專利名稱：含有與l－肉堿生物合成相關(guān)基因的腸桿菌科屬微生物和使用該微生物生產(chǎn)l－肉堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括來源于粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)的L-肉堿生物合成相關(guān)基因的屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，和使用其生產(chǎn)L-肉堿的方法。
背景技術(shù)：
L-肉堿(3-羥基-4-三甲基氨基丁酸)，在生物體中普遍存在，是負(fù)責(zé)將活化的長鏈脂肪酸經(jīng)由線粒體膜轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)中的兩性離子化合物。已知L-肉堿由賴氨酸或蛋白質(zhì)中的賴氨酸(以下，稱為“蛋白質(zhì)賴氨酸”)生物合成。哺乳動物蛋白質(zhì)賴氨酸通常用作L-肉堿生物合成的前體。然而，在粗糙脈孢菌中，將游離賴氨酸用作L-肉堿的前體。在L-肉堿的生物合成中，形成作為中間體的ε-N，N，N-三甲基賴氨酸，ε-N，N，N-三甲基-β-羥基賴氨酸，N，N，N-三甲基氨基丁醛，和γ-丁酰甜菜堿。通過γ-丁酰甜菜堿羥化酶將γ-丁酰甜菜堿羥基化為L-肉堿。

圖1圖解了在粗糙脈孢菌中假定的L-肉堿生物合成途徑。
L-肉堿可以通過化學(xué)合成、酶促半合成或微生物學(xué)方法生產(chǎn)。然而，肉堿的化學(xué)合成不可避免地導(dǎo)致DL-肉堿外消旋混合物，由此要求分離DL-外消旋混合物。關(guān)于L-肉堿的酶促半合成，例如，美國專利號4,221,869公開了使用肉堿脫氫酶(EC 1.1.1.108)和輔酶NAD，由二氫肉堿生產(chǎn)L-肉堿的方法。然而，二氫肉堿極其不穩(wěn)定并由此可以自發(fā)分解為丙酮基三甲銨和二氧化碳。德國專利號DE-OS-3123975公開了由γ-丁酰甜菜堿生產(chǎn)L-肉堿的方法，該方法使用從粗糙脈孢菌分離的γ-丁酰甜菜堿羥化酶(EC1.14.11.1)。然而，存在一個缺點，即在羥基化期間必須將α-酮戊二酸和還原劑(即，抗壞血酸)加入反應(yīng)混合物。
關(guān)于通過微生物學(xué)方法生產(chǎn)L-肉堿，美國專利號5,028,538公開了生產(chǎn)L-肉堿的方法，該方法包括將大腸桿菌044 K 74溫育在含有巴豆酸甜菜堿(4-N，N，N-三乙基氨基巴豆酸)的培養(yǎng)基中并從培養(yǎng)物中回收L-肉堿。美國專利號4,708,936公開了通過將木糖氧化產(chǎn)堿菌(Achromobacterxylosoxydans)DSM 3225(HK 1331b)溫育在含有巴豆酸甜菜堿和/或γ-丁酰甜菜堿的培養(yǎng)基中來生產(chǎn)L-肉堿的方法。然而，按照該方法，需要使用巴豆酸甜菜堿，其對于L-肉堿生物合成既不是前體也不是中間體，L-肉堿的產(chǎn)率不高。因此，微生物學(xué)方法需要提高L-肉堿的產(chǎn)率。
因此，在使用廉價前體搜尋能夠高產(chǎn)率生產(chǎn)L-肉堿的生產(chǎn)L-肉堿的微生物同時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)來源于粗糙脈孢菌的L-肉堿生物合成相關(guān)基因在屬于腸桿菌科的微生物中良好表達，并由此完成了本發(fā)明。
附圖簡述圖1圖解了在粗糙脈孢菌中假定的L-肉堿生物合成途徑；圖2是顯示構(gòu)建pT7-7carB的示意圖；圖3是顯示構(gòu)建pT7-7carC的示意圖；圖4是顯示構(gòu)建pT7-7carD的示意圖；圖5是顯示構(gòu)建pT7-7carE的示意圖；圖6是分別插入pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE的基因的電泳圖(泳道1標(biāo)記物，泳道2carB，泳道3carC，泳道4carD，和泳道5carE)；圖7是粗提物的SDS-PAGE圖，所述粗提物來自分別用pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)菌株(M標(biāo)記物，泳道1陰性對照，泳道2TMLH(52KDa)，泳道3SHMT(53KDa)，泳道4TMABADH(55KDa)，和泳道5BBH(49KDa))；圖8是顯示構(gòu)建pT7-7BE的示意圖；和圖9是顯示構(gòu)建pACYC184CD的示意圖。
發(fā)明詳述發(fā)明的技術(shù)目的本發(fā)明提供高產(chǎn)率生產(chǎn)L-肉堿的微生物。
本發(fā)明還提供了使用該微生物生產(chǎn)L-肉堿的方法。

發(fā)明內(nèi)容
按照本發(fā)明的一方面，提供了屬于腸桿菌科的微生物，其包括編碼來源于粗糙脈孢菌的N-三甲基賴氨酸羥化酶(TMLH)活性的多核苷酸；編碼來源于粗糙脈孢菌的3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶(SHMT)活性的多核苷酸；編碼來源于粗糙脈孢菌的γ-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)活性的多核苷酸；和編碼來源于粗糙脈孢菌的γ-丁酰甜菜堿羥化酶(BBH)活性的多核苷酸。
不限制本發(fā)明的微生物，只要它包括各自編碼四種蛋白質(zhì)的四種多核苷酸。優(yōu)選地，該微生物是大腸桿菌(E.coli)并且更優(yōu)選大腸桿菌KCCM-10581。
分別編碼四種蛋白質(zhì)即TMLH，SHMT，TMABADH，和BBH的四種多核苷酸可以經(jīng)由載體或它們自身導(dǎo)入微生物細胞。在將分別編碼四種蛋白質(zhì)的四種多核苷酸通過載體導(dǎo)入微生物細胞的情形中，所述四種多核苷酸可以被包含在單一載體中或兩個或多個載體中。在本文中所用的術(shù)語“載體”具有本領(lǐng)域公知的含義并且通常是指用于將核酸導(dǎo)入細胞中的核酸構(gòu)建體。優(yōu)選地，該核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒或病毒基因組衍生的核酸構(gòu)建體。
在本發(fā)明中，編碼來源于粗糙脈孢菌的TMLH活性的多核苷酸編碼來源于粗糙脈孢菌的TMLH。已知TMLH催化粗糙脈孢菌細胞中ε-N-三甲基賴氨酸向β-羥基-ε-N-三甲基賴氨酸的轉(zhuǎn)化，但是本發(fā)明不限于TMLH的這種特定作用機制。優(yōu)選地，編碼TMLH的多核苷酸是編碼SEQ ID NO13所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更優(yōu)選地，具有SEQ ID NO17所列出的核苷酸序列的多核苷酸。
編碼來源于粗糙脈孢菌的SHMT活性的多核苷酸編碼來源于粗糙脈孢菌的SHMT。已知SHMT催化粗糙脈孢菌細胞中β-羥基-ε-N-三甲基賴氨酸向γ-N-三甲基氨基丁醛的轉(zhuǎn)化，但是本發(fā)明不限于SHMT的這種特定作用機制。優(yōu)選地，編碼SHMT的多核苷酸是編碼SEQ ID NO14所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更優(yōu)選地，具有SEQ ID NO18所列出的核苷酸序列的多核苷酸。
編碼來源于粗糙脈孢菌的TMABADH活性的多核苷酸編碼來源于粗糙脈孢菌的TMABADH。已知TMABADH催化粗糙脈孢菌細胞中γ-N-三甲基氨基丁醛向γ-丁酰甜菜堿的轉(zhuǎn)化，但是本發(fā)明不限于TMABADH的這種特定作用機制。優(yōu)選地，編碼TMABADH活性的多核苷酸是編碼SEQID NO15所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更優(yōu)選地，具有SEQ IDNO19所列出的核苷酸序列的多核苷酸。
