專利名稱：干物質(zhì)(dm)含量高的生物質(zhì)的酶水解的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種將含有多糖、具有高的干物質(zhì)含量且優(yōu)選具有纖維和平均粒度大的粒子的生物質(zhì)液化和糖化的方法。此外，本發(fā)明還涉及由此加工的生物質(zhì)的進一步應用，例如用于后續(xù)發(fā)酵成生物乙醇、食品和飼料的專用碳水化合物以及用于加工成塑料和化學品的碳原料。
背景技術(shù)：
許多工業(yè)和農(nóng)業(yè)過程，例如城市運轉(zhuǎn)、食品和飼料加工和林業(yè)都產(chǎn)生含有聚合糖類的生物質(zhì)、廢物和副產(chǎn)物，所述聚合糖類例如為淀粉、纖維素和半纖維素的形式。農(nóng)業(yè)綜合企業(yè)和化工業(yè)以及公共組織對開發(fā)將該類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成價值更高的材料的方法具有相當大的興趣。因此，例如使用微生物和/或水解酶可將該類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物乙醇、生物氣或化學品。然而，目前已知的大多數(shù)方法由于生產(chǎn)成本高、能量需求高以及由此所具有不確定的經(jīng)濟可行性，它們都尚未實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)實踐。
除了作為食品和飼料重要之外，源自生物質(zhì)的碳水化合物還可用作許多工業(yè)方法的原料。以聚合物的形式，眾所周知的產(chǎn)品是其中纖維素為主要組分的紙。然而，當加工成低聚物和單體時，碳水化合物是許多工業(yè)方法的重要原料。正如要詳細描述的那樣，它們是許多微生物方法所必需的，但此外，它們還可以用作例如酶催加工成為食品和飼料專用碳水化合物如海藻糖的原料。碳水化合物低聚物和單體也可以代替石油化學品用于加工成塑料和有機化學品。此外，碳水化合物可以用作催化氫化作用中的氫載體。
因此，顯然，若成本低且來源豐富的加工得到的碳水化合物可用于工業(yè)加工，則其可具有巨大的經(jīng)濟潛力。
淀粉是植物中最普遍儲存的碳水化合物且以顆粒形式存在，其大小和物理性質(zhì)在種屬間有明顯差異。淀粉顆粒通常非常耐水和水解酶的滲透，這是由于在相同分子內(nèi)和與其它相鄰分子形成了氫鍵。然而，當升高懸浮液溫度時，這些分子內(nèi)和分子間氫鍵可變?nèi)?。當加熱淀粉的水懸浮液時，氫鍵變?nèi)酰晃涨业矸垲w粒溶脹。因為形成的溶液呈凝膠狀的高粘稠度，該過程通常被稱為膠凝化。在化學上，淀粉是葡萄糖的天然聚合物，其通常在室溫下不能溶于但可分散在水中，由類似于纖維素的重復單元的重復單元構(gòu)成，并且通過α-1，4和α-1，6糖苷鍵連接在一起，這與纖維素的β-1，4糖苷鍵正相反。所述單元或形成稱為直鏈淀粉的直鏈組分，或形成稱為支鏈淀粉的支鏈組分。大多數(shù)植物種子、谷粒和塊莖含有約20-25％的直鏈淀粉。但某些植物，例如豌豆淀粉具有60％的直鏈淀粉，并且某些種類玉米具有80％直鏈淀粉。諸如大米的蠟狀谷類的直鏈淀粉含量低。
除了淀粉外，植物生物質(zhì)的三種主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，它們通常被專業(yè)術(shù)語稱為木質(zhì)纖維素。“含有多糖的生物質(zhì)”作為專業(yè)術(shù)語包括淀粉和木質(zhì)纖維素生物質(zhì)這兩類。
纖維素、半纖維素和木質(zhì)素以不同的量存在于不同的植物和不同的植物部分中，并且它們緊密結(jié)合形成植物的結(jié)構(gòu)骨架。
纖維素是完全由通過β-1，4-糖苷鍵連接在一起的D-葡萄糖組成且具有高達10,000的聚合度的同多糖。纖維素的直鏈結(jié)構(gòu)使分子內(nèi)和分子間氫鍵都得以形成，這導致纖維素鏈聚集成微纖維。具有高度秩序的微纖絲內(nèi)部區(qū)域被稱為晶態(tài)，秩序差的區(qū)域被稱為無定形態(tài)。微纖維裝配成纖絲，纖絲又形成纖維素纖維。纖維素的部分晶態(tài)結(jié)構(gòu)與微纖維型排列一起，賦予了纖維素高的拉伸強度，這使得纖維素不溶于大多數(shù)溶劑，并且這是纖維素耐微生物降解，即酶水解的一部分原因。
