1與LXYL-P1-2氨基酸序列差異比較·
[0031] 圖2應用PCR技術構建幾種LXYL-P1-1突變體.
[0032]圖3 LXYL-P1-2定向進化及突變體的篩選·
[0033]圖4 LXYL-P1系列突變體重組細胞催化7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇提取物的HPLC 分析.
[0034] 圖5 LXYL-P1系列突變體重組細胞催化7-木糖-10-去乙?；涂ㄍII的HPLC分 析·
[0035] 圖6應用全質粒PCR技術構建L220G突變型（以LXYL-P1-2-L220G為例）.
[0036]圖7 L220G系列突變體的單位濕重細胞酶活性時間曲線.
【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明通過下列實施例予以進一步闡明，這些實施例是僅用于說明性的，而不是 以任何方式限制本發(fā)明權利要求的范圍。
[0038] 實施例 1:LXYL-P1-1 突變體 LXYL-Plvsl ~Plvsl3 的構建
[0039] 如文獻[Mol Cell Proteomics.2013,12(8) :2236-2248]所述，β-木糖苷酶基因 (Lxyl-pl)至少有2個高度同源的核苷酸序列及相應的表達產物LXYL-P1-1(或簡稱Ρ1-1)和 1^￥1^-?1-2(或簡稱？1-2)，其氨基酸序列的一致性為97.3%，后者水解木糖苷的活性是前者 的兩倍以上。這兩個蛋白的cDNA序列(Lxyl-pl-l，L Xyl-pl-2)均包含1個長度為2412bp的開 放閱讀框架(0RF)，編碼803個氨基酸。如圖1所示，這兩個蛋白共有21個氨基酸存在差異。
[0040] 通過對LXYL-P1-1和LXYL-P1-2的差異氨基酸進行親疏水和極性差異的比較分析， 發(fā)現第3、69、72、91、192、310、318、322、327、334和368位共有11個位點的氨基酸殘基性質差 異較大。其中第3、69、192、310、318、327和334位的氨基酸在1^￥1^-?1-1中為親水的極性氨基 酸，而在LXYL-P1-2中為疏水的非極性氨基酸;而第72、91和368位則正好相反，在LXYL-P1-1 中為疏水的非極性氨基酸，在LXYL-P1-2中為親水的極性氨基酸;第322位則是在LXYL-P1-1 為酸性氨基酸，而在LXYL-P1-2中為堿性氨基酸。
[0041 ]以LXYL-P1-1的cDNA為模板，應用PCR技術對上述11個氨基酸進行定點或定點組合 突變，突變方向主要由LXYL-P1 -1向LXYL-P1 -2的突變（I368E除外），所用上、下游引物見表 1;應用PCR技術構建幾種LXYL-P1-1突變體的過程如圖2所示。
[0042] 表1.由LXYL-P1-1向LXYL-P1-2定點或定點組合突變所用引物序列
[0043]
[0044] PCR反應體系組成： 總體積：50μΙ· ddH：0 28. μL^ DM SO ! .5 ,uL 5 x Fast pfu PCR buffer ? 0 u.L,
[0045] 2.5 mM dNTP mix 4 ,uL 10 μΜ Forward primer 2 μΕ 10 μΜ Reverse primer 2 μ!> Tempiate ΟΝΛ 2 pL Fiist pfu PCR polymenise 0*5 pL
[0046] PCR擴增條件：
[0047] 95°C，5min;
[0048] 94°C，30sec;60°C，30sec;72°C，lmin;30cycles;
[0049] 72〇Ca〇min；
[0050] 4°C,^
[00511 PCR產物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0052] 重疊 PCR反應體系組成： 總體積：50 μΙ> ddH：.0 32 μL. DM SO 1.5'uL
