一株過表達gtp 環(huán)式水解酶基因的重組高山被孢霉、其構(gòu)建方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株過表達GTP環(huán)式水解酶基因的重組高山被孢霉、其構(gòu)建方法及應用。本發(fā)明構(gòu)建了四氫生物蝶呤合成途徑中GTPCH1基因的過表達工程菌株，以探索BH4在高山被孢霉脂質(zhì)合成過程中的作用。本發(fā)明利用根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化構(gòu)建了一株過表達GTPCH1基因的重組菌株。重組菌株中GTPCH1基因的相對表達水平提高2倍左右，總脂含量比野生型高山被孢霉提高了約37％，同時NADPH的相對含量提高了2倍左右。這表明GTPCH1在脂質(zhì)合成過程中具有重要作用，很可能是脂質(zhì)合成所需NADPH的重要調(diào)控因素。此發(fā)明為深入解析高山被孢霉脂質(zhì)合成機理，使之成為生產(chǎn)功能性脂質(zhì)的細胞工廠提供理論依據(jù)。CGMCC No. 1223420160314
【專利說明】一株過表達GTP環(huán)式水解酶基因的重組高山被孢霉、其構(gòu)建 方法及應用 【技術(shù)領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及基因工程領域，特別是一株在過表達GTPCHl基因的高山被孢霉，還涉 及構(gòu)建方法與用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指具有兩個或兩個以上雙鍵且碳原子數(shù)為18-22的直 鏈脂肪酸。PUFAs為人體健康所必需，它可以治療和預防心腦血管疾病，促進生長發(fā)育，并且 對抗癌、延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)、減肥等均具有重要的生理作用。PUFAs的傳統(tǒng)來源主要包括植 物油和深海魚油，但隨著市場對PUFAs需求的日益增長，使得油脂需求量的增加與自然資源 嚴重短缺的矛盾愈發(fā)尖銳，人們開始尋找新的替代資源。與傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)工藝相比較，利 用微生物生產(chǎn)油脂具有油脂含量高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，因此，開辟微生物油 脂這一新的油脂資源具有重要的現(xiàn)實意義。高山被孢霉油脂合成能力很強，油脂含量可達 細胞干重的50%以上。
[0003] 目前，國內(nèi)外對高山被孢霉脂質(zhì)合成機理的研究主要集中在脂肪酸合成途徑中相 關(guān)酶的功能驗證，并由此確定了高山被孢霉PUFAs的代謝通路。已采用的研究手段包括:① 通過物理或化學誘變方法使合成途徑中的某個酶失去活性，然后通過分析PUFAs產(chǎn)物推測 其催化底物的能力;②根據(jù)相關(guān)物種中PUFAs合成途徑中酶基因的序列同源性，對目的基因 進行PCR擴增后將其克隆表達至異源宿主菌進行功能驗證。
[0004] 乙酰輔酶A和NADPH是脂肪合成的關(guān)鍵因素。乙酰輔酶A是脂肪酸的重要底物和前 體，NADPH是脂肪酸合成的還原力來源。通常認為，磷酸戊糖途徑和蘋果酸酶是細胞內(nèi)主要 的NADPH來源。也有研究表明氨基酸代謝和脂質(zhì)合成有重要關(guān)系，如亮氨酸和賴氨酸代謝、 脯氨酸和谷氨酸代謝、絲氨酸代謝、苯丙氨酸代謝等。在高等生物體中，BH 4可能與脂質(zhì)代謝 有關(guān)，包括長鏈多不飽和脂肪酸的累積和ω-氧化，及不飽和脂肪酸與磷脂的結(jié)合。
[0005] 在四氫生物喋呤合成途徑中，GTP環(huán)式水解酶(GTPCH)是冊4合成的限速步驟。BH4的 從頭合成途徑是以三磷酸鳥苷(GTP)為底物，首先通過GTPCH的催化生成二氫蝶呤三磷酸鹽 (H 2NTP),再通過6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)的作用生成6-丙酮酸四氫生物蝶呤 (PPH4)，并被墨蝶呤還原酶(SR)作用生成BH 4 Jang HC等在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，在高山被 孢霉體內(nèi)，BH4可作為苯丙氨酸羥化酶的必須輔助因子參與苯丙氨酸代謝，可能為脂質(zhì)合成 提供乙酰輔酶A和NADPH。因此，BH 4很可能是高山被孢霉脂質(zhì)合成的關(guān)鍵因素。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] 本發(fā)明的目的是以GTPCHl基因為研究對象，試圖獲得一株高產(chǎn)脂肪酸的重組高山 被孢霉。特別是以中國專利申請CN 201310347934.8中公開的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷 型菌株MAU1(CCFM501)為宿主菌株，以中國專利申請?zhí)朇N 201310524221.4中公開的高山被 孢霉重組基因表達系統(tǒng)為基礎，通過根癌土壤桿菌介導的方法過表達GTPCHl基因，使得重 組高山被孢霉菌株具有高產(chǎn)脂質(zhì)的能力，得以將該重組高山被孢霉用于工業(yè)生產(chǎn)油脂。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一株過表達GTP環(huán)式水解酶基因的重組高山被 孢霉(]\1〇1'1:丨6代113 3]^;[1^)]\^661?〇11，該菌株于2016年3月14日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物 研究所，保藏編號為CGMCC No. 12234。
