一種α?葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種α?葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株和α?葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種提高黑曲霉糖化酶酶活的方法和一種制備α?葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方法。CCTCC No：M201622120160422
【專利說明】
一種α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌 株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖化酶是目前最重要的工業(yè)酶制劑之一，是淀粉糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精主要酶類，全 名為葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)。糖化酶是一種外切型糖苷酶，能從淀粉的非還原性末 端依次水解α_1，4糖苷鍵，水解成一個個的葡萄糖單元，并像β-淀粉酶一樣，使水解下來的 葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成β-D-葡萄糖。對于支鏈淀粉，它可以緩慢水解a_l，6糖苷鍵生成 葡萄糖單糖，但水解a_l，6糖苷鍵的能力(kcat/Km)只有水解a_l，4糖苷鍵的0.2%。糖化酶 還能微弱水解a-Ι，3連接的碳鏈，但水解a-Ι，4糖苷鍵的速度最快，在工業(yè)上糖化酶用于將 淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，因此被廣泛地應(yīng)用于食品加工業(yè)、醫(yī)療保健、釀酒、氨基酸生產(chǎn)以及抗 生素和有機酸等發(fā)酵工業(yè)。
[0003] 黑曲霉(Aspergillus niger)是市面上生產(chǎn)糖化酶的特殊菌株之一。黑曲霉的α-淀粉酶活性低，糖化酶活力強，多數(shù)黑曲霉的糖化酶能水解80 %以上的淀粉，與其他菌株相 比較利用黑曲霉生產(chǎn)糖化酶具備產(chǎn)量高，活性好，安全性高的特點。Tamayo-Ramo等研究者 運用黑曲霉產(chǎn)糖化酶的表達體系來表達多銅氧化酶漆酶，Krasevec N等利用黑曲霉絲狀真 菌系統(tǒng)表達未正確折疊的分泌蛋白G-CSF，都驗證了黑曲霉具有穩(wěn)定的特異的高表達蛋白 酶系統(tǒng)。本研究選用工業(yè)上高效表達糖化酶的黑曲霉HE01作為絲狀真菌表達糖化酶的表達 系統(tǒng)。
[0004] 糖化酶的產(chǎn)量活力及酶制劑的高純度雖然在近年來取得了較大的進展。但遇到了 α_葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶在糖化酶中表現(xiàn)出較高活性的難題。而黑曲霉在生產(chǎn)糖化酶的同時也會 伴隨著α_葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的產(chǎn)生，α-葡萄糖苷酶的存在會影響糖化酶制劑的 純度。同樣是支鏈淀粉，α-葡萄糖苷酶水解的主要是α_1，6糖苷鍵，生成的產(chǎn)物是低聚麥芽 糖和糖肽等，葡萄糖苷酶會和糖化酶競爭底物，弱化糖化酶催化淀粉水解成葡萄糖的能 力?；趥鹘y(tǒng)的去除葡萄糖苷酶的工藝法如沉淀法，離子交換樹脂法等不但成效低，還 影響糖化酶的活力。本發(fā)明就利用基因工程的生物技術(shù)方法敲除黑曲霉中的葡萄糖苷酶 基因，使得葡萄糖苷酶不再抑制糖化酶水解淀粉的效率，從源頭上解決α-葡萄糖苷酶對 糖化酶的負影響，以期獲得純度更高的糖化酶。
[0005] 本發(fā)明涉及一種α_葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏信息如下：
[0006] 保藏單位名稱:中國典型培養(yǎng)物保藏中心
[0007] 保藏單位地址：中國武漢武漢大學(xué)
[0008] 保藏日期:2016年4月22日
[0009] 分類命名：Aspergillus niger ΗΕΟΙ-Δα-glu
[0010] 保藏編號：CCTCCN0:M2016221

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的一個目的是提供一種α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏號為 CCTCC NO:Μ2016221。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供α-葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中 的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種提高黑曲霉糖化酶酶活力的方法，所述方法包括 敲除黑曲霉中α-葡萄糖苷酶基因的步驟。