半纖維素是復合的異多糖，由許多單體殘基組成D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸和4-O-甲基-D-葡糖醛酸。半纖維素具有低于200的聚合度、具有側(cè)鏈且可被乙?；Ｔ谥T如冷杉、松樹和云杉的軟木中，半乳葡甘露聚糖和阿拉伯-4-O-甲基-葡糖醛酸木聚糖是主要的半纖維素部分。在諸如樺樹、白楊樹、山楊樹或橡樹等的硬木中，4-O-乙?；?4-甲基-葡糖醛酸木聚糖和葡甘露聚糖是主要的半纖維素成分。諸如稻、小麥、燕麥和軟枝草(switch grass)等的禾草具有主要由葡糖醛酸阿糖基木聚糖組成的半纖維素。
木質(zhì)素是通過苯基丙烷單元聚合形成的復雜網(wǎng)絡，且其構(gòu)成了木質(zhì)纖維素中的最豐富的非多糖部分。木質(zhì)素中的三種單體是對香豆純(p-coumaryl alcohol)、松柏醇和芥子醇，它們最經(jīng)常通過芳基甘油基-β-芳基醚鍵連接。木質(zhì)素連接于半纖維素并嵌入碳水化合物中從而提供保護免受微生物降解和化學降解。
如上所述，使用微生物和/或水解酶具有可將經(jīng)加工的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物乙醇或化學品的潛力，或者可以將源自經(jīng)加工的生物質(zhì)的碳水化合物用作許多工業(yè)方法的原料，例如酶加工成食品或飼料用的專門碳水化合物或在塑料和有機化學品的制造中作為石油化學品的替代品。此外，本發(fā)明的生物質(zhì)中的碳水化合物的加工可以與非碳水化合物組分的分離和分餾相結(jié)合。本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的用途是作為生物乙醇生產(chǎn)方法的集成部分。
由含有多糖的生物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇可分成三步1)預處理，2)將多糖水解成可發(fā)酵碳水化合物，3)將碳水化合物發(fā)酵。
若后續(xù)的多糖水解(例如酶水解)需要破壞植物材料的另外保護結(jié)構(gòu)(例如木質(zhì)素)，則預處理是需要的。已知幾種預處理技術(shù)。對于谷物和谷粒，預處理可以為簡單干磨的形式以使表面易于接觸，但對于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，還需要熱和/或化學方法。例如由精制淀粉構(gòu)成的含多糖生物質(zhì)在酶加工前不需要所述預處理方法。預處理方法可基于酸性水解、蒸汽噴發(fā)、氧化、用堿或乙醇等萃取。預處理技術(shù)的共同特征在于，與可能添加的反應物的作用相結(jié)合，這些技術(shù)利用了植物材料在100℃之上的溫度出現(xiàn)軟化和松散。
在利用含多糖生物質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇或其他生物化學品中，預處理之后的下一步驟是將釋放的淀粉、纖維素和半纖維素水解成可發(fā)酵的糖。如果按酶法進行，則這需要大量的具有不同作用模式的不同酶。酶可以外部添加或者在生物質(zhì)上生長的微生物可提供酶。
通過糖水解纖維素酶(carbohydrolytic cellulases)將纖維素水解成葡萄糖。纖維素水解體系的普遍理解將纖維素酶分成三類；外切-1，4-β-D-葡聚糖酶或纖維素生物水解酶(CBH)(EC 3.2.1.91)，其由纖維素鏈末端切下纖維二糖；內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4)，其水解纖維素鏈中任意的內(nèi)部β-1，4-糖苷鍵；1，4-β-D-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)，其將纖維二糖水解成葡萄糖并還由纖維素寡糖中切下葡糖糖。
