來自粗糙脈孢菌的β-葡糖苷酶的制作方法
【專利說明】
[0001] 優(yōu)先權
[0002] 本申請要求于2012年10月31日提交的美國臨時申請序列號61/720, 745的優(yōu)先 權，該臨時申請據(jù)此全文以引用方式并入。
技術領域
[0003] 本發(fā)明組合物和方法涉及可從粗糙脈孢菌（Neurospora crassa)獲得的β -葡糖 苷酶多肽、編碼β-葡糖苷酶多肽的多核苷酸、以及其制備和使用方法。包含β-葡糖苷酶 多肽的制劑和組合物可用于降解或水解木素纖維素生物質(zhì)。
【背景技術】
[0004] 纖維素和半纖維素是通過光合作用產(chǎn)生的最豐富的植物材料。它們可被多種 產(chǎn)生能夠?qū)⒕酆衔锏孜锼獬蓡误w糖類的胞外酶的微生物（例如，細菌、酵母和真菌） 降解和用作能源（Aro et al·，（2001) J.Biol. Chem.，276:24309-24314(Aro 等人，2001 年，《生物化學雜志》，第276卷，第24309-24314頁））。因為非可再生資源方法的局限 性，纖維素成為主要可再生能源的潛能是巨大的（Krishna et al.，（2001)Bioresource Tech.，77:193-196 (Krishna等人，2001年，《生物資源技術》，第77卷，第193-196頁））。 通過生物過程對纖維素的有效利用是克服食品、飼料和燃料短缺的一種途徑（Ohmiya et al.，（1997) Biotechnol. Gen. Engineer Rev.，14:365-414 (Ohmiya等人，1997 年，《生物技術 與遺傳工程評論》，第14卷，第365-414頁））。
[0005] 纖維素酶是水解纖維素（包含β-1，4-葡聚糖或β D-糖苷鍵）導致形成葡 萄糖、纖維二糖、纖維低聚糖等的酶。傳統(tǒng)上將纖維素酶分為三大類：內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2. 1.4) ( "EG"）、外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶（EC3.2. 1.91) ( "CBH"）和β-葡 糖苷酶（[f3]-D-葡糖苷葡萄糖水解酶；EC3. 2.1.21)( "BG" MKnowles et al·，（1987) TIBTECH 5:255-261 (Knowles等人，1987年，《生物技術趨勢》，第5卷，第255-261 頁）；以及 Schulein，（1988)Methods Enzymol.，160:234_243(Schulein，1988 年，《酶 學方法》，第160卷，第234-243頁））。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用在纖維素纖維的非晶 部分，而纖維二糖水解酶還能夠降解結晶纖維素 （Nevalainen and Penttila, (1995) Mycota, 303-319 (Nevalainen 和 Penttila，1995 年，《菌界》，第 303-319 頁））。因此，纖 維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存在是結晶纖維素有效溶解所必需的（Suurnakki et al.，（2000) Cellulose, 7:189-209 (Suurnakki 等人，2000 年，《纖維素》，第 7 卷，第 189-209 頁））。β -葡糖苷酶起到從纖維二糖、纖維低聚糖和其他葡糖苷釋放D-葡萄糖單位的作用 (Freer, J. (I"3) Biol. Chem.，268:9337_9342 (Freer，I"3 年，《生物化學雜志》，第 268 卷， 第 9337-9342 頁））。
[0006] 已知纖維素酶由大量細菌、酵母和真菌產(chǎn)生。某些真菌產(chǎn)生能夠降解結晶形式 的纖維素的完全纖維素酶體系。這些真菌可經(jīng)發(fā)酵而產(chǎn)生多組纖維素酶或纖維素酶混合 物。相同真菌和其他真菌也可被工程改造而產(chǎn)生或過量產(chǎn)生某些纖維素酶，從而得到包 含不同類型或比例的纖維素酶的纖維素酶混合物。真菌也可被工程改造使得它們經(jīng)由 發(fā)酵而大量產(chǎn)生各種纖維素酶。絲狀真菌發(fā)揮特別的作用，因為許多酵母諸如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)在其天然狀態(tài)下沒有水解纖維素的能力（參見例如，Wood et al·，（1988)Methods in Enzymology, 160:87-116 (Wood 等人，1988 年，《酶學方法》，第 160 卷，第 87-116 頁））。
[0007] CBH、EG和BG的真菌纖維素酶分類可進一步擴展以包括每個分類內(nèi)的多個組 分。例如，已從包括里氏木霉（Trichoderma reesei)(也稱為紅褐肉座菌（Hypocrea jecorina))的多個真菌來源分離了多種CBH、EG和BG，里氏木霉含有兩種CBH的已知基因， 艮P，CBH I( "CBH1"）和 CBH II( "CBH2"），至少八種 EG 的已知基因，即，EG I、EG II、EG III、EGIV、EGV、EGVI、EGVII 和 EGVIII，以及至少五種 BG 的已知基因，即，BG1、BG2、BG3、BG4、 BG5 和 BG7 (Foreman et al. (2003)，J. Biol. Chem. 278 (34) : 31988-31997 (Foreman 等人， 2003年，《生物化學雜志》，第278卷，第34期，第31988-31997頁））。EGIV、EGVI和EGVIII 也具有木葡聚糖酶活性。