[0008] 根據(jù)一種實施方式，本發(fā)明的高山被孢霉是用含有GTPCHl基因的根癌農(nóng)桿菌 C58C1轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的。
[0009] 優(yōu)選地，該菌株是用含有GTPCHl基因的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl轉(zhuǎn)化根癌農(nóng) 桿菌后，再以含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng) 缺陷型菌株構(gòu)建而成的。
[0010] 本發(fā)明還提供構(gòu)建上述重組高山被孢霉菌株的方法，包括以下步驟：
[0011] 1)以高山被孢霉cDNA為模板，用引物P1/P2進行PCR擴增，獲得編碼GTP環(huán)式水解酶 的基因 GTPCHl;
[0012] 2)借助高山被孢霉基因操作通用載體pBIG2-ura5s-ITs構(gòu)建重組質(zhì)粒pBIG2- ura5s-GTPCHl；
[0013] 3)用構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌；
[0014] 4)用含重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營 養(yǎng)缺陷型菌株；
[0015] 5)篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株，獲得過表達GTPCHl基因的重組高山被孢霉菌株MAeGTPCHl。
[0016] 步驟1)中，引物P1/P2序列如下：
[0017] Pl(Sense):CGGGGTACCGCATGGCAAGCAGCATCGAGAAC
[0018] P2(antisense)：CCGCTCGAGCTAAATCCCACTGCGTCTG
[0019] 根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，上述步驟3)的根癌土壤桿菌為根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)C58Cl〇
[0020] 在本發(fā)明中，上述步驟2)的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的構(gòu)建可參考中國專利 申請CN201310524221.4中公開的內(nèi)容。根據(jù)該申請的記載，首先用PCR的方法從pD4質(zhì)粒上 獲得HPH表達單元，將HPH表達單元用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和XbaI 酶切過的pET28a( + )的多克隆位點(MCS)中，得到質(zhì)粒pET28a-HPHs。利用PCR從高山被孢霉 cDNA中獲得ura5 (乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶；OPRTase)基因，并利用限制性內(nèi)切酶BspHI和 BamHI酶切ura5基因，將酶切過的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切過的質(zhì)粒pET28a-HPHs 中，以替換的hpt基因，構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-ura5s。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI酶切質(zhì)粒 pET28a_ura5s得到ura5s表達單元。將ura5s表達單元替換質(zhì)粒pBIG2RHPH2中的HPH表達單 元，進一步構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2_ura5s。更進一步地在質(zhì)粒pBIG2_ura5s和質(zhì)粒pET28a-HPHs的基礎上，構(gòu)建高山被孢霉基因操作通用載體。用PCR的方法從高山被孢霉基因組中獲 得非編碼的內(nèi)含子DNA片段IT。用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamHI分別對IT基因片段和質(zhì)粒 pET28a-HPHs進行酶切，并通過連接反應將IT片段取代質(zhì)粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到質(zhì) 粒pET28a-ITs。用限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pET28a-ITs得到ITs表達單元。將 ITs表達單元插入到XbaI酶切過的質(zhì)粒pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作通用載體 pBIG2-ura5s-ITs。然后通過基因工程技術(shù)將GTPCHl基因插入高山被孢霉通用載體pBIG2- ura5s_ITs中，構(gòu)建二元表達載體pBIG2_ura5s_GTPCHl。
[0021 ] 上述步驟3)涉及的根癌土壤桿菌為：根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens C58C1(Tsuji G1Fujii S,Fujihara N，et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J] .Journal of General Plant Pathology，2003,69(4) :230-239.)，為本領 域技術(shù)人員可以公開獲得的菌株。在有些文獻中，它也被記載為根癌農(nóng)桿菌C58C1。