半纖維素中的不同糖通過半纖維素酶釋放。半纖維素水解體系由于半纖維素的異質(zhì)性而比纖維素水解體系更復雜。所述體系尤其包括內(nèi)切-1，4-β-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)，其水解木聚糖鏈中的內(nèi)鍵；1，4-β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)，其從非還原末端進攻低聚木糖并釋放木聚糖；內(nèi)切-1，4-β-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，其斷裂內(nèi)鍵；1，4-β-D-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)，其將甘露寡糖斷裂為甘露糖。側(cè)基通過多種酶去除；α-D-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、α-D-葡糖苷醛酸酶(EC 3.2.1.139)、肉桂酰酯酶(EC 3.1.1.-)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)和阿魏酰酯酶(EC 3.1.1.73)。
用于淀粉水解的最重要的酶是α-淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶(EC 3.2.1.1)。這些是斷裂1，4-α-D-糖苷鍵并可以繞過但不能水解1，6-α-D-糖苷支化點的內(nèi)切作用水解酶。然而，外切作用淀粉糖化酶如β-淀粉酶(EC 3-2.1.2)和支鏈淀粉酶(EC 3.2.1.41)也可以用于淀粉水解。淀粉水解主要得到葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、α-糊精和各種量的寡糖。當使用基于淀粉的水解產(chǎn)物用于發(fā)酵時，可有利地添加蛋白水解酶。這類酶可以防止微生物絮凝并可以產(chǎn)生微生物可用的氨基酸。
在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的預處理和酶水解的結(jié)合中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用氧化酶可對整個水解以及對用于例如后續(xù)發(fā)酵的微生物的生存力具有積極效果。該效果的原因是由氧化性酶引起的木質(zhì)素與其他酚類抑制劑的氧化性交聯(lián)。通常，漆酶(EC 1.10.3.2)或過氧化物酶(EC1.11.1.7)外部施用或通過在所用微生物中引入漆酶基因而施用。
前面已經(jīng)描述了生物質(zhì)的酶水解。然而，在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的情況下，通過該類方法僅成功水解了由平均尺寸低于1英寸(25.4mm)的纖維和粒子構(gòu)成并且還具有較低干物質(zhì)含量(即低于20％(w/w))的材料。
US4409329描述了將固體纖維素材料水解成糖，其中通過用纖維素酶復合物處理含30-80％(w/w)纖維素的3-20％(w/w)固體進料的顆粒狀漿液，從而將纖維素水解成單糖。所述含固體纖維素的進料具有直徑為0.01-1英寸(0.0254-25.4mm)的平均粒度。使用多孔動葉片進行混合。
US2002117167A描述了生物質(zhì)材料中的半纖維素的酶水解，包括將至少一部分半纖維素溶解并將溶解的半纖維素水解以產(chǎn)生至少一種單糖。所用生物質(zhì)優(yōu)選為原料或預處理材料的含水漿液。生物質(zhì)材料可以是包括半纖維素的任意纖維素材料。據(jù)述，該方法對諸如玉米、小麥、稻、燕麥或大麥的谷粒纖維特別有效。