[0014] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種制備α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方 法，包括以下步驟：
[0015] ⑴擴增或者合成黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因上游和下游各約l〇〇〇bp的a-gluEl、a-gluE2片段，以及選擇性標(biāo)記抗性基因；其中所述抗性基因優(yōu)選諾爾絲菌素抗性基因(N r);
[0016] (2)構(gòu)建敲除表達盒a-gluEl-Nqm^-a-gli^兩個融合片段；
[0017] (3)制備黑曲霉原生質(zhì)體；
[0018] (4)將線性化的敲除表達盒共轉(zhuǎn)化黑曲霉原生質(zhì)體；
[0019] (5)培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)化后的黑曲霉原生質(zhì)體獲得α-葡萄糖苷酶基因敲除的陽性轉(zhuǎn)化 子。
[0020] 進一步培養(yǎng)上述步驟所獲得的陽性轉(zhuǎn)化子獲得α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉 菌株。
【附圖說明】
[0021] 圖1是3株轉(zhuǎn)化子的Ver-Ι和Ver-2片段1%瓊脂糖凝膠電泳條帶；
[0022] 其中，M:250bp DNA ladder Marker;l，3,5泳道分別是:第1株、第2株、第3株轉(zhuǎn)化 子的Ver-l片段（1185bp); 2，4，6泳道分別是：第1株、第2株、第3株轉(zhuǎn)化子的Ver-2片段 (1231bp)〇
[0023] 圖2是突變株的SDS-PAGE分析圖；
[0024] 其中，M:Takara High Protein Marker; 1:出發(fā)株糖化酶條帶；2:突變株糖化酶條 帶。
[0025]圖3是出發(fā)株和突變株在察式液體培養(yǎng)基中的生長曲線；
[0026]其中，圓點表示出發(fā)株，正方形表示突變株。
[0027]圖4是出發(fā)株和突變株在可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中的生長曲線；
[0028]其中，正三角表示出發(fā)株，倒三角表示突變株。
[0029] 圖5是出發(fā)株和突變株的糖化酶酶活。
[0030] 圖6是出發(fā)株和突變株的α-葡萄糖苷酶酶活。
[0031 ]圖7是GA基因在出發(fā)株和突變株相對表達情況。
【具體實施方式】
[0032]以下通過具體的實施例進一步對本發(fā)明進行說明，不能理解為是對本發(fā)明的限 制，實施例中使用的材料、試劑，儀器設(shè)備如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 菌株和質(zhì)粒
[0034] 黑曲霉HE01購自湖北立業(yè)生物公司。克隆質(zhì)粒pMD19-T Simple Vector購買于 TaKaRa公司，是具有氨芐青霉素抗性(Amp.R)和TT堿基末端的線性質(zhì)粒載體。
[0035] 培養(yǎng)基
[0036] (1)察氏培養(yǎng)基:鹿糖3%，硝酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.1 %，硫酸鎂0.05 %，氯化鉀 0.05 %，硫酸亞鐵0.001 %，固體加瓊脂1.7 %，半液體加瓊脂0.05 %。鹽離子無機物和有機 物分開滅菌121°(：，0.110^，3〇11^11。配制時用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)整?!1值至5.5~ 6.0〇
[0037] (2)可溶性淀粉固體培養(yǎng)基:蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，酵母粉0.2%，可溶性淀粉 3 · 0 %，氯化鈉0 · 2 %，瓊脂 1 · 7 % (液體為0 · 5 % )。用 lmo 1 /L NaOH和HC1 調(diào)PH至4 · 9~5 · 0，121 °C，0.1MPa，30min滅菌分裝后4°C保存。