[0022]在本發(fā)明中，上述步驟4)涉及的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株是重組高山被 孢霉MAUl (在有些文獻中也被記載為高山被孢霉CCFM501)，該菌株于2013年11月01日保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 8414，該菌株已 在中國專利申請CN 201310347934.8中公開。
[0023] 根據(jù)CN 201310347934.8說明書記載，重組高山被孢霉MAU1(即高山被孢霉 CCFM501)是通過失活高山被孢霉(Mortierella alpina)ATCC32222基因組中編碼乳清酸磷 酸核糖轉(zhuǎn)移酶OPRTase的ura5基因構(gòu)建而成的。其中，ura5基因的失活是通過缺失654bp的 ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而實現(xiàn)的，所使用的同源臂分別是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具體步驟為：首先獲得ura5敲除 基因片段，并進一步構(gòu)建敲除質(zhì)粒pBIG4K0ura5,然后用重組質(zhì)粒pBIG4K0ura5轉(zhuǎn)化根癌農(nóng) 桿菌，最后用經(jīng)轉(zhuǎn)化的含質(zhì)粒pBIG4K0ura5的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉并對轉(zhuǎn)化后的 高山被孢霉進行篩選和鑒定，獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型高山被孢霉CCFM501菌株。
[0024]根據(jù)一種實施方式，上述步驟5)中篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株的方法包括以下步驟：
[0025] a)以4mL生理鹽水來沖刷GY平皿表面，收集孢子液于一個無菌1.5mL離心管中，過 25μι4?| 膜；
[0026] b)用血球計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整為三種孢子濃度梯度IO8個每IOOyUlO6個每IOOyUlO 4 個每IOOyU各取200yL涂布于含有l(wèi)OOyg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上， 25避光培養(yǎng)2-3天；
[0027] c)不定時用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲于含有100yg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭 孢噻肟的SC-CS平板上，25 °C培養(yǎng)2-3天；
[0028] d)觀察高山被孢霉在平板上的生長情況，挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于 GY斜面上；
[0029] e)將上述步驟4)中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次；
[0030] f)將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為過表達GTPCHl基因的重組高山被孢霉菌株，保藏于GY 斜面上；
[0031] g)提取含有GTPCHl基因的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，設計一對與啟動子 和終止子特異性結(jié)合的引物進行PCR驗證：
[0032] P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0033] P4(ant i sense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0034] h)所述重組菌株保藏于GY斜面上。
[0035] 本發(fā)明還涉及上述過表達GTPCHl基因的重組高山被孢霉菌株MAeGTPCHl或利用上 述方法得到的重組高山被孢霉在生產(chǎn)脂肪酸中的用途。
[0036]本發(fā)明在現(xiàn)有的高山被孢霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎上，利用根癌土壤桿菌介導的基因轉(zhuǎn) 化方法，構(gòu)建了在高山被孢霉中過表達GTPCHl基因的工程菌株。所得基因工程菌株經(jīng)過多 次傳代，經(jīng)驗證GTPCHl基因片段仍穩(wěn)定存在基因組中，且重組菌的生長特性與野生型菌株 無明顯差別，重組菌株的脂肪酸含量能夠明顯得到提高，其總脂含量比野生型高山被孢霉 提高了約37%，為高山被孢霉工業(yè)化生產(chǎn)脂肪酸提供了基礎和依據(jù)。
[0037]本發(fā)明的重組高山被孢霉菌株MAeGTPCHl于2016年3月14日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微 生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 12234。 【【附圖說明】】