[0053] 5 x Fast pfu PC'R buffer 10 ,uL 2.5 mM dNTP mix 4 .uL Template DN A 2 tuL Fast pfu PCR polymerase 0.5 pL
[0054] PCR 擴增條件（1):
[0055] 95°C，5min;
[0056] 94°C，30sec;45°C，30sec;72°C，lmin30sec;5cycles;
[0057] 72°C，5min;
[0058] 4°C，
[0059] 向上述PCR反應中加入基因的上、下游引物以獲得全長cDNA片段，PCR反應體系組 成： 總體積：54pL 上述PCR反應體系 5Q .uL
[0060] 10 μΜ Forward primer 2 μ￡· 10 μΜ Reverse primer 2 pL
[0061] PCR 擴增條件(2):
[0062] 95〇C,5min；
[0063] 94〇C ,30sec；60〇C ,30sec；72〇C ,lmin30sec；30cycles；
[0064] 72°C，5min;
[0065] 4°C,^；
[0066] 參考文獻[Mol Cell Proteomics. 2013,12(8) :2236-2248]方法，將擴增得到的 cDNA序列分別連接到畢赤酵母胞內表達載體pPIC3.5K上，得到相應的重組質粒pPIC3.5K-LXYL-Plvsl~pPIC3.5K-LXYL-Plvsl3,經測序驗證后，分別導入畢赤酵母GS115細胞，篩選 獲得高拷貝的轉化子GS115-3.5K-Plvsl (簡稱？1￥81)、65115-3.51(-?1￥82(簡稱？1￥82)、 GS115-3.5K-Plvs4(簡稱卩1丫84)、65115-3.51(-?1￥85(簡稱？1￥85)、65115-3.51(-?1￥86(簡稱 Plvs6)、GS115-3.5K-Plvs8(簡稱Plvs8)、GSl 15-3.5K-Plvs9(簡稱Plvs9)、GSl 15-3.5K-Plvsl〇a^*PlvslO)、GS115-3.5K-Plvslia^*Plvsll)、GS115-3.5K-Plvsl2a^$ Plvsl2)和、GS115-3.5K-Plvsl3(簡稱Plvsl3)，Plvsl~Plvsl3及其突變位點的氨基酸殘基 如表2所示。
[0067] 轉化子篩選與培養(yǎng)、外源蛋白誘導表達、β-木糖苷酶與β-葡萄糖苷酶活性測定參 照文獻[Mol Cell Proteomics·2013，12(8):2236-2248和菌物學報·2013,32(5):846-854] 方法進行，觀察到β-木糖苷酶和/或β-葡萄糖苷酶活性較之其野生型有所提高的突變體有： Plvsl、Plvs4、Plvs5、Plvs8、Plvs9、PlvslO、Plvsll、Plvsl2和Plvsl3。
[0068] 表2.LXYL-P1-1突變體及其突變位點
[0069]
[0070] 實施例2:LXYL-Pl-2定向進化突變體的獲得
[0071]以LXYL-P1-2的cDNA為模板，應用易錯PCR技術對LXYL-P1-2進行定向進化，所用方 法及條件如下： PCR反應體系：50μΕ 1 Ox buffer 5 ,uL 10 μΜ Forwnrd Primer 2 μL,
[0072] Η) μΜ Reverse Primer 2 μL. Template Γ)ΝΛ ! ng T;iq DMA polymerase 0.5 μL dATf)不丨丨 dCTf) 0.2 mM dGTP 和 dTTP 1 mM
[0073] MgC'l： 7 m VI MnCl；； 0.5 mM
[0074] 加 ddH20 補足 50yL
[0075] PCR擴增條件：
[0076] 94°C，5min;
[0077] 94〇C ,30sec；55〇C ,30sec；72〇C ,2min40sec；30cycles；
[0078] 72〇Ca〇min；
[0079] 4°C,^；
[0080] 參照文獻[中國醫(yī)藥生物技術.2013,8(4):241-246]方法，利用In-Fusion技術將 易錯PCR片段連接到載體(pPIC3.5K)上（易錯PCR片段兩端與線性化載體兩端同源區(qū)段長度 均為lOObp)，轉化畢赤酵母細胞構建突變文庫。