編碼來源于粗糙脈孢菌的BBH活性的多核苷酸編碼來源于粗糙脈孢菌的BBH。已知BBH催化粗糙脈孢菌細胞中γ-丁酰甜菜堿向L-肉堿的轉(zhuǎn)化，但是本發(fā)明不限于BBH的這種特定作用機制。優(yōu)選地，編碼BBH活性的多核苷酸是編碼SEQ ID NO16所列出的氨基酸序列的多核苷酸，并且更優(yōu)選地，具有SEQ ID NO20所列出的核苷酸序列的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生產(chǎn)L-肉堿的方法，該方法包括在底物存在下培養(yǎng)本發(fā)明的微生物以在培養(yǎng)物中生產(chǎn)L-肉堿，所述底物選自由下列各項組成的組ε-N-三甲基賴氨酸，β-羥基-N-三甲基賴氨酸，γ-N-三甲基氨基丁醛，γ-丁酰甜菜堿，及其混合物。
在本發(fā)明生產(chǎn)L-肉堿的方法中，本發(fā)明的微生物如上所述。
在本發(fā)明生產(chǎn)L-肉堿的方法中，不特別限制底物的濃度，所述底物選自由下列各項組成的組ε-N-三甲基賴氨酸，β-羥基-N-三甲基賴氨酸，γ-N-三甲基氨基丁醛，γ-丁酰甜菜堿，及其混合物。然而，優(yōu)選地，所述底物的濃度范圍為基于培養(yǎng)基重量的0.1至10wt％。
在本發(fā)明生產(chǎn)L-肉堿的方法中，可以通過分離和純化回收培養(yǎng)物中的L-肉堿。分離和純化是本領(lǐng)域公知的。通過非限制性的實例，通過超濾、離心或傾析，接著陽離子交換層析或電滲析，并然后再結(jié)晶，從細胞培養(yǎng)物分離上清來完成L-肉堿的回收。
發(fā)明效果按照本發(fā)明的屬于腸桿菌科的微生物具有良好的L-肉堿生產(chǎn)率，并因此可以有效用于L-肉堿的發(fā)酵生產(chǎn)。
按照本發(fā)明生產(chǎn)L-肉堿的方法，使用所述微生物可以以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-肉堿。
實施本發(fā)明的最佳方式以下，將參考下列實施例更具體地描述本發(fā)明。下列實施例是為了舉例說明目的并且不是意圖限制本發(fā)明的范圍。
實施例在下列實施例中，選擇編碼來源于粗糙脈孢菌的與L-肉堿生物合成相關(guān)的各自蛋白質(zhì)的四種多核苷酸，并構(gòu)建包括所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體。將核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株在含有L-肉堿生物合成中間體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生產(chǎn)和回收L-肉堿。
實施例1從粗糙脈孢菌中分離分別編碼N-三甲基賴氨酸羥化酶(TMLH)、3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶(SHMT)、γ-三甲基氨基醛脫氫酶(TMABADH)和γ-丁酰甜菜堿羥化酶(BBH)的四種多核苷酸在該實施例中，從粗糙脈孢菌中分離并克隆分別編碼TMLH，SHMT，TMABADH，和BBH的四種多核苷酸，進行克隆的多核苷酸的序列分析。
(1)制備粗糙脈孢菌的cDNA文庫從含有粗糙脈孢菌的真菌菌體(包括孢子體)的培養(yǎng)物中分離總mRNA并使用poly-T引物反向轉(zhuǎn)錄。獲得的cDNA通過PCR擴增，用EcoRI和XhoI消化，并插入λAD5克隆載體的EcoRI-XhoI位點，以制備來源于粗糙脈孢菌的cDNA文庫。
接下來，將cDNA文庫轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BNN322中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BNN322培養(yǎng)以擴增cDNA文庫。為此，首先，將大腸桿菌BNN322在含有50μg/ml的卡那霉素和0.2％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。離心獲得的培養(yǎng)物。去除上清液并將細胞沉淀重懸浮在1ml的10mM MgSO4中。將獲得的懸浮液和5×107PFU的λcDNA文庫在不振蕩下30℃培養(yǎng)30分鐘。將2ml的LB培養(yǎng)基另外加入培養(yǎng)物并將獲得的培養(yǎng)物在振蕩下30℃培養(yǎng)1小時。將培養(yǎng)的細胞鋪平板在含有氨芐青霉素(75μg/ml)的LB培養(yǎng)基平板上，并在37℃下培養(yǎng)8小時。使用Wizard試劑盒從平板克隆中純化cDNA文庫集合。將含有純化的cDNA文庫集合的λ噬菌體用作擴增各自編碼TMLH，SHMT，TMABADH，和BBH的四條多核苷酸的模板。
(2)擴增和克隆編碼TMLH-的多核苷酸(carB基因)和檢測TMLH生產(chǎn)(a)擴增和克隆編碼TMLH的多核苷酸(carB基因)使用(1)的含有cDNA文庫集合的λ噬菌體作為模板和SEQ ID NOS1和2列出的寡核苷酸作為引物，進行PCR。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，鑒定了所需的約1.4kb的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NOS1和2的引物包括編碼來源于粗糙脈孢菌的TMLH的起始密碼子和終止密碼子的推定序列。通過在可公開獲得的人-和大鼠-來源的TMLH氨基酸序列和從粗糙脈孢菌基因組表達的總蛋白的氨基酸序列之間的同源性搜索，推斷來源于粗糙脈孢菌的TMLH，基于推定的來源于粗糙脈孢菌的TMLH，設(shè)計SEQ ID NOS1和2的引物。
將PCR產(chǎn)物用EcoRI和SalI消化，連接到已經(jīng)用相同的限制酶處理的pBS KS+(Stratagene Inc.)中。將通過將PCR產(chǎn)物插入pBS KS+中獲得的pBS KS+carB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α在37℃下培養(yǎng)8小時。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α中分離pBS KS+carB并用EcoRI和SalI處理以確定PCR產(chǎn)物是否適當(dāng)?shù)夭迦氪竽c桿菌DH5α中。然后，將分離的pBS KS+carB用NdeI和SalI處理并進行瓊脂糖凝膠電泳以獲得NdeI-SalI片段。將NdeI-SalI片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的表達載體pT7-7中，以獲得pT7-7carB(見FIG.2)。將pT7-7carB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。
(b)檢測TMLH生產(chǎn)將pT7-7carB-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)直至OD600為0.6，所述搖瓶裝有50ml補充了氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基。加入1mM的IPTG并將獲得的細胞進一步培養(yǎng)4小時。從細胞培養(yǎng)物中分離pT7-7carB并用NdeI和SalI處理，將獲得的限制片段使用瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳結(jié)果在圖6中顯示。如圖6所示，觀察到對應(yīng)于NdeI-SalI片段的條帶(泳道2)。pT7-7carB中的carB的核苷酸序列分析揭示pT7-7carB中的carB的核苷酸序列與國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotecnology Information)(NCBI)的粗糙脈孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的一致(SEQ ID NO17)。
