專利名稱：水解大豆異黃酮糖苷酶工程菌株、其構(gòu)建方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及水解大豆異黃酮糖苷酶工程菌株及其構(gòu)建方法，以及將該菌株應(yīng)用于水解大豆異黃酮糖苷的生產(chǎn)中。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，保健意識的增強(qiáng)，大豆異黃酮產(chǎn)品越來越受到人們的重視。大豆中含有的大豆異黃酮是一類重要的生理活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的生理功能。迄今為止，已知大豆中的異黃酮共有12種異構(gòu)體，其中3種為苷元的形式，9種為葡萄糖苷的形式。大豆異黃酮在大豆中含量僅有千分之五左右，而大豆異黃酮異構(gòu)體中97％-98％是以結(jié)合型大豆異黃酮糖苷形式存在，游離型的苷元形式大豆異黃酮總量的2％-3％，但是人體一般不吸收大豆異黃酮的糖苷形式。大豆異黃酮糖苷在人的消化酶(特別β-葡萄糖苷酶)作用下水解成苷元形式，才能被吸收。研究證明，大豆異黃酮的生理活性主要是大豆異黃酮苷元的活性。大豆異黃酮糖苷的水解也成為科研工作者重點(diǎn)研究現(xiàn)狀。大豆異黃酮糖苷在酸性或堿性條件下糖苷鍵可斷裂，分解為大豆異黃酮苷元和葡萄糖，但堿性條件水解所得大豆異黃酮苷元很不穩(wěn)定，容易降解。因此，目前人們多用酸水解手段制大豆異黃酮苷元。酸水解用酸主要是鹽酸。多采用較濃的鹽酸(如1-3mol·L-1)，較高的溫度(98-100℃)酸水解的效率很高，可是有很多人對于酸性條件下大豆異黃酮苷元的穩(wěn)定性表示懷疑。另外，強(qiáng)酸條件下不易進(jìn)行工業(yè)化，而且還會帶來工業(yè)污染。酶法水解糖苷便成了糖苷水解的重要手段，酶水解條件溫和，多采用弱酸性的緩沖溶液，大豆異黃酮苷元不易變性，是工業(yè)上制備富含大豆異黃酮苷元的大豆異黃酮保健食品的十分有前途的途徑。研究最多的大豆異黃酮糖苷水解酶就是β-葡萄糖苷酶，大豆自身含有的內(nèi)源β-葡萄糖苷酶水解活性不強(qiáng)，水解效率只要22％-29％，添加足量的高活性酶可使水解達(dá)到100％。事實(shí)上研究研究發(fā)現(xiàn)，只要糖苷的水解程度達(dá)到70％，就能充分利用大豆異黃酮糖苷。因?yàn)槿梭w內(nèi)有少數(shù)的消化酶能水解部分糖苷。隨著科技的發(fā)展，人們保健意識的增強(qiáng)，成本低、水解效果好、安全的水解酶成了研究的目標(biāo)。但是現(xiàn)在大多的糖苷水解酶β-葡萄糖苷酶來自于曲霉類和酵母中，雖然具有很高的水解效率，但存在安全隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是利用基因工程手段構(gòu)建一種新的工程菌株，以求既能高效水解大豆異黃酮糖苷，又能解決活性水解酶來源的安全問題。
本發(fā)明的另一目的是提供該菌株的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的又一目的是提供該菌株的用途。
上述工程菌的代表菌株大腸埃希氏菌(Escherichia coli)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCCNo.1619，保藏日2006年2月16日。
本發(fā)明所要解決的問題就是從產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌中選一株進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，然后提取該菌株β-葡萄糖苷酶的基因組DNA，并將該基因亞克隆至pET 28a(+)載體中，最后在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。
本發(fā)明的工程菌特征是，該菌株的染色體包含有效蛋白質(zhì)種類β-葡萄糖苷酶基因組DNA序列表如下1atgactgaca ttaccacggc cggctctttg gaaagtccgc gttatctgac ttacactttg61 gatggcaagg atggcaaagt agctgggatg ttcgccagct ccttgccaaa gggcgctaag121 gggaagattt ttgacaatga atactacccg aaccatgtag cgatcgattt ttaccatcac181 tacaaggaag acatcaagat gttcgcggac atgggcttta aggtattcag aacttccatt241 gcctggacgc ggattttccc aaccggtgaa gaagacaagc caaaccagga agggctggac301 ttctaccgca gagtctttga agaattgaag aagaacggga ttgaaccatt agttacgatt361 tcccactatg aagacccatt ggctttaggc gaaaagtaca acgactggca agaccgcaag421 atgattgacc tctacgttaa gtacgcgacg accttgttca aggaatacaa ggacctggtt481 aagtactggc tgaccttcaa cgaaatcaac tcatctttga tgttcttgaa