[0038] 圖1為二元表達載體pBIG2-ura5s-GTPCHl的構(gòu)建示意圖；
[0039]圖2為過表達GTPCHl基因的高山被孢霉重組菌株鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0040] 其中，M為11^迚66~為高山被孢霉野生型對照菌株，1為?8162-11抑58-6了?011轉(zhuǎn)化 的重組菌株。
[0041]圖3為高山被孢霉野生型菌株與過表達重組菌株GTPCHl基因 RT-qPCR的結(jié)果分析 圖；
[0042] 圖4為重組菌株MA-GTPCH1與高山被孢霉野生型菌株NADPH相對含量；
[0043]圖5為重組菌株MA-GTPCH1與高山被孢霉野生型菌株脂肪酸相對組成；
[0044] 其中，M.alpina為野生型對照;MA-GTPCH1為重組菌株。 【【具體實施方式】】
[0045] 以下實施例用于非限制性地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0046] 在本發(fā)明中，如無特殊說明，用于解釋濃度的"％"均為重量百分比、"份"均為重量 份。
[0047]在本發(fā)明中，涉及以下培養(yǎng)基：
[0048] Broth培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，lg/L KH2P〇4,0 · 25g/L MgS〇4 · 7H20，10g/L KN03，pH 6.0。
[0049] MM培養(yǎng)基：1.74g/L K2HP〇4，1.37g/L KH2P〇4,0.146g/L NaCl，0.49g/L MgS〇4 · 7H20,0.078g/L CaCl2,0.0025g/L FeS〇4.7H20,0.53g/L(NH4)2S〇4,7.8g/L MES，1.8g/L葡 萄糖，5g/L甘油，pH 6.8。
[0050] IM培養(yǎng)基是在MM培養(yǎng)基的基礎上添加了200μΜ的乙酰丁香酮(AS)構(gòu)成的。
[00511 YEP培養(yǎng)基：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化鈉，余量為水。
[0052]當采用固體培養(yǎng)基時，在原有培養(yǎng)基組成的基礎上添加20g/L瓊脂。
[0053] SC固體培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源無氨基酸和硫酸銨，1.7g/L硫酸銨， 60mg/L異亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L蘇氨酸，40mg/L賴氨酸，30mg/L酪 氨酸，20mg/lJ泉嘌呤，20π^/1精氨酸，20π^/1組氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L瓊脂，余量為 水，pH 6.8。
[0054] SC-CS培養(yǎng)基是在SC固體培養(yǎng)基的基礎上添加濃度為lOOyg/mL壯觀霉素奇霉素 (8卩6〇1：；[1101115^；[11)和濃度為10(^8/1111^頭抱噻)3虧抗生素(06；1^0丨&1；[111630(1；[11111)。
[0055] GY固體培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g//L硝酸鉀，IgAJ粦酸二氫鈉， 3g/L七水硫酸鎂，20g/L瓊脂，余量為水，pH 6.8。
[0056] GY-U培養(yǎng)基是在GY固體培養(yǎng)基的基礎上添加0. lg/L的尿嘧啶。
[0057] GY-CS培養(yǎng)基是在GY固體培養(yǎng)基的基礎上添加濃度為lOOyg/mL壯觀霉素奇霉素 (spectinomycin)和濃度為100yg/mL頭抱噻H虧抗生素（CefotaximeSodium)。
[0058] SOC復蘇培養(yǎng)基：20g/L胰蛋白胨，5g//L酵母粉，0.5g//L氯化鈉，2.5mM氯化鉀，IOmM 氯化鎂，20mM葡萄糖，余量為水。
[0059] LB固體培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化鈉，20g/L瓊脂，余量為水。 [0060] 實施例1過表達GTPCHl基因的重組高山被孢霉菌株的構(gòu)建 [0061 ] 1.1高山被孢霉GTPCHl的克隆
[0062] 根據(jù)高山被孢霉（M.alpina)ATCC#32222GTPCHl基因的序列信息（http:// www.ncbi .nlm.nih·gov/nuccore/JF746874,genbank索弓丨號JF746874· I)，設計引物P1、P2， 下劃線部分分別為酶切位點KpnI和Xhol，以高山被孢霉cDNA為模板，用引物P1/P2、K0D高保 真聚合酶，進行PCR擴增，得到GTPCHl基因片段（807bp)，其核酸序列及氨基酸序列如 SEQNo .1 和No .2所示。
[0063] PCR 擴增的反應條件為：941€3111丨11，941€3〇8,55 1€3〇8,68°(：1111丨11，30個循環(huán)，681€ 5min;再對PCR產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳驗證。
[0064] Pl(Sense):CGGGGTACCGCATGGCAAGCAGCATCGAGAAC
[0065] P2(antisense)：CCGCTCGAGCTAAATCCCACTGCGTCTG
[0066] I · 2二元表達載體的構(gòu)建
[0067] 1.2.1酶切反應