研究了在pT7-7carB-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)中表達的TMLH的活性。首先，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物在4,000xg下離心15分鐘并收集細胞沉淀。將細胞沉淀用1ml裂解緩沖液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸鈉緩沖液中(pH 7.4))處理并再懸浮。將細胞懸浮液放置在冰浴中并使用超聲均化器超聲處理(x5，每次10秒)以破裂細胞。將細胞裂解物在4℃和10,000g下離心20至30分鐘。去除細胞碎片并回收上清液以獲得細胞粗提物。對來自細胞粗提物的樣品進行8％SDS-PAGE(見圖7)。SDS-PAGE結(jié)果揭示對應(yīng)于TMLH的約52KDa條帶的存在。
(3)擴增和克隆編碼SHMT的多核苷酸(carC基因)和檢測SHMT生產(chǎn)(a)擴增和克隆編碼SHMT的多核苷酸(carC)使用(1)的含有cDNA文庫集合的λ噬菌體作為模板和SEQ ID NOS3和4列出的寡核苷酸作為引物，進行PCR。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，鑒定了所需的約1.4kb的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NOS3和4的引物包括編碼來源于粗糙脈孢菌的SHMT的起始密碼子和終止密碼子的推定序列。通過在可公開獲得的人-和大鼠-來源的SHMT氨基酸序列和從粗糙脈孢菌基因組表達的總蛋白的氨基酸序列之間的同源性搜索，推斷來源于粗糙脈孢菌的SHMT，基于推定的來源于粗糙脈孢菌的SHMT，設(shè)計SEQ ID NOS3和4的引物。
將PCR產(chǎn)物用EcoRI和SalI消化，連接到已經(jīng)用相同的限制酶處理的pBS KS+(Stratagene Inc.)中。將通過將PCR產(chǎn)物插入pBS KS+中獲得的pBS KS+carC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α在37℃下培養(yǎng)8小時。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α中分離pBS KS+carC并用EcoRI和SalI處理以確定PCR產(chǎn)物是否適當(dāng)?shù)夭迦氪竽c桿菌DH5α中。然后，將分離的pBS KS+carC用NdeI和SalI處理并進行瓊脂糖凝膠電泳以獲得NdeI-SalI片段。將NdeI-SalI片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的表達載體pT7-7中，以獲得pT7-7carC(見圖3)。將pT7-7carC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。
(b)檢測SHMT生產(chǎn)將pT7-7carC-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)直至OD600為0.6，所述搖瓶裝有50ml補充了氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基。加入1mM的IPTG并將獲得的細胞進一步培養(yǎng)4小時。從細胞培養(yǎng)物中分離pT7-7carC并用NdeI和SalI處理，將獲得的限制片段使用瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳結(jié)果在圖6中顯示。如圖6所示，觀察到對應(yīng)于NdeI-SalI片段的條帶(泳道3)。pT7-7carC中的carC的核苷酸序列分析揭示pT7-7carB中的carB的核苷酸序列與國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的粗糙脈孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的一致(SEQ ID NO18)。
研究了在pT7-7carC-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)中表達的SHMT的活性。首先，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物在4,000xg下離心15分鐘并收集細胞沉淀。將細胞沉淀用1ml裂解緩沖液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸鈉緩沖液中(pH 7.4))處理并再懸浮。將細胞懸浮液放置在冰浴中并使用超聲均化器超聲處理(x5，每次10秒)以破裂細胞。將細胞裂解物在4℃和10,000g下離心20至30分鐘。去除細胞碎片并回收上清液以獲得細胞粗提物。對來自細胞粗提物的樣品進行8％SDS-PAGE(見圖7)。SDS-PAGE結(jié)果揭示對應(yīng)于SHMT的約53KDa條帶的存在。
(4)擴增和克隆編碼TMABADH的多核苷酸(carD)和檢測TMABADH生產(chǎn)(a)擴增和克隆編碼TMABADH的多核苷酸(carD)使用(1)的含有cDNA文庫集合的λ噬菌體作為模板和SEQ ID NOS5和6列出的寡核苷酸作為引物，進行PCR。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，鑒定了所需的約1.5kb的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NOS5和6的引物包括編碼來源于粗糙脈孢菌的TMABADH的起始密碼子和終止密碼子的推定序列。通過在可公開獲得的人-和大鼠-來源的TMABADH氨基酸序列和從粗糙脈孢菌基因組表達的總蛋白的氨基酸序列之間的同源性搜索，推斷來源于粗糙脈孢菌的TMABADH，基于推定的來源于粗糙脈孢菌的TMABADH，設(shè)計SEQ ID NOS5和6的引物。
將PCR產(chǎn)物用EcoRI和SalI消化，連接到已經(jīng)用相同的限制酶處理的pBS KS+(Stratagene Inc.)中。將通過將PCR產(chǎn)物插入pBS KS+中獲得的pBS KS+carD轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α在37℃下培養(yǎng)8小時。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α中分離pBS KS+carD并用EcoRI和SalI處理以確定PCR產(chǎn)物是否適當(dāng)?shù)夭迦氪竽c桿菌DH5α中。然后，將分離的pBS KS+carD用NdeI和SalI處理并進行瓊脂糖凝膠電泳以獲得NdeI-SalI片段。將NdeI-SalI片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的表達載體pT7-7中，以獲得pT7-7carD(見圖4)。將pT7-7carD轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。
(b)檢測TMABADH生產(chǎn)將pT7-7carD-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)直至OD600為0.6，所述搖瓶裝有50ml補充了氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基。加入1mM的IPTG并將獲得的細胞進一步培養(yǎng)4小時。從細胞培養(yǎng)物中分離pT7-7carD并用NdeI和SalI處理，將獲得的限制片段使用瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳結(jié)果在圖6中顯示。如圖6所示，觀察到對應(yīng)于NdeI-SalI片段的條帶(泳道4)。pT7-7carD中的carD的核苷酸序列分析揭示pT7-7carD中的carD的核苷酸序列與國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的粗糙脈孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的一致(SEQ ID NO19)。