gctggtgggt541 gatggcaagg tatctgatgc agattaccaa aaggcttacc aaaagctgca ccaccaattc601 gttgcttccg ctaaggcagt tgttgcaggc cacaagatca acccagactt catgatcggg661 aacatgattg ccggttctgt ttactaccca ggcactcctg atccaaagga tgctttggct721 gctcgctatg aagaagaatt gagccagctt tactgtgctg acgcgcaagc taagggtgag781 tatccaagtt ttgccaagcg cttatgggat gaacacaatg ttcatttgaa gattgaagat841 ggcgaccttg aagtcatgaa ggaaggtaaa gttgacatgt acaccttctc atactacatg901 tcaaacatgg ttaccaccca tgatgttggc gaaaaggcta agggcaactt cgctgccggc961 gctaagaacc catatcttga atactctgaa tggggctggt caactgaccc agacggcttg1021 caactgtact tggaaaagat gtatgaccgt tatggcatcc caatgatggt ggtggaaaat1081 ggtcttggtg ccgttgataa gctagaagat ggtactgttc atgacgatta ccggattgac1141 tacttgagaa agcacatcaa ggcgatggac aaggcagttg aacatggggt tgacctgcgt1201 gcctacacga cttggggctg cattgactgc gtttctgctg gaactggtca aatgtccaag1261 cggtatggct tcatctacgt tgaccgtgat gacaagggcg aaggtacgct taagcgcctg1321 cctaaggatt catactactg gtaccaaaag gttatcgctt caaacggcga tgaattataa
β-葡萄糖苷酶基因組DNA序列推導(dǎo)的酶的氨基酸序列表1MTDITTAGSLESPRYLTYTLDGKDGKVAGMFASSLPKGAKGKIFDNEYYPNHVAIDFYHH61YKEDIKMFADMGFKVFRTSIAWTRIFPTGEEDKPNQEGLDFYRRVFEELKKNGIEPLVTI121SHYEDPLALGEKYNDWQDRKMIDLYVKYATTLFKEYKDLVKYWLTFNEINSSLMFLKLGD181GKVSDADYQKAYQKLHHQFVASAKAVVAGHKINPDFMIGNMIAGSVYYPGTPDPKDALAA241RYEEELSQLYCADAQAKGEYPSFAKRLWDEHNVHLKIEDGDLEVMKEGKVDMYTFSYYMS301NMVTTHDVGEKAKGNFAAGAKNPYLEYSEWGWSTDPDGLQLYLEKMYDRYGIPMMVVENG361LGAVDKLEDGTVHDDYRIDYLRKHIKAMDKAVEHGVDLRAYTTWGCIDCVSAGTGQMSKR421YGFIYVDRDDKGEGTLKRLPKDSYYWYQKVIASNGDEL本發(fā)明提供的一種高活性水解大豆異黃酮糖苷酶工程菌株的構(gòu)建方法，采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，具有如下步驟首先是選用產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的乳酸菌；第二步是從選出的乳酸菌中擴(kuò)增bgl A基因(β-葡萄糖苷酶基因)；第三步是根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)引物；第四步從提供的乳酸菌中提取基因組DNA；第五步以基因組DNA為模板，BglA F/BglA R為引物，使用TaKaRa LA TaqTM(CodeNo.DRR002A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。再使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(Code No.DV805A)切膠回收PCR擴(kuò)增片段，命名為CTA480-I；第六步使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，將CTA480-I與pMD18-T Simple載體(Code No.D103A)連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli CompetentCells JM109(Code No.D9052)中，涂布平板過夜培養(yǎng)菌體。挑選菌落，提取質(zhì)粒后，命名CTA480-T-1、CTA480-T-2。