[0038] (3)Mandels培養(yǎng)基：用于黑曲霉HE01的液體培養(yǎng)。50XMandels營養(yǎng)鹽濃縮液 20mL/L，1000XMandels微量元素濃縮液1.0mL/L，蛋白胨1.0g/L，lM檸檬酸緩沖液（pH 4.5)5〇11^凡，吐溫80 1.〇-2.(^凡，無水葡萄糖1(^凡(單獨配制，滅菌后混合）。用于黑曲霉 轉(zhuǎn)化子的復(fù)篩培養(yǎng)時，可加入125yg/mL諾爾絲菌素硫酸鹽抗生素。
[0039] (4)種子培養(yǎng)基：用于里黑曲霉HE01及其陽性轉(zhuǎn)化子的非誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)。玉米漿 2%，糊精12%，0?103為0.075%，硫酸銨2%(單獨配制，滅菌后混合）。培養(yǎng)條件：32°(：， 100印111，培養(yǎng)7(1~10(1。
[0040] (5)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉26.8%，玉米漿5.36%，豆餅粉3.57%，DF103消泡 劑0.357%，耐高溫α-淀粉酶5%，硫酸銨1 %和磷酸二氫鉀0.9% (單獨配制，滅菌后混合）。 培養(yǎng)條件:32 °C，1 OOrpm，培養(yǎng)7d~10d。
[0041]寡聚核苷酸引物 [0042]表1實施例中使用到的引物
[0043]
[0045] 注:傾斜字體為overlap PCR引物加入的反向互補堿基序列。
[0046]【實施例1】黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因 a-gluEl、a-gluE2以及選擇性標(biāo)記基因的擴 增
[0047] 用OMEGA試劑盒提取黑曲霉HE01的基因組DNA，以之為模板，以GLU-1F、GLU-2R為a-葡萄糖苷酶基因（GenBank:D45356.1)上游的一對引物，以GLU-3F、GLU-4R為a-葡萄糖苷酶 基因下游的一對引物，采用TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase PCR體系分別擴增 α-葡萄糖苷酶基因上游約1 OOObp片段a-gluEl(SEQ ID勵.19)和€(-葡萄糖苷酶基因下游 約1 OOObp片段a-gluE2(SEQ ID ^).20)。將?0財導(dǎo)到的目的片段進行1%的瓊脂糖凝膠電 泳，片段大小與預(yù)期相同，經(jīng)DNAsist軟件比對序列發(fā)現(xiàn)與(GenBank D45356.1)中記載的黑 曲霉α-葡萄糖苷酶基因上下游各lkb片段同源性達到100%。
[0048]由生工生物工程(上海)股份有限公司全序列人工合成如SEQ ID N0.21所示的諾 爾絲菌素抗性基因序列（Nourseothricin resistant gene，NR)，再以GLU_MkF、GLU_MkR為 引物，采用PrimeS:TAR響HS premix PCR體系擴增，得到選擇性標(biāo)記抗性基因一諾爾絲菌素 抗性基因 Nours.Resistant(NR)。將PCR得到的目的片段進行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，片段大 小與預(yù)期相同。
[0049] 本實施例共有三個目標(biāo)片段，其中α-gluEl和a-gluE2片段由TransSlariiiFastPfu Fly DNA Polymerase擴增，Nours.Resistant片段由PrimeSTA.R?HS premix擴增，所得片 段末端不具有凸出的堿基"A"，不能直接進行ΤΑ克隆。因此需用LA酶在目的片段兩端加 "A" 尾巴。加 A體系如下：
[0050]
[0051]
[0052]將反應(yīng)體系放入PCR儀中，72 °C延伸15min，無需經(jīng)變性、退火。經(jīng)加"A"反應(yīng)獲得的 目的片段需進行純化，去除LA Taq酶等，提高連接效率。然后取1~2yL進行瓊脂糖凝膠電泳 定量檢測。
[0053]目的片段分別與pMD 19-T_Vector(simple)連接體系如下：
[0054]
[0055]取無菌的200yL體積的PCR管，按上述連接體系加入混勻后置于16°C恒溫水浴鍋 中，根據(jù)片段的大小確定反應(yīng)的時間（一般1~24h不等hAT連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化實驗或 存放于-20°C長期保存，無需再純化。
[0056]【實施例2】敲除表達盒的構(gòu)建
[0057] 本實施例需要構(gòu)建的表達盒為α-gluEl-NR(SEQIDN0.22)和N R-α-gluE2(SEQID 腸.23)，上述？0?擴增到三個基因片段€(11仙1、€[11仙2、#后再分別純化回收，通過 Overlap PCR分別得到a-gluEl-N^M-a-gli^兩個融合片段，作為基因敲除的線性表達 盒，具體步驟如下：