研究了在pT7-7carD-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)中表達的TMABADH的活性。首先，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物在4,000xg下離心15分鐘并收集細胞沉淀。將細胞沉淀用1ml裂解緩沖液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸鈉緩沖液中(pH 7.4))處理并再懸浮。將細胞懸浮液放置在冰浴中并使用超聲均化器超聲處理(x5，每次10秒)以破裂細胞。將細胞裂解物在4℃和10,000g下離心20至30分鐘。去除細胞碎片并回收上清液以獲得細胞粗提物。對來自細胞粗提物的樣品進行8％SDS-PAGE(見圖7)。SDS-PAGE結(jié)果揭示對應(yīng)于TMABADH的約55KDa條帶的存在。
(5)擴增和克隆編碼BBH的多核苷酸(carE)和檢測BBH生產(chǎn)(a)擴增和克隆編碼BBH的多核苷酸(carE)使用(1)的含有cDNA文庫集合的λ噬菌體作為模板和SEQ ID NOS7和8列出的寡核苷酸作為引物，進行PCR。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，鑒定了所需的約1.3kb的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NOS7和8的引物包括編碼來源于粗糙脈孢菌的BBH的起始密碼子和終止密碼子的推定序列。通過在可公開獲得的人-和大鼠-來源的BBH氨基酸序列和從粗糙脈孢菌基因組表達的總蛋白的氨基酸序列之間的同源性搜索，推斷來源于粗糙脈孢菌的BBH，基于推定的來源于粗糙脈孢菌的BBH，設(shè)計SEQ IDNOS7和8的引物。
將PCR產(chǎn)物用EcoRI和SalI消化，連接到已經(jīng)用相同的限制酶處理的pUC19中。將通過將PCR產(chǎn)物插入pUC19中獲得的pUC19carE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α在補充有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)8小時。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α中分離pUC19carE并用EcoRI和SalI處理以確定PCR產(chǎn)物是否適當(dāng)?shù)夭迦氪竽c桿菌DH5α中。然后，將分離的pUC19carE用NdeI和SalI處理并進行瓊脂糖凝膠電泳以獲得NdeI-SalI片段。將NdeI-SalI片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的表達載體pT7-7中，以獲得pT7-7carE(見圖5)。將pT7-7carE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。
將pT7-7carE-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)在37℃下在250ml-帶擋板的搖瓶中培養(yǎng)直至OD600為0.6，所述搖瓶裝有50ml補充了氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基。加入1mM的IPTG并將獲得的細胞進一步培養(yǎng)4小時。從細胞培養(yǎng)物中分離pT7-7carE并用NdeI和SalI處理，將獲得的限制片段使用瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳結(jié)果在圖6中顯示。如圖6所示，觀察到對應(yīng)于NdeI-SalI片段的條帶。pT7-7carE中的carE(1,278bp)的核苷酸序列分析揭示pT7-7carE中的carE的核苷酸序列與國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的粗糙脈孢菌基因組數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的一致(SEQ ID NO20)。
(b)檢測BBH生產(chǎn)研究了在pT7-7carE-轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)中表達的BBH的活性。首先，將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物在4,000xg下離心15分鐘并收集細胞沉淀。將細胞沉淀用1ml裂解緩沖液(140mM NaCl，200g/l甘油，和1mM DTT，在10mM磷酸鈉緩沖液中(pH 7.4))處理并再懸浮。將細胞懸浮液放置在冰浴中并使用超聲均化器超聲處理(x5，每次10秒)以破裂細胞。將細胞裂解物在4℃和10,000g下離心20至30分鐘。去除細胞碎片并回收上清液以獲得細胞粗提物。對來自細胞粗提物的樣品進行8％SDS-PAGE(見圖7)。SDS-PAGE結(jié)果揭示對應(yīng)于BBH的約49KDa條帶的存在。
實施例2構(gòu)建含有carB，carC，carD，和carE的宿主細胞在本實施例中，從實施例1中制備的來源于粗糙脈孢菌的cDNA文庫擴增carB和carE基因，構(gòu)建含有這兩個基因的pT7-7BE。此外，從實施例1中制備的來源于粗糙脈孢菌的cDNA文庫擴增carC和carD基因，并構(gòu)建含有這兩個基因的pACYC184CD。將如此構(gòu)建的pT7-7BE和pACYC184CD導(dǎo)入大腸桿菌細胞以獲得含有所有carB，carC，carD和carE基因的轉(zhuǎn)化細胞。將轉(zhuǎn)化的細胞命名為大腸桿菌DH5α CJ2004并于2004年1月27日保藏在國際保藏單位韓國微生物保藏中心(KCCM)(保藏號KCCM-10581)。
(1)構(gòu)建含有carB和carE基因的pT7-7BE首先，使用來源于粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板和SEQ ID NOS1和2的寡核苷酸作為引物，擴增carB基因。然后，使用來源于粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板和SEQ ID NOS7和8的寡核苷酸作為引物，擴增含有從T7啟動子至終止子區(qū)域的carE。將carB和carE擴增產(chǎn)物引入pT7-7。為此，首先將carE擴增產(chǎn)物用BamHI和SalI處理以獲得BamHI-SalI片段。將BamHI-SalI片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的pT7-7中，以獲得pT7-7carE。然后，用NdeI和EcoRI處理carB擴增產(chǎn)物以獲得NdeI-EcoRI片段。將NdeI-EcoRI片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的pT7-7carE中以獲得pT7-7BE(見圖8)。