第七步將表達(dá)載體pET28a(+)用EcoR I/HindIII進(jìn)行雙酶切，使用TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切膠回收載體部分DNA，命名為VectorDNA；第八步將含BglA目的基因的CTA480-T-1質(zhì)粒用EcoR I/HindIII進(jìn)行雙酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切膠回收約1.4kb的DNA片段，命名為Insert DNA；第九步使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，將Vector DNA和Insert DNA連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板過夜培養(yǎng)菌體。挑選菌落，提取質(zhì)粒后，質(zhì)粒命名CTA480-P-1和CTA480-P-2；第十步將質(zhì)粒CTA480-P-1和CTA480-P-2用EcoR I/HindIII分別進(jìn)行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳，質(zhì)粒CTA480-P-2符合要求。
第十一步分別取CTA480-P-2及pET28a(+)質(zhì)粒100ng轉(zhuǎn)至100ul BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，100ul涂平板，挑取單菌落接種，在進(jìn)行主培養(yǎng)，集菌破碎，SDS-PAGE檢測；第十二步純化β-葡萄糖苷酶液，測定酶活。
經(jīng)過酶活測定，新菌株的酶活是原菌株酶活的10倍。將該菌株應(yīng)用于水解大豆異黃酮糖苷，糖苷水解率能達(dá)到80％以上，水解效果得到很大的改善。
根據(jù)上述方法所得到的工程菌，菌株在顯微鏡下呈短桿狀。
本發(fā)明選用含有β-葡萄糖苷酶的乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取出葡萄糖苷酶的基因組DNA并對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，把該基因亞克隆至T載體，最后克隆至表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到高活性水解大豆異黃酮糖苷酶工程菌株。本發(fā)明得到的工程菌酶活高，價(jià)格低，應(yīng)用于水解大豆異黃酮糖苷，水解效果得到的改善，同時(shí)菌株來源具有良好的安全性，作為工程菌株水解糖苷在功能性食品應(yīng)用中，具有廣泛的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)意義。


圖1是從乳酸菌中提取基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中的數(shù)字和字母分別代表MDNA Marker DL2,0001基因組DNA圖2是CTA480-I瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中的數(shù)字和字母分別代表MDNA Marker DL2,0001CTA480-I圖3是質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中的數(shù)字和字母分別代表1CTA480-T-1質(zhì)粒2CTA480-T-2質(zhì)粒Mλ-Hind III DNA Marker圖4是Vector DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中的數(shù)字和字母分別代表Mλ-Hind III DNA Marker1Vector DNA圖5是質(zhì)粒CTA480-T-1、CTA480-T-2的構(gòu)建過程；圖6是Insert DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中的數(shù)字和字母分別代表MDNA Marker DL2,0001Insert DNA圖7是質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中的數(shù)字和字母分別代表
Mλ-Hind III DNA Marker1CTA480-P-12CTA480-P-2圖8是質(zhì)粒CTA480-P-1和CTA480-P-2構(gòu)建過程；圖中的數(shù)字和字母分別代表圖9是質(zhì)粒CTA480-P-1和CTA480-P-2酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中的數(shù)字和字母分別代表M1λ-Hind III DNA Marker1CTA480-P-1 EcoR I/HindIII切2CTA480-P-2 EcoR I/HindIII切M2DNA Marker DL2,000圖10是目的基因可溶性表達(dá)；圖中的數(shù)字和字母分別代表M1protein MW marker(High)1pET28a(+)全細(xì)胞2pET28a(+)上清3pET28a(+)沉淀4CTA480-P-2全細(xì)胞5CTA480-P-2上清6CTA480-P-2沉淀M2protein MW marker(Low)0.1OD相當(dāng)上樣。