[0058] 以a-gluE0PNR兩個片段為模板，GLU_lF、GLU_MkR為上下游引物，擴增a-gluEl_N R 融合片段;〇11仙2和妒兩個片段為模板，GLU_MkF、GLU-4R為上下游引物，采用G〇Taq?DNA Polymerase PCR體系，擴增NR-a-gluE2融合片段。
[0059] Overlap PCR體系：
[0060]
[0061]
[0062] 將上述PCR得到的兩個融合片段a-glUEl-NqPNR-a-gl UE2進行切膠回收，并送至英 濰捷基公司測序。取1~2yL回收的DNA樣品進行1 %瓊脂糖凝膠電泳定量。將純化后的a-gluEl-NqPNR-a-gluE〗融合片段分別連接至pMD19-T-Vector( simple )，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 篩選重組子，對分別含有a-gluEl-Nqm^-a-gluE〗的大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子進行保種，以便于 后期實驗需要a-gluEl-NqPN R-a-gluE2時可直接從大腸桿菌質(zhì)粒中擴增得到。
[0063]【實施例3】黑曲霉ΗΕ01的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和重組黑曲霉ΗΕ01的鑒定 [0064] 1、線性表達盒共轉(zhuǎn)入黑曲霉HE01
[0065] 從大腸桿菌中提取a-gluEl-NqPNR-a-gluES兩融合片段分別與pMD19-T_Vector (simple)連接上的環(huán)形克隆載體，經(jīng)過PCR擴增得到大量的a-gluEl-NqnW-a-gluES片段， 線性化的表達盒有利于提高原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化黑曲霉HE01再生后，將過夜生 長的原生質(zhì)體菌液均勾涂布在5~6個濃度為125yg/mL的諾爾絲菌素硫酸鹽的察式固體大 平板上（8.5cm)，32°C培養(yǎng)。線性表達盒通過與菌株基因組在細胞核內(nèi)發(fā)生同源重組，使得 陽性菌株能夠表現(xiàn)出對諾爾絲菌素硫酸鹽的抗性，而陰性無抗性，因此在含有諾爾絲菌素 硫酸鹽的平板上無法生長。
[0066]采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化黑曲霉HE01時，先檢測突變株分別在含50、75、100、 125yg/mL諾爾絲菌素硫酸鹽平板上的菌絲生長情況，選擇合適的濃度進行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化子 的平板篩選。3d后觀察平板上菌落的生長情況，實驗組平板上有大量凸起的白色菌絲球，陰 性對照組平板上無菌絲生長。當(dāng)有白色菌絲長出時，需及時挖取菌絲球的1/4菌絲及其下方 的瓊脂塊一同轉(zhuǎn)接至新的含相同濃度125yg/mL的諾爾絲菌素硫酸鹽的察式固體小平板上， 32 °C培養(yǎng)3d-5d，初步篩選出有轉(zhuǎn)入諾爾絲菌素硫酸鹽抗性基因的轉(zhuǎn)化子。將重新長出菌 絲的轉(zhuǎn)化子接種至新鮮無抗性的察式液體培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)7-10d，至長滿白色菌絲塊為 止，用65%的甘油對轉(zhuǎn)化子進行保種。經(jīng)諾爾絲菌素硫酸鹽平板復(fù)篩后共得到15株黑曲霉 突變株HE01 (△ ailu)的轉(zhuǎn)化子，隨機挑取3株轉(zhuǎn)化子進行基因水平和蛋白水平的驗證。
[0067]其中，原生質(zhì)體制備操作如下：
[0068] (1)菌絲培養(yǎng):將察式培養(yǎng)基平板(8.5cm)上長好的菌絲體(單菌落)接種至察式的 液體培養(yǎng)中，34°C恒溫培養(yǎng)3-6d，至長新鮮的白色菌絲體。若菌絲生長狀態(tài)不好，可再次進 行轉(zhuǎn)接。
[0069] (2)收集菌絲：用滅好菌干燥后的4層紗布過濾菌液，收集菌絲體。1M山梨醇溶液洗 滌菌絲體一次，10mL 1M MgS〇4溶液洗滌兩次，稱取濕重[77-78]。
[0070] (3)菌絲酶解:按質(zhì)量體積比1:10加入裂解酶液。稱取約lOOOmg菌絲體置于錐形瓶 中，加入10mL的1M MgS〇4溶液后再加入100mg sigma纖維素酶于錐形瓶中裂解細胞壁，溶壁 酶易失活，配制時應(yīng)遠離酒精燈，配制好酶解液后32°C，80rpm/min，酶解3~3.5h，1.5h時開 始鏡檢，每〇. 5h鏡檢一次。