US2004005674A描述了一種將木質(zhì)纖維素酶水解的方法。木質(zhì)纖維素到糖的降解包括使木質(zhì)纖維素與至少一種輔助酶和至少一種纖維素酶接觸。所述木質(zhì)纖維素材料被研磨(未進一步具體規(guī)定該材料的平均纖維尺寸)且其干物質(zhì)含量低(在10mL酶溶液中具有0.2g研磨的谷草材料)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種將含有多糖的生物質(zhì)液化和糖化的方法，所述生物質(zhì)具有相對高的干物質(zhì)含量，優(yōu)選20％以上，且優(yōu)選由相對較大的纖維和粒子組成，其中較大的纖維和粒子優(yōu)選具有的纖維和粒子尺寸分布為至少20％(w/w)生物質(zhì)在26-70mm范圍內(nèi)。此外，該方法特別適用于主要由淀粉、精制淀粉、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的含多糖生物質(zhì)如谷粒或小麥桿的液化和糖化。在木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的情況下，其優(yōu)選在110-250℃下經(jīng)1-60分鐘進行預處理，處理的方式要確保纖維素易接觸到酶并同時確保在預處理的生物質(zhì)中發(fā)酵抑制劑的含量有限。本發(fā)明結(jié)合了基于水解酶(包括糖水解酶)和氧化酶的組合酶水解與依賴于確保機械力(主要是剪切力和撕裂力)施用于生物質(zhì)的重力原理的混合類型。優(yōu)選的混合類型例如是諸如鼓式混合機、翻轉(zhuǎn)式混合機或類似的混合裝置的自由降落混合機。
發(fā)明描述就隨后發(fā)酵或其他微生物方法而言，生產(chǎn)濃的糖溶液因改進了體積生產(chǎn)率和降低了下游加工成本而有利。在生產(chǎn)生物乙醇的情況下，若發(fā)酵液含有超過4％的乙醇，則蒸餾的能量需求顯著降低(Galbe andZacchi，2002)。這要求糖濃度在8％以上，對大多數(shù)類型的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，這對應于初始干物質(zhì)含量在20％以上。換言之，需要將干物質(zhì)含量高，優(yōu)選20％以上的含多糖生物質(zhì)進行酶水解，以便能夠隨后生產(chǎn)適于乙醇蒸餾的含生物乙醇的發(fā)酵液。
本發(fā)明方法提供了通常30-50％的酶水解度。然而，在優(yōu)化的條件下，甚至可以獲得更高的酶水解度。經(jīng)液化和糖化的生物質(zhì)因此含有相對大量的葡萄糖、木糖、纖維二糖、木質(zhì)素、未降解纖維素和半纖維素以及仍具活性且適于進一步加工(即發(fā)酵工藝(乙醇、乳酸等))的酶。經(jīng)液化的生物質(zhì)還適于氣化、氫化、有機合成或生產(chǎn)生物氣和飼料。
若含多糖生物質(zhì)是木質(zhì)纖維素類的，則預處理必須確保使木質(zhì)纖維素內(nèi)容物的結(jié)構(gòu)對酶而言更易接觸，并且同時使有害抑制性副產(chǎn)物如乙酸、糠醛和羥甲基糠醛保持很低。實現(xiàn)上述效果的措施有數(shù)種，所有措施都包含使木質(zhì)纖維素材料經(jīng)受110-250℃的溫度1-60分鐘，例如·熱水提取·多階段稀酸水解，該操作在抑制性物質(zhì)形成之前去除溶解的材料·在相對不太嚴格的條件下稀酸水解·堿性濕式氧化·蒸汽噴發(fā)·幾乎任意的預處理，隨后脫毒本發(fā)明的含多糖生物質(zhì)包括任何含聚合糖的材料，所述聚合糖例如淀粉以及精制淀粉、纖維素和半纖維素形式。優(yōu)選干物質(zhì)含量在20％以上的生物質(zhì)。
用于本發(fā)明的酶水解和混合的生物質(zhì)的有關(guān)類型包括源自農(nóng)作物的生物質(zhì)，例如·淀粉，例如含淀粉谷粒和精制淀粉·玉米桿·甘蔗渣·秸稈，例如來自稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜、高梁·軟木，例如樟子松(Pinus sylvesris)、放射松(Pinus radiata)·硬木，例如柳樹(Salix spp.)、桉樹(Eucalyptus spp.)·塊莖，例如甜菜、土豆·谷類，例如來自稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜、高梁和玉米·廢紙、來自生物氣加工的纖維部分、肥料、來由油棕加工的殘渣、城市固體廢物等具有相似干物質(zhì)含量的物質(zhì)。