圖11是純化和酶活測，M1，M2 Mark標(biāo)準(zhǔn)蛋白，圖中的數(shù)字分別代表1β-葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品2表達(dá)后的經(jīng)過DEAE純化的β-葡萄糖苷酶3經(jīng)過葡聚糖G-200二次純化的β-葡萄糖苷酶圖12是40％的大豆異黃酮糖苷高效液相圖；圖13是40％的大豆異黃酮糖苷水解高效液相圖；圖14是40％的大豆異黃酮糖苷和水解高效液相重合效果圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
、特征及功效，詳細(xì)說明如后從篩選出的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶乳酸菌中擴(kuò)增bgl A基因，并將該基因亞克隆至pET 28a(+)載體(載體為pET系列)中，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。
1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)并合成如下引物BglA F5′GAATTCATGACTGACATTACCACGGC 3′ (26mer)BglA R5′AAGCTTTTACGCTTTAATTTTATAA 3′ (26mer)CTA480 T-R5′TTAGCCTTTTCGCCAACATC 3′ (20mer)BglA f1 5′TTTGGCTGCTCGCTATGAAG 3′ (20mer)BglA r1 5′CTTCATAGCGAGCAGCCAAA 3′ (20mer)BglA r2 5′AATCATCTTGCGGTCTTGCC 3′ (20mer)2.使用DNAiso(DNA提取試劑)從乳酸菌中提取基因組DNA。取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果圖1所示；3.以基因組DNA為模板，BglA F/BglA R為引物，使用TaKaRa LA TaqTM(CodeNo.DRR002A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。再使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(Code No.DV805A)切膠回收PCR擴(kuò)增片段，命名為CTA480-I。取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示；4.將CTA480-I用BglA R/BglA f1/BglA r1/BglA r2引物進(jìn)行測序。
5.使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，將CTA480-I與pMD18-T Simple載體(Code No.D103A)連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)中，涂布平板過夜培養(yǎng)菌體。
6.挑選菌落，提取質(zhì)粒后，取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下圖3所示7.選取質(zhì)粒CTA480-T-1、CTA480-T-2，構(gòu)建過程如圖5以BcaBEST Primer M13-47/BcaBEST Primer RV-M/CTA480T-R為引物進(jìn)行DNA測序，質(zhì)粒CTA480-T-1符合要求。
8.將表達(dá)載體pET28a(+)用EcoR I/HindIII進(jìn)行雙酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切膠回收載體部分DNA，命名為Vector DNA。取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示9.將含BglA目的基因的CTA480-T-1質(zhì)粒用EcoR I/HindIII進(jìn)行雙酶切，使用TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切膠回收約1.4kb的DNA片段，命名為Insert DNA。取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6所示10.使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，將VectorDNA和Insert DNA連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板過夜培養(yǎng)菌體。
11.挑選菌落，提取質(zhì)粒后，取1μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果圖7所示12.將質(zhì)粒CTA480-P-1和CTA480-P-2(構(gòu)建過程如圖8)用EcoR I/HindIII分別進(jìn)行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖9所示；
13.分別取CTA480-P-2及pET28a(+)質(zhì)粒100ng轉(zhuǎn)至100ul BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，100ul涂平板。