[0071] (4)細胞計數(shù):血球計數(shù)板比普通載玻片厚，玻片中四條下凹的槽構(gòu)成三個平臺。 中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面，刻有一個方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上 刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室(每一個大方格由25 X 16 = 400個小 方格組成），供微生物計數(shù)用。用細胞計數(shù)板鏡檢原生質(zhì)體時，采用血小板計數(shù)法。確定原生 質(zhì)體濃度為1. 〇 X 1〇8個/mL(每個大方格里約有80個原生質(zhì)體球）。
[0072] (5)原生質(zhì)體過濾：將酶解好的菌絲溶液轉(zhuǎn)移置滅好菌且干燥后的8層紗布中過 濾，取濾液于15°C，3 200rpm下離心20min后棄去上清液。
[0073] (6)清洗沉淀：分別用預(yù)冷的0.6M KC1和1 XSTC溶液洗滌沉淀兩次，15°C，3 200rpm/min，離心 10min，棄廢液。
[0074] (7)重懸：用適量配制好的1 XSTC溶液重懸沉淀，輕輕混勻，置冰浴備用。
[0075]制備好黑曲霉ΗΕ01的原生質(zhì)體后可用1.5mL離心管分裝放置4 °C冰箱冰浴一個星 期，或立即用于轉(zhuǎn)化實驗。
[0076] 轉(zhuǎn)化步驟如下：
[0077] (1)取上述200yL(l~2X108個/mL)的原生質(zhì)體懸濁液，48°C孵育5min后立即轉(zhuǎn)移 至冰上或于4 °C冰箱冰浴30s，再室溫放置5min。
[0078] (2)將原生質(zhì)體與5yg DNAh-gluEl-NqPNR-a-gluES片段)混合，室溫放置 15min。
[0079] (3)將溶液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入2mL 60%PEG4000,輕輕混勻，室溫靜置 15min〇
[0080] (4)3 200rpm，離心 10min，小心棄上清液，去除Buffer。
[0081] (5)用5mL 1 XSTC重懸原生質(zhì)體沉淀，輕輕混勻。27°C恒溫放置一夜。
[0082] (6)將過夜培養(yǎng)的5mL原生質(zhì)體與25mL 1 XSTC和察式再生培養(yǎng)基混勻后，倒入5~ 6個含諾爾絲菌素硫酸鹽的抗性平板(平板上的諾爾絲菌素硫酸鹽終濃度為125yg/mL)，或 者3 200rpm離心15min，去上清，再加入再生培養(yǎng)基重懸，取100~200yL涂布平板。
[0083] (7)32°C恒溫培養(yǎng)觀察3~5d，可做一個陰性對照(轉(zhuǎn)入無菌水）。
[0084] (8)待平板上長出白色菌絲或菌絲球時(平板底部變黃），用槍頭挑取單菌落菌絲， 接種至含終濃度為125yg/mL諾爾絲菌素硫酸鹽的新鮮察式培養(yǎng)基小平板(6cm)上，32°C培 養(yǎng)3~5d。進行初步篩選。
[0085] (9)及時將抗性平板上長出的菌絲接種于察式液體培養(yǎng)基，32°C，lOOrpm恒溫搖床 振蕩培養(yǎng)7-10d。用65%的甘油對轉(zhuǎn)化子進行保種后置-80°C冰箱保存。
[0086] 2、重組黑曲霉HE01的基因水平鑒定
[0087] 隨機選取了3株Aspergillus niger HE01轉(zhuǎn)化子進行察式液體培養(yǎng)，用轉(zhuǎn)化子的 基因組為模板進行PCR驗證。以出發(fā)菌株的基因組DNA作為陰性對照，以為上述表1中相應(yīng)的 引物成功擴增得到α-gluEl片段的上下游之間約1 OOObp的驗證序列Ver-Ι和a-gluE2片段 的上下游之間約l〇〇〇bp的驗證序列Ver-2,且測序結(jié)果與預(yù)期相符，說明目的基因已成功整 合到黑曲霉ΗΕ01的基因組DNA中，結(jié)果如圖1所示。
[0088]挑取2株經(jīng)PCR鑒定中有諾爾絲菌素硫酸鹽抗性基因 NR的陽性轉(zhuǎn)化子黑曲霉突變 菌株進行產(chǎn)酶發(fā)酵，取各突變菌株第5d的粗酶液進行SDS-PAGE分析，如圖2所示。黑曲霉出 發(fā)菌株（1泳道)在約120KD處有一蛋白，而突變黑曲霉(2泳道)在120KD處，蛋白條帶更深于 出發(fā)菌株。糖化酶蛋白的分子量大于理論值100KD，推測其在轉(zhuǎn)錄后翻譯時發(fā)生了糖基化修 飾。
[0089]【實施例4】突變黑曲霉的表型分析
[0090]利用察式固體培養(yǎng)基和可溶性淀粉固體培養(yǎng)基分別培養(yǎng)出發(fā)菌株(ST)和突變株 (MT)，檢測兩種菌株在同樣培養(yǎng)條件下的生長情況。在超凈工作臺內(nèi)，用接種環(huán)分別從傳代 次數(shù)一樣的出發(fā)菌株和突變株察式液體培養(yǎng)基里挑取體積大小一致的單個菌絲球，分別接 種到察式培養(yǎng)基和可溶液淀粉培養(yǎng)基的中心位置，每個平板需做3個平行樣。并做好標(biāo)記。 將含有菌株的各個平板放置于32°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3~7天。觀察每天菌株的生長情 況，待菌株長到第5天時，將各個平板置于凝膠成像儀系統(tǒng)載物臺進行拍照。記錄各個菌株 的生長速度和生長形態(tài)特征。