若含多糖生物質(zhì)是木質(zhì)纖維素類的，則在預處理前可將該材料切成片，其中20％(w/w)生物質(zhì)優(yōu)選在26-70mm范圍內(nèi)。經(jīng)預處理的材料優(yōu)選在進入混合裝置前具有20％以上的干物質(zhì)含量。除了從生物質(zhì)釋放碳水化合物外，預處理工藝殺菌并將生物質(zhì)部分溶解并且同時從木質(zhì)素部分中洗脫氯化鉀。
在本發(fā)明方法中進行的混合達到至少四種目的。
首先，其確保所用酶與含多糖生物質(zhì)(底物)之間的緊密接觸，而所述底物在大多數(shù)情況下是不溶或僅有極少的溶解。
其次，在混合過程中在所述材料上進行的機械操作有助于將較大生物質(zhì)纖維和粒子撕碎并因此有助于增加材料的表面積。這將增加例如纖維素和半纖維素對所用酶的可接觸性。為了進一步增加材料上的機械操作，可向滾筒中加入鋼球或類似裝置與所述材料碰撞。
第三，材料的混合防止高的纖維二糖濃度局部累積，如本領域熟練技術(shù)人員熟知的那樣，所述累積可抑制例如纖維素酶，尤其是纖維素生物水解酶。
第四，纖維素酶的重要性質(zhì)是纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)對酶性能的影響。CBD是纖維素降解酶的功能部分。CBD使水溶性酶粘附在不溶性底物表面(纖維素)上。CBD所提供的酶與纖維素之間的緊密締合增大了酶的催化速率和穩(wěn)定性。為了水解纖維素，酶必須改變CBD在纖維素鏈上的位置。據(jù)信，機械作用，即混合對CBD移動是重要的，并因此對酶沿纖維素鏈的酶作用是重要的。
除了以上所述，應注意的是，傳統(tǒng)上生物質(zhì)的酶水解在裝配有葉輪(例如Rushton渦輪機或lntemig葉輪)的攪拌釜反應器中進行，所述葉輪安裝在與發(fā)酵工業(yè)中所用類似的中心放置的葉輪軸上。由于該裝置，具有高粘度的溶液、非常粘或非常干燥的材料的溶液不能被有效攪拌，而是導致產(chǎn)生攪拌很差或沒有攪拌的區(qū)域。此外，該類溶液的攪拌要求非常大的能量輸入，這有損于生產(chǎn)節(jié)約。采用含多糖生物質(zhì)進行操作，這已預先將可能上限限制在大約20％。本發(fā)明的基于重力的混合原理克服了該問題，并且可以用于干物質(zhì)含量高達80％，優(yōu)選20-50％的含多糖生物質(zhì)。本發(fā)明的重力混合原理可以容易地按比例增加，并除了精制淀粉外，還可以用于所有類型的含有高達超過80％纖維素的生物質(zhì)。
與傳統(tǒng)上用于酶水解的常規(guī)攪拌釜反應器不同，基于重力的混合原理，即鼓式混合機、具有提升生物質(zhì)的旋轉(zhuǎn)軸的混合機或類似的利用自由降落原理的混合裝置，即使在小的功率輸入和高的干物質(zhì)含量下也同時確保有效混合，并還通過重力力進行機械加工/降解，所述重力包括材料與鼓之間的剪切力和撕裂力以及由下落材料和鼓底部間的碰撞產(chǎn)生的力，且同時對于纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD)對酶性能的影響發(fā)揮了積極作用。
盡管非混溶性植物材料，如具有干物質(zhì)含量相對高和纖維及粒子平均尺寸大的含多糖生物質(zhì)的加工，已由固態(tài)發(fā)酵或生物反應器而為公眾所知，其中翻轉(zhuǎn)型混合機用于混合(Giovanozzi等人，2002)，但該原理以前并未在專門的液化/糖化工藝或生物乙醇發(fā)酵工藝中實施。
本發(fā)明提供了一種在較高干物質(zhì)含量下加工生物質(zhì)的方法，如干物質(zhì)含量在20-80％之間，優(yōu)選20-50％之間。此外，本發(fā)明方法確保了有效的液化和糖化，使終產(chǎn)物可以直接用于例如發(fā)酵罐中。
將能夠?qū)⒌矸邸⒗w維素和半纖維素或其部分轉(zhuǎn)化成葡萄糖、木糖和纖維二糖的酶，以天然形式或以引起該類酶累積的微生物形式添加到生物質(zhì)中。參考所用酶的最適宜pH和最適宜溫度調(diào)節(jié)生物質(zhì)的pH和溫度。