[0008] 為了將結晶纖維素有效地轉化成葡萄糖，需要包含來自CBH、EG和BG分類中每一 個的組分的完全纖維素酶體系，而分離的組分在水解結晶纖維素方面不太有效（Filho et al.，（1996) Can. J. Microbiol.，42:1-5 (Filho 等人，1996 年，《加拿大微生物學雜志》，第 42 卷，第1-5頁））。內(nèi)切-1，4-β -葡聚糖酶（EG)和外切纖維二糖水解酶（CBH)催化纖維素 水解為纖維低聚糖（纖維二糖作為主要產(chǎn)物），而葡糖苷酶（BGL)將低聚糖轉化為葡萄 糖。已觀察到來自不同分類的纖維素酶組分之間的協(xié)同關系。具體地講，EG型纖維素酶和 CBH型纖維素酶協(xié)同地相互作用以有效地降解纖維素 。β -葡糖苷酶起到從纖維低聚糖諸 如纖維二糖釋放葡萄糖的重要作用，纖維二糖對用于將糖發(fā)酵為乙醇的微生物諸如酵母具 有毒性；并且纖維二糖還抑制內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的活性，使得它們在進一步 水解結晶纖維素時是低效的。
[0009] 鑒于β -葡糖苷酶在降解或轉化纖維素材料方面所起到的重要作用，具有水解纖 維素給料的改善功效或能力的β-葡糖苷酶同源物的發(fā)現(xiàn)、表征、制備和應用是所需且有 利的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 可從耜糍脈孢菌獲得的β-葡糖苷酶及其用涂
[0011] 纖維素的酶法水解仍然是通過木素纖維素生物質(zhì)給料來生物生產(chǎn)可為纖維素糖 和/或下游產(chǎn)物的材料的主要限制步驟之一。β -葡糖苷酶起到催化該過程最后一步，從抑 制性纖維二糖釋放葡萄糖的重要作用，因此其活性和功效直接影響酶法木素纖維素生物質(zhì) 轉化的總體功效，并最終影響酶溶液的使用成本。因此，新型且更有效的β-葡糖苷酶的發(fā) 現(xiàn)、制備和使用受到廣泛關注。
[0012] 雖然多種葡糖苷酶是已知的，包括來自里氏木霉或紅褐肉座菌的葡 糖苷酶 Bgll、Bgl3、Bgl5、Bgl7 等（Korotkova O.G.et al·，（2009)Biochemistry 74:569-577 (Korotkova 0.G·等人，2009 年，《生物化學》，第 74 卷，第 569-577 頁）； Chauve，M.et al.，（2010)Biotechnol.Biofuels 3:3_3(Chauve，M.等人，2010 年，《生 物燃料技術》，第3卷，第3-3頁））、來自灰腐質(zhì)霉高溫變種（Humicola grisea var. thermoidea)的 β-葡糖苷酶（Nascimento，C.V.et al·，（2010)J. Microbiol. 48, 53-6 2(Nascimento，C.V.等人，2010年，《微生物學雜志》，第48卷，第53-62頁；來自多粉 側抱霉（Sporotrichum pulverulentum)的 β-葡糖苷酶（Deshpande V.et al·，（1988) Methods Enzymol.，160:415-424(Deshpande V.等人，1988 年，《酶學方法》，第 160 卷，第 415-424 頁））；米曲霉（Aspergillus oryzae)的 β-葡糖苷酶（Fukuda T.et al·，（2007) Appl. Microbiol. Biotechnol. 76:1027-1033 (Fukuda Τ·等人，2007 年，《應用微生物學和 生物技術》，第76卷，第1027-1033頁））；來自嗜熱籃狀菌（Talaromyces thermophilus) CBS 236. 58 的 β -葡糖苷酶（Nakkharat P. et al.，（2006) J. Biotechnol.，123:304-313 (Nakkharat P.等人，2006年，《生物技術雜志》，第123卷，第304-313頁））；來自埃默森 籃狀菌（Talaromyces emersonii)的 β-葡糖苷酶（Murray P.，et al, (2004)Protein Expr.Purif. 38:248-257 (Murray Ρ·等人，2004年，《蛋白質(zhì)表達和純化》，第38卷，第 248-257頁）），但迄今為止里氏木霉β-葡糖苷酶Bgll和黑曲霉（Aspergillus niger) β -葡糖苷酶SP188被認為是針對其來評價其他β -葡糖苷酶的活性和性能的基準β -葡 糖苷酶。據(jù)報道，里氏木霉Bgll具有比黑曲霉β-葡糖苷酶SP188更高的比活性，但前 者可能分泌極少，而后者對葡萄糖抑制更敏感（〇^11￥6，]\16〖31.，（2010)13；[0丨60111101· Biofuels, 3 (I) : 3 (Chauve，Μ.等人，2010年，《生物燃料技術》，第3卷，第1期，第3頁））。
[0013] 本發(fā)明組合物和方法的一個方面是應用或使用分離自真菌物種粗糙脈孢菌的高 度活性的β-葡糖苷酶來水解木素纖維素生物質(zhì)底物。絲狀真菌粗糙脈孢菌的基因組已 在 2003 年由 Galagan 等人在 Nature, 422(6934) :859-868(2003)(《自然》，第 422 卷，第 6934期，第859-868頁，2003年）中注釋。本文所述的SEQ ID NO: 2的序列由美國國家醫(yī) 學圖書館國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information, U. S. National Library of Medicine(NCBI))以登錄號XP_956104公布，并且認定為是粗糙脈 孢菌0R74A的β-葡糖苷酶I前體。該酶此前未制成重組形式或包含在可用于水解木素纖 維素生物質(zhì)底物的酶組合物中。在酶法水解木素纖維素生物質(zhì)底物的合適方法中，也未將 該酶或包含這種酶的組合物施加于這種底物。此外，粗糙脈孢菌的β-葡糖苷酶此前未由 工程化微生物表達。