[0081]高酶活性突變體初篩方法:挑取在甲醇誘導平板(BMMY平板)上的單菌落于96深孔 板中，每孔加入l〇〇yL PNP-Xyl測活液，50°C反應20min，每孔加入500yL飽和Na2B4〇7溶液終 止反應，3，000r/min離心1 Omin。利用排槍每孔取200yL上清至96孔板中，測定其0D4Q5吸光值 并與野生型GS115-3.5K-LXYL-P1-2的0D4 Q5吸光值相比較，篩選吸光值顯著提高的突變體。 突變體經搖瓶培養(yǎng)復篩[培養(yǎng)方法及活性測定參照Mol Cell Proteomics. 2013,12(8): 2236-2248和菌物學報.2013,32(5):846-854方法進行]，從中得到2個活性顯著提高的突變 體P1-2-EP1(突變位點：S91D)和Ρ1-2-ΕΡ2(突變位點：TSeSEhLXYL-PU定向進化和突變體 篩選過程如圖3所示。
[0082 ]實施例3:定點(組合)突變和定向進化突變體重組蛋白的分離純化 [0083] 定點（組合）突變和定向進化突變體重組蛋白的分離純化參照文獻[Mol Cell Proteomics · 2013，12(8): 2236-2248和中國醫(yī)藥生物技術· 2014,9(5):381-384]方法進行， 純化后的蛋白已達到電泳純和HPLC級色譜純。
[0084] 實施例4:定點（組合)突變和定向進化突變體重組細胞酶活性、重組蛋白酶活性分 析
[0085] 參考文獻[Mol Cell Proteomics.2013,12(8) :2236-2248和中國醫(yī)藥生物技術 ? 2014,9(5):381-384]方法，以生色底物卩-11；[1：1'0卩1161171-0-0-?710卩5^&11081(16(?即-?(71)和 p-nitrophenyl-P-D-glucopyranoside(PNP-Glc)分別測定突變體重組蛋白的β-木糖苷酶、 β-葡萄糖苷酶活性(U/mg = nmol/min/mg);突變體重組蛋白水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇 (XDT)的最大反應速度、米氏常數、催化常數或轉換數分別以V max、Km、kcat表示，其中，1^*值 和kcat/K m比值(催化效率)與酶活性呈正相關;Km值反映出酶與底物的親和力，Km值越低親和 力越大。結果如表3~6所示。
[0086] 表3.LXYL-P1-1定點突變體蛋白β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性
[0087]
[0088] LXYL-P1-1 為對照;Plvsl ~Plvsl3 為 LXYL-P1-1 定點突變體蛋白；n = 3，*P〈0.05vs 對照，#P〈〇.〇lvs對照·
[0089]表4.LXYL-P1-1定點突變體蛋白水解XDT的β-木糖苷酶動力學參數
[0090]
[0091] LXYL-P1-1 為對照;Plvsl ~Plvsl3 為 LXYL-P1-1 定點突變體蛋白；n = 3，*P〈0.05vs 對照，#P〈〇.〇lvs對照·
[0092] 表5.LXYL-P1-2定向進化突變體蛋白β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性
[0093]
[0094] LXYL-P1-2 為對照；P1-2-EP1 和 P1-2-EP2 為 LXYL-P1-2 定向進化突變體蛋白；n = 3，*P〈0 · 05vs 對照，**P〈0 · 01 vs 對照.
[0095] 表6.LXYL-P1-2定向進化突變體蛋白水解XDT的β-木糖苷酶動力學參數
[0096]
[0097] LXYL-P1-2 為對照；Ρ1-2-ΕΡ1 和 Ρ1-2-ΕΡ2 為 LXYL-P1-2 定向進化突變體蛋白；η = 3，*Ρ〈0 · 05vs 對照，**Ρ〈0 · 01 vs 對照.