(2)構(gòu)建含有carC和carD基因的pACYC184CD首先，使用來源于粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板和SEQ ID NOS3和4的寡核苷酸作為引物，擴增含有從T7啟動子到終止密碼子區(qū)域的carC基因。然后，使用來源于粗糙脈孢菌的cDNA文庫作為模板和SEQ IDNOS5和6的寡核苷酸作為引物，擴增含有從T7啟動子至終止子區(qū)域的carD基因。將carC和carD擴增產(chǎn)物引入pACYC184。為此，首先將carC擴增產(chǎn)物用BamHI和HindIII處理以獲得BamHI-HindIII片段。將BamHI-HindIII片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的pACYC184中，以獲得pACYC184carC。然后，用BamHI和SalI處理carD擴增產(chǎn)物以獲得BamHI-SalI片段。將BamHI-SalI片段連接到已經(jīng)用相同限制酶處理的pACYC184carC中以獲得pACYC184CD(見圖9)。
實施例3使用含有編碼TMLH，SHMT，TMABADH和BBH的多核苷酸的菌株生產(chǎn)L-肉堿在本實施例中，將分別用在實施例1中構(gòu)建的pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)菌株在含有三甲基賴氨酸的培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)，然后測量L-肉堿的生產(chǎn)。另外，培養(yǎng)用在實施例2中構(gòu)建的pT7-7BE和pACYC184CD共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，然后測量L-肉堿的生產(chǎn)。
(1)分別用pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)菌株的混合培養(yǎng)首先，將分別用pT7-7carB，pT7-7carC，pT7-7carD，和pT7-7carE轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)菌株鋪平板在補充有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上并培養(yǎng)。將每種培養(yǎng)物的細胞克隆在含有20ml補充有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基的搖瓶中37℃培養(yǎng)12小時，直至OD600為1.0。將等量(每種0.1ml)的細胞培養(yǎng)物加入250ml含有20ml LB培養(yǎng)基的帶擋板的搖瓶中并37℃培養(yǎng)直至OD600為0.6，所述LB培養(yǎng)基含有2mM三甲基賴氨酸并補充有氨芐青霉素(100μg/ml)。在使用IPTG的情形中，在OD600達到0.6后，加入1mM的IPTG，將獲得的細胞進一步培養(yǎng)4小時。將不含三甲基賴氨酸的LB培養(yǎng)基用作對照。以與以上相同的方式進行IPTG的加入和細胞培養(yǎng)。
在培養(yǎng)后，測量細胞培養(yǎng)物中L-肉堿的含量。收獲500μl的培養(yǎng)上清液并與500μl的1.2M高氯酸混合。將混合溶液在室溫下溫育10分鐘，然后離心5分鐘。將600μl獲得的上清液與320μl的0.7M K3PO4混合。將混合溶液放置在冰浴中20分鐘并離心5分鐘。收獲750μl獲得的上清液并與250μl無菌蒸餾水混合以獲得稀釋溶液。將100μl的DNTB/H2O2加入稀釋溶液中，將獲得的溶液溫育10分鐘。加入50μl的過氧化氫酶溶液，將獲得的溶液在室溫下溫育30分鐘并離心，由此收獲1ml獲得的上清液。將50μl的乙酰CoA加入上清液并將獲得的溶液在室溫下溫育5分鐘。加入2.26μl的肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶并將獲得的溶液在室溫下溫育10分鐘。測量終溶液的吸光度(405nm)以計算L-肉堿的含量。結(jié)果在下表1中顯示。
表1通過混合培養(yǎng)生產(chǎn)L-肉堿

如表1所示，分別含有編碼TMLH的多核苷酸、編碼SHMT的多核苷酸、編碼TMABADH的多核苷酸和編碼BBH的多核苷酸的菌株在含有三甲基賴氨酸的培養(yǎng)基中的混合培養(yǎng)，能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-肉堿。
(2)由用實施例2中構(gòu)建的pT7-7BE和pACYC184CD共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)物生產(chǎn)L-肉堿首先，將分別用pT7-7BE和pACYC184CD轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)物鋪平板于補充有氨芐青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上并培養(yǎng)。將每種培養(yǎng)物的細胞克隆在含有20ml補充有氨芐青霉素(100μg/ml)和氯霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基的搖瓶中37℃培養(yǎng)12小時，直至OD600為1.0。將等量(每種0.1ml)的細胞培養(yǎng)物加入250ml含有20ml LB培養(yǎng)基的帶擋板的搖瓶中并37℃培養(yǎng)直至OD600為0.6，所述LB培養(yǎng)基含有2mM三甲基賴氨酸。在使用IPTG的情形中，在OD600達到0.6后，加入1mM的IPTG，將獲得的細胞進一步培養(yǎng)4小時。將不含三甲基賴氨酸的LB培養(yǎng)基用作對照。以與以上相同的方式進行IPTG的加入和細胞培養(yǎng)。
在培養(yǎng)后，以與(1)相同的方式測量細胞培養(yǎng)物中的L-肉堿的含量。結(jié)果在下表2中提供。
表2通過單一培養(yǎng)生產(chǎn)L-肉堿

如表2所示，同時含有編碼TMLH，SHMT，TMABADH和BBH的多個多核苷酸的菌株在含有三甲基賴氨酸的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)，能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)L-肉堿。在表1和2中表示的結(jié)果之間比較，可以看出通過單一培養(yǎng)的L-肉堿產(chǎn)率要高于通過混合培養(yǎng)的L-肉堿產(chǎn)率。

涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細則13bis)

PCR/RO/134表(1998年7月)
序列表<110>CJ株式會社<120>含有與L-肉堿生物合成相關(guān)基因的腸桿菌科屬微生物和使用該微生物生產(chǎn)L-肉堿的方法<130>PN054899<160>20<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>1atgaattcca tatgagaccg caagtggtag gg 32<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2atgaattctc attttccgct ggtttctttc cg 32<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>3atgaattcca tatgtctacc tactccctct cc 32<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>4attgtcgact tagagaccgg catcgtatct 30<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>5atgaattcca tatggaagtc gagcttacgg cc 32