[0091]通過生物量的測定制作出發(fā)菌株和突變菌株的生長曲線。菌株的預(yù)培養(yǎng):取傳代 次數(shù)一樣的出發(fā)菌株和突變株液體培養(yǎng)基，以相同的接種量（lmL)分別接種到新的50mL察 式液體(Sac)和可溶性淀粉液體培養(yǎng)基(Sol )，每個樣需做3個平行樣。32°C，lOOrpm，恒溫搖 床培養(yǎng)，每48h稱一次菌絲干重，分別稱取第3d、第5d、第7d的干重，每次稱取三個平行樣，得 到出發(fā)株和突變株的生物量平均值。出發(fā)株和突變株在察式和可溶性淀粉液體培養(yǎng)基中的 生長曲線如圖3、4所示。出發(fā)株的生物量在培養(yǎng)相同的時間內(nèi)，比突變株增長快速且總體生 物量大于突變株，且出發(fā)株在培養(yǎng)過程中比突變株更容易結(jié)成菌絲球。
[0092]【實施例5】黑曲霉的酶活測定
[0093]測定酶活前分別用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和pNPG溶液做好糖化酶和α-葡萄糖苷酶活測 定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將成功敲除的突變黑曲霉接種到30mL察式培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)3~5d， 按5 %接種量接種至種子培養(yǎng)基中，32°C，200rpm非誘導(dǎo)培養(yǎng)5~8d。每24h取樣一次，測定粗 酶液的糖化酶酶活和葡萄糖苷酶酶活，篩選出酶活最高的黑曲霉株，與出發(fā)菌株酶活進 行對比分析。測得黑曲霉ΗΕ01突變株的糖化酶酶活最高達到7 437.73U/mL，出發(fā)株為6 143.42U/mL(如圖5所示）。而出發(fā)株的α-葡萄糖苷酶酶活為2 045.26U/mL，但突變株的復(fù)合 酶活最高只有24.17U/mL，幾乎檢測不到α-葡萄糖苷酶酶活(如圖6所示）。
[0094]測定α-葡萄糖苷酶酶活的具體操作如下：
[0095] (1 )α-葡萄糖苷酶酶活測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。用0.1Μ的醋酸-醋酸鈉(ρΗ5.5)緩沖 液配制200μΜ ΡΝΡ溶液，然后分別稀釋成60，50，40，30，20，10，ΟμΜ。分別取種不同濃度的ΡΝΡ 溶液各lmL，加入1Μ Na2C03溶液lmL，混勻后顯色5~1 Omin。在400nm下測定吸光度值，繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線。以PNP濃度為橫坐標(biāo)，以樣品0D值為縱坐標(biāo)，繪制XY散點圖，獲得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y =ax+b。ΡΝΡ濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線需要測定五個點以上的值，所得方差R2多0.99。
[0096] (2)取900yL 0· 1Μ的醋酸-醋酸鈉緩沖液和50yL底物pNPG(lOmM)于50°C保溫10- 15min后，加入50yL經(jīng)適度稀釋后的待測定酶液，50°C精確計時反應(yīng)15min后立即加入lmL預(yù) 冷的1M Na2C03中止反應(yīng)，室溫放置lOmin后顯色，405nm處測定其吸光度值。
[0097] (3)另取900yL醋酸鈉緩沖液（0.1mol/L，pH 5.5)和50yL底物pNPG(10mmol/L)于50 °C保溫10_15min后，加入50yL去離子水(或加熱失活的酶液），50°C精確計時反應(yīng)15min后立 即加入lmL預(yù)冷的Na2C03溶液（lmol/L)中止反應(yīng)并顯色，405nm處測定其吸光度值，此吸光值 作為空白對照。
[0098] (4)酶活單位定義:上述條件下，每小時催化產(chǎn)生Ιμπιο? pNP的酶量為一個標(biāo)準(zhǔn)酶 活力單位。
[0099] (5)酶活計算通用公式：
[0100] Ui = CXtXNXVt/Vs
[0101] C:反應(yīng)后的pNP含量 [0102] t:反應(yīng)時間
[0103] N:稀釋倍數(shù) [0104] Vt:反應(yīng)總體系，ml
[0105] Vs:酶液體積，ml
[0106] (6)按照公式計算出每天的酶活值，并繪制酶活差異的柱形圖。
[0107] 測定糖化酶酶活的具體操作如下：