[0098] 實施例5:定點（組合）突變和定向進化突變體重組細胞水解7-木糖-10-去乙?；?紫杉醇提取物
[0099] 將突變體 PlVsl、Plvs4、Plvs5、Plvs8、Plvs9、Plvsl0、Plvsll、Plvsl2、Plvsl3、卟 2-EPUP1-2-EP2重組細胞及其野生型LXYL-P1-1和LXYL-P1-2重組細胞按干重16mg/mL的比 例加入至PH4.0的0.1M醋酸緩沖液中，與2mg/mL 7-木糖-10-去乙?；仙即继崛∥颷7-木 糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)62.1%，7-木糖-10-去乙?；馍紝帀A(XDC)12.8%，7-木糖-10-去乙?；仙即糃(XDTC) 17.0 % ]底物混勻，反應體積lmL，45 °C恒溫水浴搖床振蕩反應 24h，轉化反應后的混合物以3倍體積乙酸乙酯萃取3遍，濃縮后以300yL甲醇溶解，取1 OOyL 樣品以HPLC分析轉化率與產量。結果:底物無殘留，全部轉化為相應的產物：10-去乙?；?杉醇(DT)、10-去乙?；馍紝帀A(DC)、10-去乙酰基紫杉醇C(DTC)。以Plvsl為例，結果如 圖4所示。
[0100] 實施例6:定點突變、定點組合突變和定向進化突變體重組細胞水解7-木糖-10-去 乙?；涂ㄍII
[0101] 將突變體 Plvsl、Plvs4、Plvs5、Plvs8、Plvs9、Plvsl0、Plvsll、Plvsl2、Plvsl3、卟 2-EPUP1-2-EP2重組細胞及其野生型LXYL-P1-1和LXYL-P1-2重組細胞按干重16mg/mL的比 例加入至PH4.0的0.1M醋酸緩沖液中，與2mg/mL 7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭III(XDB)底物 混勻，反應體積lmL，45°C恒溫水浴搖床振蕩反應24h，轉化反應后的混合物以3倍體積乙酸 乙酯萃取3遍，濃縮后以300yL甲醇溶解，取100yL樣品以HPLC分析轉化率與產量。結果:底物 無殘留，全部轉化為相應的產物：1〇_去乙?；涂ㄍII(DB)。以Plvsl為例，結果如圖5所 不。
[0102] 實施例7:Leu22()4Gly22()定點突變和L220G系列突變體重組細胞的酶活性分析
[0103] 現以 LXYL-Pl-l、LXYLPl-2、Plvs4、Pl-2-EP2 為例作如下說明。
[0104] 依據有關結構生物學信息，發(fā)現位于酶活性中心附近的第220位Leu殘基可能影響 XDT等底物進入酶的活性腔，故通過定點突變將其替換為側鏈更短的Gly殘基(L220G突變）。 分別以LXYL-Pl-l、LXYL-Pl-2、Plvs4、Pl-2-EP2的cDNA為模板，應用PCR技術對第220位氨基 酸進行Leu 22Q-Gly22Q定點突變，突變體LXYL-P1-1-L220G和Plvs4-L220G所用上游引物P1-1-L220G-F為：5' AGAAAT^^TACATCGAATTCGACGGAGTTS';所用下游引物P1-1-L220G-R為：5' GAATTCGATGTAffg^ATTTCTCGATGTTTCS7。突變體LXYL-P1-2-L220G和P1-2-EP2-L220G所用上 游引物P1-2-L220G-F為：5' AGAAAlj^lTATATCGACATCGACGGAGTTS';所用下游引物P1-2-L220G-R為：5' GATGTCGATATAff^ATTTCTCGATGTTTCS'。分別以含有Lxyl-pl-1、Plvs4、Lxyl-pl-2、Pl-2-EP2的重組質粒DNA(pPIC3 · 5K-LXYL-P1-1、pPIC3 · 5K-LXYL-Plvs4、pPIC3 · 5K-1^^1^-?1-2、？？扣3.51(-1^￥1^?1-24?2)為模板，應用全質粒?〇?技術構建1^206突變體，密碼 子突變方向為 :C658T659C66()4G658G 659A66()或G658G659T66°或G 658G659C66°或G658G659G 66°，即可得到 L220G突變。以LXYL-P1-2-L220G突變體為例，如圖6所示。
[0105] PCR反應體系組成： 總體積：50 μΙ ddH20 29 pL DMSO 1.5 ,uL 5 x HF buffer 10'uL
[0106] 2.5 !hM dNTP mix 4 ,uL 10 μLν? Forward primer 2 μL^ 10 μΜ Reverse primer 2 pL Template DN/\ 1 tuL Fiist pfu PCR polymerase 0.5 tuL
