一種新型耐熱糖苷水解酶MtCel1及其編碼序列和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程，具體地說是一種以嗜熱毀絲菌Myceliophthora thermophila的DUF4360超家族基因MtCell表達的耐熱糖苷水解酶MtCell及其編碼序列 和應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 糖苷水解酶（英語：Glycosidehydrolases，又稱糖苷酶）是一種專門水解配糖鍵 (glycosidicbond)，并產(chǎn)生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這 類蛋白質(zhì)在人類的產(chǎn)業(yè)上也有所應(yīng)用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質(zhì)能降解成可 用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。
[0003] 嗜熱毀絲菌Myceliophthorathermophila是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。 該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的纖維素酶和糖苷 水解酶。
[0004] 嗜熱毀絲菌產(chǎn)生的耐熱糖苷水解酶MtCell屬于DUF4360超家族蛋白，具有很強的 纖維素酶活性，但之前從未發(fā)現(xiàn)DUF4360超家族具有水解活性的任何報道。MtCell對羧甲 基纖維素的水解活力高達18. 6U/mg，對微晶纖維素的水解活力為4. 44U/mg。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明從嗜熱毀絲菌Myceliophthorathermophila獲得耐熱糖苷水解酶基因的 cDNA序列全長，命名為MtCel1，基因cDNA全長636bp，編碼211個氨基酸。MtCel1具有信號 肽序列（l_16aaMRSLVNLLLLAGAAAA)及一個N糖基化位點和5個0糖基化位點。將MtCell 編碼的氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。
[0006] 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒載體pPIC9K/MtCel1，利用電轉(zhuǎn)儀進行電擊轉(zhuǎn)化Pichia pastorisGS115,在MD和麗培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，G418篩選多拷貝 轉(zhuǎn)化子，然后進行甲醇誘導(dǎo)表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-MT-Cell。該工程菌株接種于含 BMGY培養(yǎng)基中，在28°C200rpm/min搖床培養(yǎng)6d后，糖苷水解酶的表達量為4. 42mg/ml，分 子量為73. 8KDa，酶活力為18. 6U/mg，MtCell在60°C下是穩(wěn)定的，處理60min后仍有92% 以上的酶活性；70°C處理60min后仍保持65%的活性；80°C處理60min后保持39%的活性； 90°C處理60min后保持10%。
[0007] 耐熱糖苷水解酶MtCell對長鏈纖維素具有很強的水解能力，其對羧甲基纖維素 的水解活力高達18. 6U/mg，對微晶纖維素的水解活力為4. 44U/mg。并且MtCell有很好的 熱穩(wěn)定性，在70°C的處理lh條件下仍可以保持65%的活性，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。 (四）
【附圖說明】：
[0008] 圖1耐熱糖苷水解酶MtCel1的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1 :低分子量蛋白標準
[0010] 泳道2 :純化的耐熱糖苷水解酶MtCel1
[0011] 圖2A:耐熱糖苷水解酶MtCel1的最適溫度
[0012] 圖2B:耐熱糖苷水解酶MtCel1的熱穩(wěn)定性測定
[0013] 圖3耐熱糖苷水解酶MtCel1的最適pH
[0014] 圖4耐熱糖苷水解酶MtCel1產(chǎn)物的TLC分析
[0015] 泳道1 :標準寡糖（DP2-DP7)
[0016] 泳道2 :水解羧甲基產(chǎn)物 (五）【具體實施方式】
[0017] 實施例1 :嗜熱毀絲菌Myceliophthorathermophila的分離鑒定
[0018] (1)標本采集：從堆肥中采集。
[0019] (2)分離培養(yǎng)：將采集標本取0. 5克放置在PDA平板上50°C培養(yǎng)3天后，進行分離 純化。操作步驟參考CooneyandEmerson(1964)文獻。
[0020] (3)鑒定：參考CooneyandEmerson(1964)和LaTouche(1950)文獻。
[0021] 實施例2 :耐熱糖苷水解酶基因MtCel1的克隆
[0022] (1)嗜熱毀絲菌Myceliophthorathermophila總RNA的提?。簠⒄誘rizol試劑 盒說明。
[0023] (?cDNA第一條鏈的合成：按照Takara公司的TaKaRaRNAPCRkit(AMV)Ver3· 0 試劑盒說明書進行：取1~2μg總RNA，加RNaseFreeddH20至9· 5μL，將RNA樣品在75°C 變性5miη，立即在冰浴中冷卻5miη，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成 分：10mmol/LdNTPMixture2yL，10XRTBuffer(Mg2+)2yL，25mmol/LMgCl24yL，Oligo d(T)-AdaptorPrimer1μL,RNaseInhibiter0.5μL,AMVReverseTranscriptase 1yL(FinalVolume20yL)，將反應(yīng)液混合后，室溫下放10min，然后42°C溫育60min，再煮 沸5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180μLDEPC處理的ddH20,稀釋至200μL，混勾，稍微離心， 保存于-20 °C，備用。
[0024] (3)PCR反應(yīng)（25yL):cDNA2yL，lOXBuffer2. 5yL，10mmol/LdNTP2yL， 25mmol/LMgC122yL，上、下游引物各 2yL，TaqDNA聚合酶 0· 5yL(5U/yL)，ddH20 12yL。 反應(yīng)條件為94°C5min預(yù)變性；94°C40s，56°C40s，72°Clmin，共32個循環(huán)，72°C延伸 10min，4°C保存。
[0025]上游引物：5 ' -ATGCGCTCGCTTGTC-3 '
[0026]下游引物：5 ' -TCAGGAAGAGGAATC-3 '
[0027] (4)基因克?。喝?. 5μ1PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照 TAKARA公司產(chǎn)品說明書進行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，在表面涂有氨卞青 霉素（100μg/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。
[0028] (5)質(zhì)粒DNA的提?。簤A法提取質(zhì)粒DNA。
[0029] (6)序列測定：DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序 列引物為M13啟動子引物。嗜熱毀絲菌MtCel1基因cDNA全長636bp，包含起始密碼子和終 止密碼子，無內(nèi)含子，編碼211個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，尚未 發(fā)現(xiàn)報道。該序列如下：
[0030] (A)SEQIDNO1 的信息
[0031] (a)序列特征：*長度：636堿基對；*類型：核酸；*鏈型：雙鏈；*拓撲結(jié)構(gòu)：線性
[0032] (b)分子類型：DNA
[0033] (c)假設(shè)：否
[0034] ⑷反義：否
[0035] (e)最初來源：嗜熱毀絲菌Myceliophthorathermophila
[0036] (f)序列描述：
[0039] (B)SEQIDNO2 的信息
[0040] (a)序列特征：*長度：211氨基酸；*類型：氨基酸；*鏈型：單鏈；*拓撲結(jié)構(gòu)：線 性
[0041] (b)分子類型：蛋白質(zhì)
[0042] (c)序列描述：
[0044] 實施方式3:表達載體的構(gòu)建
[0045] (1)根據(jù)分離出的MtCell基因的核苷酸序列設(shè)計表達引物，在引物的5'端分別引 入EcorI和NotI酶切