取決于酶用量，生物質(zhì)在3-24小時內(nèi)液化和糖化成不含或僅含極少剩余大纖維和粒子的液體。在水解和液化過程中的任意指定時間添加葡萄糖代謝微生物可以增強酶催水解度，因為由此除去了抑制性的酶產(chǎn)物。
發(fā)明詳述可以使用下列優(yōu)選的技術(shù)參數(shù)進行本發(fā)明方法。
·干物質(zhì)含量20-80％，優(yōu)選25-70％，更優(yōu)選25-60％，更為優(yōu)選25-50％或25-40％，最優(yōu)選25-35％·木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的纖維和粒子的尺寸分布0-150mm，優(yōu)選5-125mm，更優(yōu)選10-100mm，更加優(yōu)選15-90mm或20-80mm，最優(yōu)選26-70mm。纖維和粒子的優(yōu)選尺寸分布定義為至少20％(w/w)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)分布在優(yōu)選區(qū)間內(nèi)。
若含多糖的生物質(zhì)是木質(zhì)纖維素類的，則必須進行預處理，例如熱水提取。若選擇水熱預處理，則優(yōu)選下列技術(shù)數(shù)據(jù)·預處理溫度110-250℃，優(yōu)選120-240℃，更優(yōu)選130-230℃，更優(yōu)選140-220℃，更優(yōu)選150-210℃，更優(yōu)選160-200℃，更加優(yōu)選170-200℃，或最優(yōu)選180-200℃·預處理時間1-60分鐘，優(yōu)選2-55分鐘，更優(yōu)選3-50分鐘，更優(yōu)選4-45分鐘，更優(yōu)選5-40分鐘，更優(yōu)選5-35分鐘，更優(yōu)選5-30分鐘，更優(yōu)選5-25分鐘，更優(yōu)選5-20分鐘，最優(yōu)選5-15分鐘·預處理后的干物質(zhì)含量為至少20w/w％。
含多糖生物質(zhì)在重力混合機中的酶處理若使用基于自由下落混合概念的容器，并且是具有用于提升生物質(zhì)的水平放置攪拌軸的反應器形式或類似混合裝置的形式，則優(yōu)選下列技術(shù)數(shù)據(jù)·轉(zhuǎn)動速度0-30rpm，優(yōu)選0-20rpm，更優(yōu)選0-15rpm，更加優(yōu)選0-10rpm，最優(yōu)選0-5rpm。
·周期性變換旋轉(zhuǎn)方向的旋轉(zhuǎn)。
·以預定間隔旋轉(zhuǎn)。
最佳旋轉(zhuǎn)速度取決于容器容積，當在相對小的容器中進行加工時，優(yōu)選的旋轉(zhuǎn)速度因此可能相對高，而當在相對大的容器中進行加工時，它可以相對小。
·用于木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶-纖維二糖酶(例如Novozym 188)-纖維素酶(例如Celluclast 1.5 FG L)·酶用量，以濾紙單位(FPU)/g干物質(zhì)表示。1 FPU等于在本領域技術(shù)人員已知的特定條件下在Whatmann#1濾紙上水解1μmol/min糖苷鍵需要的酶量。然而，酶活性原則上可以以任何可能的形式提供，包括通過添加引起所需酶活性的微生物對應于0.001-15 FPU/g干物質(zhì)，優(yōu)選0.01-10 FPU/g干物質(zhì)，更優(yōu)選0.1-8 FPU/g干物質(zhì)，更優(yōu)選1-7 FPU/g干物質(zhì)，最優(yōu)選低于6 FPU/g·用于含淀粉生物質(zhì)的酶-淀粉加工中的酶α-淀粉酶和葡糖淀粉酶·酶水解的處理時間0-72小時，優(yōu)選1-60小時，更優(yōu)選2-48小時，更優(yōu)選3-24小時，如4-24小時，如6-24小時，如8-24小時，如10-24，如12-24小時，如18-24小時或22小時·酶水解的溫度。根據(jù)所用酶活性的最適宜溫度調(diào)節(jié)0-105℃，優(yōu)選10-100℃，更優(yōu)選15-90℃，更優(yōu)選20-80℃，更優(yōu)選25-70℃，最優(yōu)選30-70℃，如40-45℃或室溫·生物質(zhì)的pH。根據(jù)所用酶活性的最適宜pH調(diào)節(jié)3-12，如5-10，如6-9，如7-8，優(yōu)選4-11。