[0107] PCR擴增條件：
[0108] 98〇C,30sec；
[0109] 98〇C ,10sec；60°C ,15sec；72〇C ,6min；30cycles；
[0110] 72〇Ca〇min；
[0111] 4°C,^
[0112] PCR產物以1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0113] PCR產物純化回收；用Dpn I對PCR產物酶切，酶切體系為100yL:10XNEBuffer 10μ L，100XBSA lyL，Dpn I 4yL，PCR片段5yg，加 ddH20補齊至 100yL，37°C 酶切 lh;回收11.44kb 的酶切后目的載體；轉化E . col i DMT感受態(tài)細胞，篩選陽性轉化子，分別得到突變體 pPIC3·5K-LXYL-Pl-1-L220G、pPIC3·5K-LXYL-Plvs4-L220G、pPIC3·5K-LXYL-P1-2-L220G、 pPIC3 · 5K-LXYL-P1-2-EP2-L220G 重組質粒。
[0114] 參考文獻[Mol Cell Proteomics. 2013,12(8) :2236-2248]方法，將所得重組質粒 pPIC3·5K-LXYL-Pl-1-L220G、pPIC3·5K-LXYL-Plvs4-L220G、pPIC3·5K-LXYL-P1-2-L220G、 pPIC3.5K-LXYL-P1-2-EP2-L220G，經測序驗證后，分別導入畢赤酵母GS115細胞，篩選獲得 高拷貝的轉化子 63115-3.51(-?1-1-1^206(簡稱？1-1-1^2206)、65115-3.51(-?1￥84-1^206(簡 稱Plvs4-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-L220G(簡稱P1-2-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-EP2-L220G(簡稱P1-2-EP2-L220G)。
[0115] 轉化子篩選與培養(yǎng)、外源蛋白誘導表達、β-木糖苷酶與β-葡萄糖苷酶活性測定參 照文獻[Mol Cell Proteomics·2013，12(8):2236-2248和菌物學報·2013,32(5):846-854] 方法進行，觀察到突變體GS115-3 · 5K-P1-1-L220G(簡稱P1-1-L220G)、GS115-3 · 5K-Plvs4-L220G(簡稱Plvs4-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-L220G(簡稱P1-2-L220G)、GS115-3 · 5K-P1-2-EP2-L220G(簡稱P1-2-EP2-L220G)的單位濕重細胞β-木糖苷酶活性(生色底物PNP-Xyl)和 β-葡萄糖苷酶活性(生色底物PNP-Glc)較之其突變前的對照GS115-3.5K-P1-1 (簡稱1^￥1^ ?1-1)、65115-3.51(-?1￥84(簡稱？1￥84)、65115-3.51(-?1-2(簡稱^^1^-?1-2)、65115-3.51(-P1-2-EP2 (簡稱PI -2-EP2)均有所提高。結果如圖7所示。
[0116] 將突變體？1-1-1^2206、？1￥84-1^2206、？1-2-1^2206、？1-24?2-1^2206重組細胞及其 突變前的對照63115-3.51(-?1-1(簡稱^^1^-?1-1)、65115-3.51(-?1￥84(簡稱？1￥84)、65115-3 · 5Κ-Ρ1-2(簡稱LXYL-P1-2)、GS115-3 · 5K-P1-2-EP2(簡稱P1-2-EP2)按限量的干重8mg/mL 的比例加入至PH4.0的0· 1M醋酸緩沖液中，與10mg/mL 7-木糖-10-去乙?；仙即?XDT)底 物混勻，反應體積lmL，45 °C恒溫水浴搖床振蕩反應24h，取100yL轉化反應后的混合物，以 900yL甲醇溶解，取100yL樣品以HPLC分析轉化率。結果如表7所示，上述L220G突變體水解 XDT的轉化率均較各自突變前的對照有明顯提高。