[0108] 本黑曲霉糖化酶酶活測定采用DNS法，DNS與還原糖能發(fā)生顯色反應(yīng)，加熱后，溶液 呈現(xiàn)紅棕色，顏色越深則表示酶活越高。根據(jù)540nm波長下DNS與還原糖顯色反應(yīng)的吸光度 值確定還原糖的量與光吸收值關(guān)系。然后根據(jù)含糖量計算出糖化酶活力。
[0109] (1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取80°C烘干恒重的無水葡萄糖100mg，溶于去 離子水并定容至l〇〇mL，該溶液即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(見表2)。
[0110]表2葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法 [0111]
[0112] (2)0D值測定:取10mL比色管若干，標(biāo)號后按表2加入試劑，各濃度葡萄糖各設(shè)3管 平行樣，以求平均0D值。加好后將各管置于沸水浴lOmin，取出冷卻后以去離子水定容至 10mL，以0號管調(diào)零，波長540nm處測定0D值。
[0113] (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:將上述各管平均0D值和葡萄糖試劑含量輸入表格，以葡萄糖含 量為橫坐標(biāo)，0D值為縱坐標(biāo)繪制XY散點圖并添加趨勢線，即可獲得線性回歸方程，要求標(biāo)準(zhǔn) 差 R2 彡 0.99。
[0114] (4)制備待測酶液:在超凈工作臺內(nèi)取lmL發(fā)酵液，離心后取上清液，根據(jù)發(fā)酵濃度 將酶液稀釋至一定的倍數(shù)。
[0115] (5)酶活測定:取4支10mL比色管。標(biāo)上編號A，B，C，D，每只管加上20g/L的可溶性淀 粉溶液5mL及緩沖液lmL，搖勻后于40 ± 0.2 °C恒溫水浴中預(yù)熱5min。在A，B，C (樣品管）中加 入待測稀釋酶液〇. 4mL，立刻搖勻，在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，立即各加200g/L NaOH溶液 0.04mL，將各管取出迅速冷卻，并于D管(空白對照）中補加去離子水或無菌的發(fā)酵培養(yǎng)上清 液0·4mL。
[0116] (6)顯色:從反應(yīng)后的樣品管及對照管中分別取lmL的反應(yīng)液置于另外干凈的10mL 比色管中，向各管中加入2mL DNS顯色劑，混勻后沸水浴10min顯色，冷卻后補加去了離子水 至1 OmL，以空白對照組調(diào)零，在波長為540nm處比色測定吸光度(0D)值。
[0117] (7)計算酶活力:求測得的各平行樣0D值的均值，根據(jù)公式計算出發(fā)酵液中糖化酶 的酶活力(Uo)。
[0118] Uo = AXKX2X6.44X10XN/0.4
[0119] Α:樣品 0D 值
[0120] K:比色常數(shù)
[0121] Ν:為稀釋倍數(shù)
[0122] 6.44:反應(yīng)總體積，mL
[0123] 0.4:待測酶液體積，mL
[0124] 2:將30min的反應(yīng)時間換算成一個小時
[0125] 10: lmL稀釋液的總酶活
[0126] (8)按照公式計算出每天的酶活值，并繪制酶活差異的柱形圖。
[0127] 【實施例6】突變黑曲霉HE01總RNA的反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR
[0128] 首先提取出發(fā)株和突變株的總RNA，取相同培養(yǎng)條件下第7天的黑曲霉HE01出發(fā)株 和突變株各三株，真空抽濾后取干燥菌絲備用，分別采用Trizol法提取黑曲霉RNA，試劑盒 購買于北京全式金公司。然后進行反轉(zhuǎn)錄PCR，采用一步法合成第一鏈cDNA和去除gDNA。所 用試劑盒購買于全式金公司。將提取的RNA按照下列反轉(zhuǎn)錄PCR的體系進行：
[0129]
[0130] 將各組分輕輕混勻后，于PCR儀器中25°C孵育lOmin后再于42°C孵育反轉(zhuǎn)錄15min， 產(chǎn)物用于qPCR。反應(yīng)完畢后于85°C加熱5s失活TVims'Scr/^KT/RI Enzyme Mix和gDNA Remover。將產(chǎn)物用于下一步實驗或于_20°C長期保存。然后進行熒光定量PCR(qPCR)，采用 SYBR Green I熒光染料和相對雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對目的基因 GA(糖化酶基因）的表達進行實時 定量，具體步驟如下：