將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取4-6個(gè)白色單菌落接種含卡那酶素50ug/ml的LB培養(yǎng)液(具體成分1g胰蛋白胨、1g氯化鈉、0.5g酵母浸出粉，加入100ml蒸餾水，PH＝7.2)，37℃過夜震蕩培養(yǎng)；將活化的種子菌以5％-8％的比例接種于LB培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600為0.6-0.8)加IPTG至終濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)2-4小時(shí)，6000-8000r/min離心10-15min，收集菌體。取樣加入1×SDS上樣緩沖液，按照常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE檢測。目的基因可溶性表達(dá)如圖10，檢測結(jié)果如下

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體中有大量的蛋白存在，說明菌株構(gòu)建成功。
14.進(jìn)行純化和酶活測定經(jīng)過酶活測定新構(gòu)建的菌株的酶活為34U，是原菌株酶活的10倍，酶活檢測方法如下a.采用染料木苷為底物的酶活測定用染料木苷為底物，染料木素為產(chǎn)物的相對酶活力測定方法取0.1ml的底物溶液(用0.02mol/L，pH5.0HAVc-NaAc緩沖液將染料木苷配成濃度為15mg/ml)，加入0.1ml的粗酶液，混勻，40℃下反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后，加入2倍體積的乙酸乙酯萃取1h，萃取取物10ul作薄層層析(TLC)。薄層層析板在使用前需在110℃活化30-60min，展開劑為氯仿∶丁酮∶甲醇∶水(10∶7∶1∶1)，展開約6cm，揮干溶劑，用雙波長薄層掃描儀掃描，根據(jù)斑點(diǎn)面積的積分值計(jì)算酶活力。酶活力單位的定義是在上述測定條件下，每小時(shí)釋放1nmol染料木素的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。
b.以pNPG為底物的酶活測定取0.4ml 1mM的pNPG(用0.02mol/L，Ph5.0的醋酸緩沖液配制)，于40℃下預(yù)熱5min，加入0.1ml的酶液，反應(yīng)30min，向反應(yīng)液加入2.5ml 1mol/L的NaCO3溶液，于405nm波長下測OD值。酶活力定義為在上述條件下，每小時(shí)水解底物所產(chǎn)生1umol對硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活力單位。
c.以人參皂苷Rd為底物的酶活力測定取0.1ml的底物溶液(用0.02mol/L，pH5.0 HAc-NaAc緩沖液將Rd配成濃度10mg/ml)，加入0.1ml的酶液，混勻，40℃下反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間后，向反應(yīng)體系中加入2倍體積的水飽和正丁醇萃取1h，取萃取相10ul作薄層層析(TLC)。薄層層析板在使用前需在110℃活化30-60分鐘，展開劑為氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5)，展開約6cm，揮干溶劑，噴灑10％硫酸加熱顯色。用雙波長薄層掃描儀掃描，根據(jù)斑點(diǎn)面積的積分值計(jì)算酶活力。酶活力單位定義是在上述測定條件下，每小時(shí)釋放1nmol人參皂苷產(chǎn)物的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位。
d.以水楊素為底物的酶活測定取1.0ml 0.05mol/L pH5.0醋酸緩沖液配制的1.0％水楊素，加入1.0ml已純化的酶液，50℃反應(yīng)30min，加入2.5mlDNS試劑后100℃水浴5min，冷卻到室溫后用去離子水定容到5.0ml，測定OD530，以每毫升酶溶液，在上述條件下30min內(nèi)酶解水楊素產(chǎn)生1mg葡萄糖為一個(gè)酶活力單位。
水解糖苷效果驗(yàn)證如圖11所示提取大豆異黃酮產(chǎn)品，含量大約為40％。進(jìn)行酶法水解實(shí)驗(yàn)將酶液和底物溶液按照1∶1體積混合，是底物濃度為10mg/ml，混勻，50℃水浴搖床反應(yīng)1.5h，然后用2倍體積的乙酸己脂萃取，萃取物濃縮蒸干，用HPLC檢測。酶解效果見圖12、13、14。
水解糖苷結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮糖苷在沒有水解以前，糖苷含量占總糖苷的90％以上，甘元的含量很少，但是在水解以后苷元的含量占總糖苷的80％以上，達(dá)到的對糖苷的水解要求。
權(quán)利要求
1.一種水解大豆異黃酮糖苷工程菌，其特征在于菌株大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的保藏編號CGMCCNo.1619。