[0117] 參考文獻[Mol Cell Proteomics.2013,12(8) :2236-2248和中國醫(yī)藥生物技術 .2014,9(5) :381-384]方法，分離純化上述突變體重組蛋白，以生色底物PNP-Xyl和PNP-Glc 分別測定L220G系列突變體重組蛋白的β-木糖苷酶、β-葡萄糖苷酶活性(U/mg = nmol/min/ mg) ;L220G系列突變體重組蛋白水解7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)的最大反應速率以Vmax 表示，米氏常數以Km表示，轉換數以krat表示。表8顯示，各個突變體β-木糖苷酶和/或β-葡萄 糖苷酶的比活力均超過各自的對照。表9表明，L220G系列突變體水解XDT的k cat/Km比值基本 接近或超過其突變前對照，而它們的kcat均比各自對照有非常顯著的提高。將L220G突變引 入到表2、表5所示的其他LXYL-P1系列突變體中，亦能夠提高這些突變體β-木糖苷酶和/或 β-葡萄糖苷酶活性。
[0118] 表7. L220G系列突變體重組細胞的XDT轉化率
[0119]
[0120] η = 3，*Ρ〈0 · 05vs 對照，**Ρ〈0 · Olvs 對照·
[0121 ]表8. L220G系列突變體蛋白β-木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性
[0122]
[0123] Pl-1-L220G、Pl-2-L220G、Plvs4-L220G 和 P1-2-EP2-L220G 為 L220G 系列突變體； 1^^1^-?1-1、1^^1^-?1-2、？1￥84、？1-24?2為各自突變前對照；11 = 3，仲〈0.05￥8對照，**?〈 O.Olvs 對照.
[0124] 表9. L220G系列突變體蛋白水解XDT的β-木糖苷酶動力學參數
[0125]
[0126] Pl-1-L220G、Pl-2-L220G、Plvs4-L220G 和 P1-2-EP2-L220G 為 L220G 系列突變體； 1^^1^-?1-1、1^^1^-?1-2、？1￥84、？1-24?2為各自突變前對照；11 = 3，仲〈0.05￥8對照，**?〈 O.Olvs 對照。
【主權項】
1. 一種糖基水解酶LXYL-P1的突變體蛋白，其特征在于，所述突變體蛋白具有SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13所示的氨基酸序列；以及上述 氨基酸序列或LXYL-P1-1的氨基酸序列SEQ ID NO l、LXYL-Pl-2的氨基酸序列SEQ ID NO 2 的L220G突變型。2. 根據權利要求1的糖基水解酶LXYL-P1的突變體蛋白，其特征在于，在糖基水解酶 LXYL-P1的突變體蛋白上可進行常規(guī)修飾;或者在糖基水解酶LXYL-P1上還連接有用于檢測 或純化的標簽。3. 根據權利要求2的糖基水解酶LXYL-P1的突變體蛋白，其特征在于，所述的常規(guī)修飾 包括乙?；?、酰胺化、環(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、熒光基團修飾、聚乙二醇PEG 修飾、固定化修飾；所述的標簽包括6XHis、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、 Profinity eXact〇4. 一種編碼權利要求1所述突變體蛋白的核苷酸序列。5. 根據權利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列為SEQ ID NO 16 ~SEQ ID NO 26所示的核苷酸序列；以及SEQ ID NO 14~SEQ ID NO 26所示的核苷酸序列 另/-j-^658^659^660_^06580659^660-^^-^658^659^660_^06580659^660-^^-^658^659^660_^q658q659^660-^^- C658T659C_-G658G 659G_的密碼子突變得到的核苷酸序列。6. -種含有權利要求4-5任一所述核苷酸序列的重組質粒。7. -種含有權利要求4-5任一所述核苷酸序列或權利要求6所述重組質粒的重組細胞。8. 根據權利要求7的重組細胞，其特征在于，構成所述重組細胞的原宿主細胞可以是產 生包括SEQ ID NO 1~SEQ ID NO 2所示序列的同源產生菌，或者是異源宿主細胞。9. 根據權利要求8的重組細胞，其特征在于，所述的宿主細胞的宿主生物選自細菌、放 線菌、酵母菌、絲狀真菌、植物細胞或動物細胞。10. 