<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>6attgtcgact catgccgcca ggtttacatg gat 33<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>7atgaattcca tatgatggcc acggcagcgg ttcag 35<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>8attagtcgac tcaataccct cccccaccct g 31<210>9<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>9atggatccta atacgactca ctataggga 29<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>10attaagcttt tagagaccgg catcgtatct 30<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>11
atggatccta atacgactca ctataggga 29<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>12atggatccta atacgactcactataggga 29<210>13<211>471<212>PRT<213>粗糙脈孢菌(Neuropora crassa)<400>13Met Arg Pro Gln Val Val Gly Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ala Val Val1 5 10 15Ser Arg Gln Pro Leu Ser Arg Thr His Ile Phe Ala Ala Val Thr Val20 25 30Ala Lys Ser Ser Ser Pro Ala Gln Asn Ser Arg Arg Thr Phe Ser Ser35 40 45Ser Phe Arg Arg Leu Tyr Glu Pro Lys Ala Glu Ile Thr Ala Glu Gly50 55 60Leu Glu Leu Ser Pro Pro Gln Ala Val Thr Gly Gly Lys Arg Thr Val65 70 75 80Leu Pro Asn Phe Trp Leu Arg Asp Asn Cys Arg Cys Thr Lys Cys Val85 90 95Asn Gln Asp Thr Leu Gln Arg Asn Phe Asn Thr Phe Ala Ile Pro Ser100 105 110Asp Ile His Pro Thr Lys Val Glu Ala Thr Lys Glu Asn Val Thr Val115 120 125Gln Trp Ser Asp Asn His Thr Ser Thr Tyr Pro Trp Pro Phe Leu Ser130 135 140Phe Tyr Leu Thr Ser Asn Ala Arg Gly His Glu Asn Asp Gln Ile Ser145 150 155 160Leu Trp Gly Ser Glu Ala Gly Ser Arg Pro Pro Thr Val Pro Phe Pro165 170 175Arg Val Met Ala Ser Asp Gln Gly Val Ala Asp Leu Thr Ala Met Ile180 185 190Lys Glu Phe Gly Phe Cys Phe Val Lys Asp Thr Pro His Asp Asp Pro195 200 205Asp Val Thr Arg Gln Leu Leu Glu Arg Ile Ala Phe Ile Arg Val Thr210 215 220His Tyr Gly Gly Phe Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Leu Ala Met Ala Asp225 230 235 240Thr Ala Tyr Thr Asn Leu Ala Leu Pro Ala His Thr Asp Thr Thr Tyr245 250 255Phe Thr Asp Pro Ala Gly Leu Gln Ala Phe His Leu Leu Glu His Lys260 265 270Ala Ala Pro Ser Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro275 280 285
Ser Glu Glu Lys Glu Ala Ala Gly Ser Ala Ala Gly Glu Ala Ala Ala290 295 300Ala Ala Glu Gly Gly Lys Ser Leu Leu Val Asp Gly Phe Asn Ala Ala305 310 315 320Arg Ile Leu Lys Glu Glu Asp Pro Arg Ala Tyr Glu Ile Leu Ser Ser325 330 335Val Arg Leu Pro Trp His Ala Ser Gly Asn Glu Gly Ile Thr Ile Ala340 345 350Pro Asp Lys Leu Tyr Pro Val Leu Glu Leu Asn Glu Asp Thr Gly Glu355 360 365Leu His Arg Val Arg Trp Asn Asn Asp Asp Arg Gly Val Val Pro Phe370 375 380Gly Glu Lys Tyr Ser Pro Ser Glu Trp Tyr Glu Ala Ala Arg Lys Trp385 390 395 400Asp Gly Ile Leu Arg Arg Lys Ser Ser Glu Leu Trp Val Gln Leu Glu405 410 415Pro Gly Lys Pro Leu Ile Phe Asp Asn Trp Arg Val Leu His Gly Arg420 425 430Ser Ala Phe Ser Gly Ile Arg Arg Ile Cys Gly Gly Tyr Ile Asn Arg435 440 445Asp Asp Phe Ile Ser Arg Trp Arg Asn Thr Asn Tyr Pro Arg Ser Glu450 455 460Val Leu Pro Arg Val Thr Gly465 470<210>14<211>480<212>PRT<213>粗糙脈孢菌(Neuropora crassa)<400>14Met Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Glu Thr His Lys Ala Met Leu Glu His1 5 10 15Ser Leu Val Glu Ser Asp Pro Gln Val Ala Glu Ile Met Lys Lys Glu20 25 30Val Gln Arg Gln Arg Glu Ser Ile Ile Leu Ile Ala Ser Glu Asn Val35 40 45Thr Ser Arg Ala Val Phe Asp Ala Leu Gly Ser Pro Met Ser Asn Lys50 55 60Tyr Ser Glu Gly Leu Pro Gly Ala Arg Tyr Tyr Gly Gly Asn Gln His65 70 75 80Ile Asp Glu Ile Glu Val Leu Cys Gln Asn Arg Ala Leu Glu Ala Phe85 90 95His Leu Asp Pro Lys Gln Trp Gly Val Asn Val Gln Cys Leu Ser Gly100 105 110Ser Pro Ala Asn Leu Gln Val Tyr Gln Ala Ile Met Pro Val His Gly115 120 125Arg Leu Met Gly Leu Asp Leu Pro His Gly Gly His Leu Ser His Gly130 135 140Tyr Gln Thr Pro Gln Arg Lys Ile Ser Ala Val Ser Thr Tyr Phe Glu145 150 155 160Thr Met Pro Tyr Arg Val Asn Ile Asp Thr Gly Leu Ile Asp Tyr Asp