[0068] 首先，用限制性內(nèi)切酶KpnI過夜酶切基因片段GTPCH1的PCR純化產(chǎn)物及載體 pBIG2-ura5s-ITs C3KpnI酶切體系（IOOyL)為：2yL KpnI-HF，30yL質(zhì)粒或PCR產(chǎn)物，IOyL cutsmartBuf f er，58yL 去離子水，37 °C 水浴酶切 12h 〇
[0069] 酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后，再用內(nèi)切酶Xho I單酶切，酶切體系為（IOOyL) :2yL Xho 1，30 yL質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物，IOyL cutsmartBuffer，58yL去離子水，37°C水浴酶切12h后純化。
[0070] 本發(fā)明涉及的內(nèi)切酶緩沖液cut smar t buf f er : 50mM乙酸鉀（Po tass ium acetate)，20mM(Tris-乙酸）Tris-acetate，IOmM乙酸儀（Magnesium acetate)，100μg/ml BSA，余量為水，pH 7.9。
[0071] 1.2.2連接反應
[0072] 用T4連接酶將酶切純化后的基因片段GTPCHl與載體pBIG2-ura5s-ITs連接，4°C下 處理12h，得到重組表達載體為pBIG2-ura5s-GTPCHl。連接體系為（IOyL): IyL目的基因酶切 后片段，3yL載體酶切后片段，IyL連接酶buffer，IyL T4連接酶，4yL無菌水，4°C連接12h。 [0073]重組表達載體電轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞，方法如下：
[0074] 1)無菌狀態(tài)下取IOOyL感受態(tài)細胞，加入l-2yL連接產(chǎn)物，吹吸混勻；
[0075] 2)將上述混勻的感受態(tài)細胞移入預冷過的電轉(zhuǎn)杯中，避免產(chǎn)生氣泡；
[0076] 3)將電轉(zhuǎn)杯放入Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀，調(diào)到合適預設程序檔位，根據(jù)儀器說明電轉(zhuǎn)。電 壓條件為1.8kv;
[0077] 4)電轉(zhuǎn)后的感受態(tài)細胞移入含有ImL SOC復蘇培養(yǎng)基的1.5mL無菌離心管中，37 °C，150rpm孵育1小時；
[0078] 5)取200yL涂布含有100yg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板。倒置37 °C培養(yǎng)過夜。
[0079]挑取陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，測序驗證結(jié)果表明連接成功，獲得二元表達載體 pBIG2-ura5s-GTPCHl〇
[0080]其中，二元表達載體pBIG2-ura5s-GTPCHl電擊轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌的方法參照轉(zhuǎn)化 大腸桿菌T0P10的方法，得到含有質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤桿菌C58C1。
[0081 ] 1.3根癌土壤桿菌介導轉(zhuǎn)化高山被孢霉CCFM501
[0082]在已有的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化方法的基礎上介導轉(zhuǎn)化高山被孢霉，具體過程如下： [0083] 1)將保存于-80°C的含有質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤桿菌C58C1在含有 100yg/mL利福平和100yg/mL卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基平板上劃線。28°C倒置避光培養(yǎng)48 小時；
[0084] 2)挑取單克隆接種至20mL含有l(wèi)OOyg/mL利福平和lOOyg/mL卡那霉素的液體YEP培 養(yǎng)基中28 °C，200rpm避光培養(yǎng)24-48小時；
[0085] 3)200yL轉(zhuǎn)接于MM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48小時；
[0086] 4)轉(zhuǎn)接至頂培養(yǎng)基中，調(diào)整菌濃度至OD6qq為0.3。置于28°C，200rpm搖床避光培養(yǎng) 至0D_到1.0左右；
[0087] 5)用500yL滅菌的生理鹽水沖刷在GY-U斜面培養(yǎng)1個月以上的高山被孢霉尿嘧啶 營養(yǎng)缺陷性菌株MAU1 (即高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷性菌株CCFM50 1，可參考CN 201310347934.8的專利申請中公開的M.alpina尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株），收集孢子，用血球 計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整孢子濃度到IO 7個每IOOyL;
[0088] 6)取IOOyL根癌土壤桿菌與IOOyL孢子混合，均勻涂布于鋪有玻璃紙的頂固體培養(yǎng) 基上。23 °C避光培養(yǎng)36-48小時；
[0089] 7)將玻璃紙轉(zhuǎn)移到含有l(wèi)OOyg/mL壯觀霉素和lOOyg/mL頭孢噻肟抗生素的SC平板 (SC-CS)上。18°C避光培養(yǎng)12h，隨后轉(zhuǎn)移至25°C培養(yǎng)；