2.如權(quán)利要求1所述的一種水解大豆異黃酮糖苷工程菌，其特征在于該菌株的染色體含有有效蛋白質(zhì)種類β-葡萄糖苷酶基因組DNA序列表如下1 atgactgaca ttaccacggc cggctctttg gaaagtccgc gttatctgac ttacactttg61 gatggcaagg atggcaaagt agctgggatg ttcgccagct ccttgccaaa gggcgctaag121 gggaagattt ttgacaatga atactacccg aaccatgtag cgatcgattt ttaccatcac181 tacaaggaag acatcaagat gttcgcggac atgggcttta aggtattcag aacttccatt241 gcctggacgc ggattttccc aaccggtgaa gaagacaagc caaaccagga agggctggac301 ttctaccgca gagtctttga agaattgaag aagaacggga ttgaaccatt agttacgatt361 tcccactatg aagacccatt ggctttaggc gaaaagtaca acgactggca agaccgcaag421 atgattgacc tctacgttaa gtacgcgacg accttgttca aggaatacaa ggacctggtt481 aagtactggc tgaccttcaa cgaaatcaac tcatctttga tgttcttgaa gctggtgggt541 gatggcaagg tatctgatgc agattaccaa aaggcttacc aaaagctgca ccaccaattc601 gttgcttccg ctaaggcagt tgttgcaggc cacaagatca acccagactt catgatcggg661 aacatgattg ccggttctgt ttactaccca ggcactcctg atccaaagga tgctttggct721 gctcgctatg aagaagaatt gagccagctt tactgtgctg acgcgcaagc taagggtgag781 tatccaagtt ttgccaagcg cttatgggat gaacacaatg ttcatttgaa gattgaagat841 ggcgaccttg aagtcatgaa ggaaggtaaa gttgacatgt acaccttctc atactacatg901 tcaaacatgg ttaccaccca tgatgttggc gaaaaggcta agggcaactt cgctgccggc961 gctaagaacc catatcttga atactctgaa tggggctggt caactgaccc agacggcttg1021 caactgtact tggaaaagat gtatgaccgt tatggcatcc caatgatggt ggtggaaaat1081 ggtcttggtg ccgttgataa gctagaagat ggtactgttc atgacgatta ccggattgac1141 tacttgagaa agcacatcaa ggcgatggac aaggcagttg aacatggggt tgacctgcgt1201 gcctacacga cttggggctg cattgactgc gtttctgctg gaactggtca aatgtccaag1261 cggtatggct tcatctacgt tgaccgtgat gacaagggcg aaggtacgct taagcgcctg1321 cctaaggatt catactactg gtaccaaaag gttatcgctt caaacggcga tgaattataa。
3.權(quán)利要求1所述的工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括如下步驟提取該菌株β-葡萄糖苷酶的基因組DNA，并將該基因作為目的基因，通過PCR擴(kuò)增后亞克隆至T載體之中，最后在克隆到大腸桿菌表達(dá)載體之中，獲得目的菌株。
4.權(quán)利要求1所述的工程菌株的用途，其特征在于將該菌株用于水解大豆異黃酮糖苷。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及水解大豆異黃酮糖苷酶工程菌株及其構(gòu)建方法，以及將該菌株應(yīng)用于水解大豆異黃酮糖苷的生產(chǎn)中。本發(fā)明選用含有β－葡萄糖苷酶的乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取出葡萄糖苷酶的基因組DNA并對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，把該基因亞克隆至T載體，最后克隆至表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到高活性水解大豆異黃酮糖苷酶工程菌株。本發(fā)明得到的工程菌酶活性高，價(jià)格低，應(yīng)用于水解大豆異黃酮糖苷，水解效果得到改善，同時(shí)菌株來源具有良好的安全性，作為工程菌株水解糖苷在功能性食品應(yīng)用中，具有廣泛的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)意義。
文檔編號C12P17/06GK1944634SQ20061004599
公開日2007年4月11日 申請日期2006年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日
發(fā)明者劉長江, 李長彪, 張春紅, 趙秀紅, 孟憲文, 高榮海 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)