165 170 175Thr Leu Glu Lys Asn Ala Gln Leu Phe Arg Pro Lys Val Leu Val Ala180 185 190Gly Thr Ser Ala Tyr Cys Arg Leu Ile Asp Tyr Glu Arg Met Arg Lys195 200 205Ile Ala Asp Ser Val Gly Ala Tyr Leu Val Val Asp Met Ala His Ile210 215 220Ser Gly Leu Ile Ala Ser Glu Val Ile Pro Ser Pro Phe Leu Tyr Ala225 230 235 240Asp Val Val Thr Thr Thr Thr His Lys Ser Leu Arg Gly Pro Arg Gly245 250 255Ala Met Ile Phe Phe Arg Arg Gly Val Arg Ser Val Asp Ala Lys Thr260 265 270Gly Lys Glu Thr Leu Tyr Asp Leu Glu Asp Lys Ile Asn Phe Ser Val275 280 285Phe Pro Gly His Gln Gly Gly Pro His Asn His Thr Ile Thr Ala Leu290 295 300Ala Val Ala Leu Lys Gln Ala Ala Ser Pro Glu Phe Lys Glu Tyr Gln305 310 315 320Gln Lys Val Val Ala Asn Ala Lys Ala Leu Glu Lys Lys Leu Lys Glu325 330 335Leu Gly Tyr Lys Leu Val Ser Asp Gly Thr Asp Ser His Met Val Leu340 345 350Val Asp Leu Arg Pro Ile Gly Val Asp Gly Ala Arg Val Glu Phe Leu355 360 365Leu Glu Gln Ile Asn Ile Thr Cys Asn Lys Asn Ala Val Pro Gly Asp370 375 380Lys Ser Ala Leu Thr Pro Gly Gly Leu Arg Ile Gly Thr Pro Ala Met385 390 395 400Thr Ser Arg Gly Phe Gly Glu Ala Asp Phe Glu Lys Val Ala Val Phe405 410 415Val Asp Glu Ala Val Lys Leu Cys Lys Glu Ile Gln Ala Ser Leu Pro420 425 430Lys Glu Ala Asn Lys Gln Lys Asp Phe Lys Ala Lys Ile Ala Thr Ser435 440 445Asp Ile Pro Arg Ile Asn Glu Leu Lys Gln Glu Ile Ala Ala Trp Ser450 455 460Asn Thr Phe Pro Leu Pro Val Glu Gly Trp Arg Tyr Asp Ala Gly Leu465 470 475 480<210>15<211>495<212>PRT<213>粗糙脈孢菌(Neuropora crassa)<400>15Met Glu Val Glu Leu Thr Ala Pro Asn Gly Lys Lys Trp Met Gln Pro1 5 10 15Leu Gly Leu Phe Ile Asn Asn Glu Phe Val Lys Ser Ala Asn Glu Gln20 25 30Lys Leu Ile Ser Ile Asn Pro Thr Thr Glu Glu Glu Ile Cys Ser Val35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Ala Glu Asp Val Asp Ala Ala Val Ser Ala Ala Arg50 55 60Lys Ala Phe Arg His Glu Ser Trp Lys Ser Leu Ser Gly Thr Glu Arg65 70 75 80Gly Ala Leu Met Arg Lys Leu Ala Asp Leu Val Ala Glu Asn Ala Glu85 90 95Ile Leu Ala Thr Ile Glu Cys Leu Asp Asn Gly Lys Pro Tyr Gln Thr100 105 110Ala Leu Asn Glu Asn Val Pro Glu Val Ile Asn Val Leu Arg Tyr Tyr115 120 125Ala Gly Tyr Ala Asp Lys Asn Phe Gly Gln Val Ile Asp Val Gly Pro130 135 140Ala Lys Phe Ala Tyr Thr Val Lys Glu Pro Leu Gly Val Cys Gly Gln145 150 155 160Ile Ile Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Asp Met Ala Ala Trp Lys Leu Gly165 170 175Pro Ala Leu Cys Cys Gly Asn Thr Val Val Leu Lys Leu Ala Glu Gln180 185 190Thr Pro Leu Ser Val Leu Tyr Leu Ala Lys Leu Ile Lys Glu Ala Gly195 200 205Phe Pro Pro Gly Val Ile Asn Ile Ile Asn Gly His Gly Arg Glu Ala210 215 220Gly Ala Ala Leu Val Gln His Pro Gln Val Asp Lys Ile Ala Phe Thr225 230 235 240Gly Ser Thr Thr Thr Gly Lys Glu Ile Met Lys Met Ala Ser Tyr Thr245 250 255Met Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Gly Gly Lys Ser Pro Leu Ile Val260 265 270Phe Glu Asp Ala Asp Leu Glu Leu Ala Ala Thr Trp Ser His Ile Gly275 280 285Ile Met Ser Asn Gln Gly Gln Ile Cys Thr Ala Thr Ser Arg Ile Leu290 295 300Val His Glu Lys Ile Tyr Asp Glu Phe Val Glu Lys Phe Lys Ala Lys305 310 315 320Val Gln Glu Val Ser Val Leu Gly Asp Pro Phe Glu Glu Ser Thr Phe325 330 335His Gly Pro Gln Val Thr Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Val Leu Gly Tyr340 345 350Ile Asn Val Gly Lys Glu Glu Gly Ala Thr Val Met Met Gly Gly Glu355 360 365Pro Ala Pro Gln Asn Gly Lys Gly Phe Phe Val Ala Pro Thr Val Phe370 375 380Thr Asn Val Lys Pro Thr Met Lys Ile Phe Arg Glu Glu Ile Phe Gly385 390 395 400Pro Cys Val Ala Ile Thr Thr Phe Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Thr405 410 415Leu Ala Asn Asp Ser Met Tyr Gly Leu Gly Ala Ala Leu Phe Thr Lys420 425 430Asp Leu Thr Arg Ala His Arg Val Ala Arg Glu Ile Glu Ala Gly Met435 440 445