·酶處理可以批式、流加式或連續(xù)方法進行。
實施例1實驗室規(guī)模酶水解將平均尺寸約40mm、對應于25g干重(＝67.0g預處理的秸桿)的壓制的預處理小麥桿(在180-200℃，逆流水提取5-10分鐘，水與干物質(zhì)流量之比為5∶1)放入塑料袋中。將0.75mL的Novozym 188、3.75mL的Celluclast 1.5 FG L和11.9mL的50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 5.0)混合并噴涂在麥桿上。這得到30％的最終干物質(zhì)含量。酶用量對應于10濾紙單位(FPU)/g干物質(zhì)。
混合機由鼓(長為1.0m且直徑為0.78m)組成，該桶沿長軸具有5根內(nèi)肋以確保材料的適當混合。所述鼓沿水平軸以26rpm的速度旋轉(zhuǎn)。材料的混合/水解在室溫下進行18-24小時。這得到不含任何剩余大纖維的稠糊。具有相同酶用量但沒有進行混合的對照袋沒有顯示出秸桿降解跡象。
在藍色帶蓋的瓶中將酶水解24小時后所得材料的一部分(其量對應于29g干物質(zhì))稀釋至15％干物質(zhì)并加入酵母(Baker酵母，De DanskeSpritfabrikker)。通過氣塞封閉該瓶并在30℃放置72小時，同時以500rpm攪拌。所得液體含有33g/L的乙醇、10g/L的木糖。沒有檢測到葡萄糖，這表明酵母能夠利用水解過程中產(chǎn)生的所有葡萄糖。假定乙醇基于葡萄糖的收率為0.5g乙醇/g葡萄糖，這對應于原始纖維素的轉(zhuǎn)化率為70％。
實施例2中試規(guī)模的酶水解以平均尺寸約40mm、對應于7kg DW(＝20kg預處理的秸桿)的壓制的預處理小麥桿(通過在180-200℃逆流水提取5-10分鐘預處理，水與干物質(zhì)流量之比為5∶1)放入具有傾斜約10°的水平軸的常規(guī)旋轉(zhuǎn)水泥混合機中。該混合機沿長軸具有2根內(nèi)肋以確保材料的混合。在開口上安裝蓋子以避免從混合機中蒸發(fā)。該混合機鼓沿水平軸以29rpm的速度旋轉(zhuǎn)。
將200-1150mL的Celluclast 1.5 FG L和40-225mL Novozym 188加入秸稈中。這得到30％的最終干物質(zhì)含量。酶用量對應于3-15 FPU/g干物質(zhì)。通過添加碳酸鈉將pH調(diào)節(jié)至4.8-5.0。
使用風扇式加熱器將水泥混合機加熱至40-45℃。材料的混合/水解進行22小時。取決于酶用量，這得到不含任何剩余大纖維的粘性或高或低的液體。大約3-5小時后預處理的秸稈降解成糊?；旌?-24小時后，糊變?yōu)檎承砸后w。僅使用預處理小麥稈的對比試驗或使用相同的酶用量但僅在160℃預處理的小麥稈對比試驗沒有顯示出秸桿液化跡象。
使用10-15 FPU/g干物質(zhì)的酶用量，在40-45℃水解24小時后，通過向水泥混合機中添加酵母同時進行糖化和發(fā)酵?？梢詫囟壤鋮s至35℃以下并添加壓榨酵母(Baker酵母，De Danske Spritfabrikker)至基于秸稈初始干物質(zhì)大約為1％(w/w)的濃度。糖化和發(fā)酵在在25℃繼續(xù)48小時。
將所得材料在2500rpm離心15分鐘。通過0.45μm過濾器過濾上清液并在HPLC上分析糖。在15 FPU/g干物質(zhì)的酶用量下，水解24小時后，上清液含有70g/L葡萄糖、30g/L木糖。這相當于原始存在于秸稈中的纖維素和半纖維素的50％水解。使用10 FPU/g干物質(zhì)的酶用量的同時糖化和發(fā)酵得到42g/L乙醇和30g/L木糖。
實施例3液化、水解和發(fā)酵設計水解反應器以便進行液化和水解20％干物質(zhì)以上固體濃度的實驗(

圖1)。反應器由水平放置的分隔成5個獨立室的鼓組成，所述室各為20cm寬且直徑為60cm。在各室中使用安裝有3個漿葉的水平旋轉(zhuǎn)軸用于混合/攪拌。使用1.1kW電動機作為驅(qū)動，且旋轉(zhuǎn)速度在2.5至16.5rpm的范圍內(nèi)可調(diào)。程序控制旋轉(zhuǎn)方向使其每分鐘在順時針和逆時針之間變換兩次。外部的充水加熱套可以將溫度控制在高達80℃。