[0090] 8)持續(xù)觀察菌落在SC-CS平板上的生長情況，若長出明顯菌落，及時用尖頭鑷子將 菌落外沿挖出（大約2mm 2)，接種于SC-CS平板上，繼續(xù)正置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0091] 9)待SC-CS平板上的轉(zhuǎn)化子長出后，挑菌絲轉(zhuǎn)接于SC-CS平板，重復篩選3次，排除 陰性轉(zhuǎn)化子；
[0092] 10)將篩選3次后生長的菌落接種至GY平板，28°C培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子，保藏在4 cC。
[0093] 1.4高山被孢霉過表達GTPCHl工程菌株篩選和鑒定
[0094] 1)用3mL生理鹽水沖刷GY表面，收集液體于一個無菌1.5mL離心管中，過25μηι濾膜；
[0095] 2)用血球計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整為三種孢子濃度梯度IO8個每IOOyUlO 6個每IOOyUlO4 個每100yL，分別取200yL涂布于含有l(wèi)OOyg/mL壯觀霉素和lOOyg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板 上，25 °C避光培養(yǎng)2-3天；
[0096] 3)隨時用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲SC-CS平板上，25°C培養(yǎng)2-3天；
[0097] 4)觀察高山被孢霉在平板上的生長情況，挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于 GY斜面上；
[0098] 5)將上述步驟4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次；
[0099] 6)將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為過表達GTPCHl基因的重組高山被孢霉菌株，保藏于GY 斜面上；
[0100] 7)提取鑒定正確的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，用一對與啟動子和終止子 特異性結(jié)合的引物進行PCR驗證：
[0101] P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0102] P4(ant i sense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC；
[0103] 通過瓊脂凝膠電泳分析來鑒定重組菌株，結(jié)果如圖2。泳道1的兩條產(chǎn)物條帶分別 為ura5(818bp)和GTPCHl(GTPCH1807bp加載體上164bp共971bp)兩個表達單元，電泳結(jié)果表 明二元表達載體成功整合到高山被孢霉基因組中。
[0104] 8)所述重組菌株保藏于GY斜面上。
[0105] 實施例2重組菌株MA-GTPCH1中GTPCHl基因轉(zhuǎn)錄水平的RT-qPCR檢測
[0106] 2.1 RT-qPCR 引物設計
[0107] 根據(jù)GTPCHl序列和內(nèi)參18SrDNA序列設計引物如下：
[0108] P5(sense)：GACGGCCTTAGCTTCCCAAG
[0109] P6(ant i sense)：CGAACTGCCTCTGCAATCCT
[0110] P7(sense)：CTATTGGCGGAGGTCTATTCGT
[0111] P8(ant i sense)：GCACGCATTCGGATAATTGGT
[0112] 2.2高山被孢霉總RNA提取
[0113] I)取約0.1 g菌體于預冷且滅酶研缽中，加液氮充分研磨；
[0114] 2)加入ImL Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)繼續(xù)研磨成粉末狀后，室溫溶 解；
[0115] 3)將溶解后液體用無酶槍頭吸出約ImL于無酶離心管中，添加200yL三氯甲烷顛倒 混勻，室溫放置2min;
[0116] 4)12000rpm，4°C離心15min，吸取上層水相于新的無酶離心管中；
[0117] 5)添加等體積異丙醇，顛倒混勾，室溫放置1〇111；[11，12000印111，4<€，離心15111；[11 ;
[0118] 6)用無酶槍頭吸去異丙醇；
[0?19] 7)添加 ImL新配75體積％乙醇，12000rpm，4°C，離心15min后，去上清；
[0120] 8)室溫放置干燥，用IOOyL無酶水溶解RNA沉淀，-80 °C保存；
[0121] 9)濃度測定:取IyL RNA用Nanodrop 2000測定濃度；
[0122] 10)變性膠電泳檢測RNA完整性:取Iyg RNA在1 · 2 %的變性膠(含1 · 5 %甲醛）中電 泳，觀察RNA完整性。
[0123] 2.3反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及RT-qPCR檢測
[0124] 取0.5_lyg總RNA為模板，根據(jù)PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa,Otsu, Shiga,Japan)試劑盒說明進行操作，獲得重組菌株的cDNA。使用ABI-Prism 7900sequence detection system(Applied Biosystems,CA)按照SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems ,CA)的說明進行 RT-qPCR 反應。