Val Trp Val Asn Ser Ser Asn Asp Ser Asp Phe Arg Ile Pro Phe Gly450 455 460Gly Val Lys Gln Ser Gly Ile Gly Arg Glu Leu Gly Glu Ala Gly Leu465 470 475 480Ala Pro Tyr Cys Asn Val Lys Ser Ile His Val Asn Leu Ala Ala485 490 495<210>16<211>425<212>PRT<213>粗糙脈孢菌(Neuropora crassa)<400>16Met Ala Thr Ala Ala Val Gln Val Ser Val Pro Ala Pro Val Gly Gln1 5 10 15Pro Asp Ile Gly Tyr Ala Pro Asp His Asp Lys Tyr Leu Ala Arg Val20 25 30Lys Arg Arg Arg Glu Asn Glu Lys Leu Glu Ser Ser Leu Pro Pro Gly35 40 45Phe Pro Arg Arg Leu Asp Ser Asp Leu Val Trp Asp Gly Asn Thr Leu50 55 60Ala Glu Thr Tyr Asp Trp Thr Tyr Arg Leu Thr Glu Glu Ala Ile Asp65 70 75 80Glu Ile Glu Ala Ala Leu Arg His Phe Lys Ser Leu Asn Lys Pro Leu85 90 95Gly Tyr Ile Asn Gln Glu Thr Phe Pro Leu Pro Arg Leu His His Thr100 105 110Leu Arg Ser Leu Ser His Glu Leu His His Gly His Gly Phe Lys Val115 120 125Leu Arg Gly Leu Pro Val Thr Ser His Thr Arg Glu Glu Asn Ile Ile130 135 140Ile Tyr Ala Gly Val Ser Ser His Val Ala Pro Ile Arg Gly Arg Gln145 150 155 160Asp Asn Gln His Asn Gly His Pro Ala Asp Val Val Leu Ala His Ile165 170 175Lys Asp Leu Ser Thr Thr Val Ser Asp Val Ser Lys Ile Gly Ala Pro180 185 190Ala Tyr Thr Thr Glu Lys Gln Val Phe His Thr Asp Ala Gly Asp Ile195 200 205Val Ala Leu Phe Cys Leu Gly Glu Ala Ala Glu Gly Gly Gln Ser Tyr210 215 220Leu Ser Ser Ser Trp Lys Val Tyr Asn Glu Leu Ala Ala Thr Arg Pro225 230 235 240Asp Leu Val Arg Thr Leu Ala Glu Pro Trp Val Ala Asp Glu Phe Gly245 250 255Lys Glu Gly Arg Lys Phe Ser Val Arg Pro Leu Leu His Phe Gln Ser260 265 270Thr Ala Ala Ala Ala Ser Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ser Glu Arg Leu275 280 285Ile Ile Gln Tyr Ala Arg Arg Thr Phe Thr Gly Tyr Trp Gly Leu Pro290 295 300Arg Ser Ala Asp Ile Pro Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ala Glu Ala Leu305 310 315 320
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權(quán)利要求
1.屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的微生物，其包含編碼來源于粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)的N-三甲基賴氨酸羥化酶活性的多核苷酸；編碼來源于粗糙脈孢菌的3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶活性的多核苷酸；編碼來源于粗糙脈孢菌的γ-三甲基氨基醛脫氫酶活性的多核苷酸；和編碼來源于粗糙脈孢菌的γ-丁酰甜菜堿羥化酶活性的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的微生物，其為大腸桿菌(Escherichia coli)。
3.權(quán)利要求1的微生物，其為大腸桿菌KCCM-10581。
4.權(quán)利要求1的微生物，其中所述編碼N-三甲基賴氨酸羥化酶活性的多核苷酸編碼SEQ ID NO13所列出的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1的微生物，其中所述編碼3-羥基-6-N-三甲基賴氨酸醛縮酶活性的多核苷酸編碼SEQ ID NO14所列出的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的微生物，其中所述編碼γ-三甲基氨基醛脫氫酶活性的多核苷酸編碼SEQ ID NO15所列出的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的微生物，其中所述編碼γ-丁酰甜菜堿羥化酶活性的多核苷酸編碼SEQ ID NO16所列出的氨基酸序列。
8.生產(chǎn)L-肉堿的方法，該方法包括在底物的存在下培養(yǎng)權(quán)利要求1至7中任何一項的微生物以在培養(yǎng)物中生產(chǎn)L-肉堿，所述底物選自由下列各項組成的組ε-N-三甲基賴氨酸，β-羥基-N-三甲基賴氨酸，γ-N-三甲基氨基丁醛，γ-丁酰甜菜堿，及其混合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述底物的濃度范圍為基于培養(yǎng)基重量的0.1至10wt％，所述底物選自由下列各項組成的組ε-N-三甲基賴氨酸，β-羥基-N-三甲基賴氨酸，γ-N-三甲基氨基丁醛，γ-丁酰甜菜堿，及其混合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了屬于腸桿菌科的微生物，其包括編碼來源于粗糙脈孢菌的N－三甲基賴氨酸羥化酶活性的多核苷酸；編碼來源于粗糙脈孢菌的3－羥基－6－N－三甲基賴氨酸醛縮酶活性的多核苷酸；編碼來源于粗糙脈孢菌的γ－三甲基氨基醛脫氫酶活性的多核苷酸；和編碼來源于粗糙脈孢菌的γ－丁酰甜菜堿羥化酶活性的多核苷酸。還提供了使用所述微生物生產(chǎn)L－肉堿的方法。
文檔編號C12N9/04GK101068925SQ200580041123
公開日2007年11月7日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日
發(fā)明者李炳旭, 姜歡求, 樸英薰, 高恩圣, 鄭成五, 朱哉映 申請人:Cj株式會社