根據權利要求9的重組細胞，其特征在于， 所述的細菌選自大腸埃希氏菌屬（Escherichia species)、芽胞桿菌屬（Bacillus species)； 所述的放線菌選自鏈霉菌屬（Streptomyces species); 所述的酵母菌選自畢赤酵母菌屬(Pichia species)、釀酒酵母菌屬（Saccharomyces species)和裂殖酵母菌屬（Schizosaccharomyce species); 所述的絲狀真菌選自曲霉屬（Aspergillus species)、木霉屬（Tri choderma species)、青霉屬（Penicillium species)、口蘑屬（Tricholoma species)、香燕屬 (Lentinula species)、傘菌屬（Agaricus species)； 所述的植物細胞選自雙子葉植物(dicotyledon); 所述的動物細胞選自昆蟲細胞。11. 根據權利要求10所述的重組細胞，其特征在于， 所述的大腸埃希氏菌屬(Escherichia species)選自大腸桿菌(E.coli); 所述的芽孢桿菌屬(Bacillus species)選自枯草芽孢桿菌(B. subtil is); 所述的鏈霉菌屬（Streptomyces species)選自變鉛青鏈霉菌（S. lividans); 所述的酵母菌屬（Saccharomyce species)選自釀酒酵母（Saccharomyce cerevisiae)； 所述的畢赤酵母菌屬(Pichia species)選自巴斯德畢赤酵母(P.pastoris); 所述的裂殖酵母菌屬（Schizosaccharomyce species)選自粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyce pombe)； 所述的曲霉屬(Aspergillus species)選自黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A. oryzae)、構 巢曲霉(A.Nidulans); 所述的木霉屬（Tri choderma species)選自里氏木霉（T.reesei)、綠色木霉 (T.Viride)； 所述的青霉屬(Penicillium species)選自產黃青霉(Penicillium chrysogenum); 所述的 口蘑屬（Tricholoma species)選自口蘑（Tricholoma mongolicum); 所述的香燕屬（Lentinula species)選自香^(L.edodes); 所述的傘菌屬(Agaricus species)選自雙孢蘑燕(Agaricus bisporus); 所述雙子葉植物（dicotyledon)選自擬南芥(Arabidopsis thaliana); 所述的昆蟲細胞選自草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf9細胞。12. 權利要求1-3任一所述的突變體蛋白或權利要求4-5任一項所述的核苷酸序列或權 利要求6所述的重組質?；驒嗬?-11任一所述的重組細胞在水解去除糖苷化合物上木 糖基和/或水解去除葡萄糖基方面的應用。13. 根據權利要求12的應用，其特征在于，所述的糖苷化合物包括β-木糖苷和/或β-葡 萄糖苷。14. 根據權利要求12-13任一項的應用，其特征在于，所述的β-木糖苷包括但不限于7-木糖紫杉烷，所述的7-木糖紫杉烷包括但不限于：7_木糖紫杉醇、7-木糖-10-去乙酰紫杉 醇、7-木糖三尖杉寧堿、7-木糖-10-去乙酰三尖杉寧堿、7-木糖紫杉醇C、7-木糖-10-去乙酰 紫杉醇C、7-木糖巴卡亭III和7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III;水解去除木糖基后得到的產物 包括但不限于：紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、三尖杉寧堿、10-去乙酰三尖杉寧堿、紫杉醇C、 10-去乙酰紫杉醇C、巴卡亭III和10-去乙酰巴卡亭IIL·
【文檔編號】C12N15/75GK106085987SQ201610141218
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年3月14日 公開號201610141218.8, CN 106085987 A, CN 106085987A, CN 201610141218, CN-A-106085987, CN106085987 A, CN106085987A, CN201610141218, CN201610141218.8
【發(fā)明人】朱平, 梁瀟, 王芬, 李慧仙, 陳天嬌
【申請人】中國醫(yī)學科學院藥物研究所