[0131 ] (1)以反轉(zhuǎn)錄好的出發(fā)株的cDNA鏈為模板，利用普通PCR技術(shù)分別擴增出內(nèi)參基 因6六?0!1、|3-&(^11、188巧財和糖化酶基因64-31'各約20(^的目的條帶。檢測引物的特異 性，以沒有出現(xiàn)引物二聚體的條帶視為標(biāo)準(zhǔn)條帶，可進行下一步實驗。
[0132] (2)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以PCR產(chǎn)物為模板，β-actin和18s rRNA的PCR產(chǎn)物以稀釋 1〇5為第一個濃度梯度，以10為基數(shù)往后稀釋4個濃度梯度。GATOH和GA-ST的PCR產(chǎn)物以稀釋 1〇 4為第一個濃度梯度，以10為基數(shù)往后稀釋4個濃度梯度。以稀釋后的各濃度為模板，每個 模板做3個平行樣，按照下列反應(yīng)體系進行qPCR擴增。qPCR試劑盒購買于Promega公司。
[0133] qPCR反應(yīng)體系如下：
[0134]
[0135] (3)本實驗采用兩步法快速PCR擴增程序。在加好各反應(yīng)組分于96孔板后，按照以 下條件進行qPCR擴增，要求qPCR后得到的各個樣品濃度的Ct值范圍在15~35之間。
[0136] qPCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：
[0137] 第一步:95° 預(yù)變性 2min;
[0138] 第二步：熱循環(huán)。95°反應(yīng)3s，60°反應(yīng)30s;
[0139] 第三步:熔解曲線。95°反應(yīng)158,60°反應(yīng)11^11，95°反應(yīng)158。
[0140] (4)根據(jù)設(shè)置的qPCR反應(yīng)參數(shù)精確反應(yīng)63min后，根據(jù)樣品稀釋的5個濃度梯度的3 個平行樣的(^值分別繪制6六?0!1、|3-&(^11、188冰嫩和64-31'基因表達量的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線 7 = kx+b。要求R2>0 · 98，擴增效率大于90 %，小于110 %。
[0141] (5)樣品qPCR:以反轉(zhuǎn)錄得到的各個cDNA樣品稀釋10倍后為模板，以與上相同的 qPCR條件進行反應(yīng)。得到所有樣品的Ct值。
[0142] (6)基因表達差異計算公式及數(shù)據(jù)處理。本實驗運用Vandesompele Method相對 定量方法分析基因的表達差異，結(jié)果用相對表達量值表示，通過目的基因的表達量與內(nèi)參 基因表達量的比值得到糖化酶的相對表達量值。
[0143] 計算公式為：
[0144]
[0145] Ratio:比例，目的基因相對表達量值
[0146] E:擴增效率
[0147] Δ Ct:對照組與實驗組的Ct差值
[0148] Ref η:內(nèi)參基因個數(shù)
[0149] (7)將Ct值輸入到WPS Excel 2016中，按照公式計算出目的基因相對表達量，并繪 制基因表達差異的柱形圖。
[0150] 對糖化酶基因在出發(fā)株和突變株的基因表達水平進行檢測，突變株糖化酶的相對 表達量如圖7所示，顯示黑曲霉ΗΕ01突變株的GA基因相對出發(fā)株的表達量上調(diào)，說明α-葡萄 糖苷酶基因敲除后，糖化酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上有所增長。與上述酶活實驗達成正相關(guān)性，由 此說明，α-葡萄糖苷酶的敲除有利于糖化酶表達量的增加。
【主權(quán)項】
1. 一種α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株，其保藏號為CCTCC N0:M2016221。2. α_葡萄糖苷酶基因敲除在提高黑曲霉糖化酶酶活中的應(yīng)用。3. -種提高黑曲霉糖化酶酶活的方法，其特征在于，所述方法包括敲除黑曲霉中α-葡 萄糖苷酶基因的步驟。4. 一種制備α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株的方法，包括以下步驟： (1) 分別擴增黑曲霉葡萄糖苷酶基因上游的α-gluEl和下游的a-gluE2片段，以及選 擇性標(biāo)記抗性基因 NR; (2) 構(gòu)建敲除表達盒a-gluEl-N^PW-a-gluE〗兩個融合片段； (3) 制備黑曲霉原生質(zhì)體； (4) 將線性化的敲除表達盒共轉(zhuǎn)化黑曲霉原生質(zhì)體； (5) 培養(yǎng)和篩選轉(zhuǎn)化后的黑曲霉原生質(zhì)體獲得α-葡萄糖苷酶基因敲除的黑曲霉菌株。
【文檔編號】C12N9/34GK106085887SQ201610436727
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】余少文, 楊麗娟, 胡萍, 謝寧, 湯新
【申請人】深圳大學(xué)