[0125] 反應體系為20yL，其中含PowerSYBR⑩Green PCRMaster Mix 10yL，引物各lyL， cDNA 2yL，純水7μΙ^ΡΟ?程序為95°C，10秒，60°C，10秒進行40個循環(huán)。18S rDNA作為管家基 因。利用2+Aet)計算基因轉(zhuǎn)錄水平倍數(shù)變化，其中Δ Δ Ct為Δ Ct(樣品)_ Δ Ct(參照）。
[0126] RT-qPCR結(jié)果如圖3所示，M.alpina為野生型對照，MA-GTPCH1為重組菌株，分別培 養(yǎng)3天和8天;與對照組相比，在分別培養(yǎng)3d和8d后，過表達菌株中的GTPCHl基因的轉(zhuǎn)錄水平 是對照菌株的2倍多，說明轉(zhuǎn)化的GTPCHl基因表達原件成功實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄及過量表達。
[0127] 實施例3高山被孢霉NADPH提取與檢測
[0128] NADPH提取采用NADP/NADPH測定試劑盒(Biovision公司），根據(jù)說明書并做細微改 進進行。
[0129] 1)稱取0· Ig濕菌體于2mL EP管中，加入ImL NADP/NADPH Extration buffer，組織 破碎儀破碎后，置于冰上lOmin，離心（1000Xg，IOmin);
[0130] 2)轉(zhuǎn)移上清至IOKDa超濾管中，過濾除去酶；
[0131] 3)剩余步驟參考說明書進行；
[0132] 計算出NADPH質(zhì)量后，結(jié)合高山被孢霉酶菌體干濕重比算出NADPH重量/菌體重量 (mg/g)，結(jié)果如圖4所示，重組菌株MA-GTPCH1中的NADPH水平均高于對照菌株，3天時，重組 菌株MA-GTPCH1的NADPH含量相對野生型高山被孢霉提高了 2.4倍左右，8天為2倍左右。進一 步證明了過量表達的GTPCHl對細胞內(nèi)的NADPH水平產(chǎn)生了影響。
[0133] 實施例4高山被孢霉脂肪酸提取與檢測 [0134] 4 · 1高山被孢霉脂肪酸提取
[0135] 采用鹽酸反復凍融破壁的方式，用有機溶劑提取高山被孢霉干菌體中油脂：
[0136] 1)將高山被孢霉野生型菌株與實施例1獲得的高山被孢霉過表達GTPCHl重組菌株 MA-GTPCH1接種于broth培養(yǎng)基中，28°C，200r/min搖床培養(yǎng)7天；
[0137] 2)收集菌體后真空冷凍干燥，并稱重計算生物量；
[0138] 3)用研缽將菌體研磨成粉末，精確稱取50mg菌粉于提脂瓶，加入2mL 4mol/L鹽酸；
[0139] 4)80°C水浴lh，-80°C 15min。重復一次且震蕩混勻。80°C水浴lh;
[0140] 5)冷卻至室溫，加入ImL甲醇，震蕩混勻；
[0141 ] 6)加入ImL氯仿，震蕩IOmin AOOOg離心3min。小心吸取下部氯仿于新提脂瓶中；
[0142] 7)重復步驟(6)兩次；
[0143] 8)合并氯仿（約3mL)，加入ImL飽和氯化鈉，震蕩混勻，3000g離心3分鐘。收集氯仿 層于新提脂瓶中。再繼續(xù)加入ImL氯仿于原瓶，3000g離心3分鐘。合并氯仿(約4mL);
[0144] 9)氮吹干燥。
[0145] 4.2脂肪酸組成及含量的測定:方法如下
[0146] 1)分別向上述粗脂中分別加入IOOyL 2.02mg/ml內(nèi)標C15:0和ImL 10%鹽酸甲醇 溶液，60 °C水浴3h，每隔半小時振蕩Imin;
[0147] 2)冷卻至室溫后加入ImL正己烷和ImL飽和NaCl溶液，震蕩混勻，4000rpm離心 3min，吸出正己烷層于新瓶；
[0148] 3)再加入ImL正己燒，震蕩混勾，4000rpm離心3min，吸出并合并正己燒；
[0149] 4)氮吹干燥后，加入ImL正己烷，混勻后轉(zhuǎn)入氣相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；
[0150] 5)脂肪酸甲酯分析采用GC_2010(Shimadzu Co.，Japan)，色譜柱為 DB-Waxetr (301^0.32111111，0.22以111)。氫火焰離子檢測器檢測，氣化室和檢測器溫度分別為240°(：和260 °C，分流方式進樣IyL，分流比10:1，載氣為氮氣。程序升溫:初始溫度120°C保持3min，以5 °C/min升到190°C，再以4°C/min升到220°C，保持20min。通過與商業(yè)化的脂肪酸甲酯標準品 (37種脂肪酸甲酯混標，Supelco，USA)和加入內(nèi)標C15:0的質(zhì)量比較，定性、定量分析樣品中 脂肪酸組分。
[0151] 其中總脂肪酸含量用每克干重菌體中總脂肪酸的質(zhì)量表示。表1是野生型高山被 孢霉與重組菌株MA-GTPCH1脂肪酸的組成。
[0152] 表1高山被孢霉野生型菌株與重組菌株MA-GTPCH1脂肪酸組成比較
[0154] 表1和圖5表明，本發(fā)明得到的重組菌株MA-GTPCH1實現(xiàn)了GTPCHl基因過量表達， MA-GTPCH1的總脂肪酸含量(TFA)相比野生型高山被孢霉提高了 37%，其中C20:4(花生四烯 酸)產(chǎn)量提高了78%，由此也證明了高山被孢霉脂質(zhì)合成和BH4合成途徑的相關(guān)性。對高山 被孢霉分子改造來解析脂質(zhì)合成機理，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)功能性脂質(zhì)提供了理論依據(jù)。
[0155] 雖然本發(fā)明專利已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉 此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種改動與修飾。因此本發(fā)明的保護 范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一株過表達6了?環(huán)式水解酶基因的重組高山被孢霉1^66了?〇11，該菌株于2016年3月 14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 12234。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組高山被孢霉，其特征在于所述高山被孢霉是用含有 GTPCH1基因的根癌農(nóng)桿菌C58C1轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組高山被孢霉菌株，其特征在于該菌株是用含有GTPCH1基 因的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌后，再以含轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCH1的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株構(gòu)建而成的。4. 構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組高山被孢霉菌株的方法，包括以下步驟： 1) 以高山被孢霉cDNA為模板，用引物P1/P2進行PCR擴增，獲得編碼GTP環(huán)式水解酶的基 因 GTPCH1; 2) 借助高山被孢霉基因操作通用載體pBIG2-ura5s-ITs構(gòu)建重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCH1； 3) 用構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌； 4) 用含重組質(zhì)粒pBIG2-ura5s-GTPCHl的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺 陷型菌株； 5) 篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株，獲得過表達GTPCH1基因的重組高山被孢霉菌株MAeGTPCHl。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟1)中，引物P1/P2序列如下： Pl(sense)：CGGGGTACCGCATGGCAAGCAGCATCGAGAAC P2(ant i sense):CCGCTCGAGCTAAATCCCACTGCGTCTG。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟3)的根癌土壤桿菌為根癌土壤桿 菌（Agrobacterium tumefaciens)C58Cl〇7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟4)的高山被孢霉尿嘧啶營養(yǎng)缺陷 型菌株是重組高山被孢霉MAU1，該菌株于2013年11月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.8414。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述步驟5)中篩選鑒定轉(zhuǎn)化菌株的方 法包括以下步驟： a) 以4mL生理鹽水來沖刷GY平皿表面，收集孢子液于一個無菌1.5mL離心管中，過25μηι 濾膜； b) 用血球計數(shù)器計數(shù)，調(diào)整為三種孢子濃度梯度108個每100yL、106個每100yL、10 4個每 l〇〇yL，各取200yL涂布于含有100yg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭孢噻肟的GY-CS平板上，25避 光培養(yǎng)2-3天； c) 不定時用無菌鑷子挑出生長的真菌菌絲于含有100yg/mL壯觀霉素，100yg/mL頭孢噻 肟的SC-CS平板上，25°C培養(yǎng)2-3天； d) 觀察高山被孢霉在平板上的生長情況，挑出在SC-CS平板上生長的菌絲接種于GY斜 面上； e) 將上述步驟4)中斜面上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上傳代三次； f) 將穩(wěn)定遺傳的菌株鑒定為過表達GTPCH1基因的重組高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面 上； g) 提取含有GTPCH1基因的重組高山被孢霉菌株的基因組DNA，設計一對與啟動子和終 止子特異性結(jié)合的引物進行PCR驗證： P3(sense)：CACACACAAACCTCTCTCCCACT P4(ant i sense)：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC； h) 所述重組菌株保藏于GY斜面上。9.權(quán)利要求1-3中任一項權(quán)利要求所述的過表達GTPCH1基因的重組高山被孢霉菌株 MAeGTPCHl或利用權(quán)利要求4-9中任一項權(quán)利要求所述的方法得到的重組高山被孢霉在生 產(chǎn)脂肪酸中的用途。
【文檔編號】C12R1/645GK105861339SQ201610427554
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】王鴻超, 陳永泉, 陳海琴, 陳衛(wèi), 張陳, 顧震南, 張灝
【申請人】江南大學