各室中裝入平均尺寸約為40mm的、壓制的預處理小麥桿(通過在180-200℃逆流水提取5-10分鐘預處理，水與干物質(zhì)流量之比為5∶1)和水，獲得20-40％的初始干物質(zhì)含量。加入比例為5∶1的Celluclast 1.5 FGL和Novozym 188，獲得7 FPU/g干物質(zhì)的酶用量。液化和水解在50℃和4.8-5.0的pH下進行?；旌纤俣葹?.6rpm。通過在液化和水解8小時后將溫度降至32℃，隨后添加基于初始干物質(zhì)為15g/kg的壓榨baker酵母(De Danske Spritfabrikker)進行同時糖化和發(fā)酵。
可以高達40％干物質(zhì)的初始干物質(zhì)含量進行液化和水解(圖2和3)。在40％的初始干物質(zhì)時，可以在96小時后達到80g kg-1的葡萄糖濃度。還可以以SSF操作所述工藝(圖3)，從而降低由葡萄糖累積引起的纖維素酶的產(chǎn)物抑制。還可以使用常規(guī)bake酵母，以高達40％初始干物質(zhì)含量發(fā)酵水解產(chǎn)物。在不完全厭氧的條件下，乙醇在20％、25％、30％、35％和40％干物質(zhì)下理論得到的產(chǎn)率分別為80％、79％、76％、73％和68％。
實施例4整株作物的液化、糖化和發(fā)酵可使用重力混合和纖維素酶、半纖維素酶與淀粉酶的混合物同時加工含木質(zhì)纖維素和淀粉的生物質(zhì)。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)源自由例如玉米稈，例如源自稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜和高梁的秸稈，如甜菜、土豆的塊莖；例如源自稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜和高梁的谷類組成的農(nóng)作物；由軟木如樟子松(Pinussylvesris)、放射松(Pinus radiata)，硬木如柳樹(Salix spp.)、桉樹(Eucalyptus spp.)組成的木材；城市固體廢物，廢紙和類似生物質(zhì)。
使用實施例3中所述水解反應器進行實驗。利用在180-200℃逆流水提取5-10分鐘預處理小麥稈(主要為木質(zhì)纖維素來源)，其中水與干物質(zhì)流量之比為5∶1。使用Kongskilde輥磨機干磨小麥粒(主要為淀粉來源)。以基于干態(tài)為1∶1的比例混合小麥粒和預處理的平均尺寸為約40mm的秸稈。通過添加水調(diào)節(jié)干物質(zhì)至30-40％。以5∶1的比例添加Celluclast 1.5 FG L和Novozym 188，獲得7 FPU/g秸稈干物質(zhì)的酶用量。以3.5g/kg小麥粒的用量使用冷的糖化酶(mash enzyme)NS50033(Novozymes A/S，Bagsvrd，Denmark)進行淀粉水解。液化和水解在50℃和4.8-5.0的pH下進行。8小時后將溫度降至34℃，隨后基于初始干物質(zhì)添加15g/kg的壓榨baker酵母(De DanskeSpritfabrikker)。以僅有30％干物質(zhì)的秸稈進行并行實驗。
與僅用秸稈相比，秸稈與麥粒的混合使葡萄糖在液化和水解步驟中有迅速的初始累積(圖4)。僅使用小麥稈作為唯一底物時，液化和SSF96小時后的乙醇濃度為41g kg-1(圖4)。在使用秸稈和麥粒的實驗中，乙醇濃度達到68g kg-1。
實施例5淀粉和含淀粉材料的低溫液化根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于低溫加工精制淀粉或含淀粉的材料(例如甜菜，土豆，來自稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、高梁的谷類)。根據(jù)實施例4，對于液化和水解淀粉而言，熱預處理不是必需的。另一方面，通常利用干磨來預處理含淀粉的谷粒。將干物質(zhì)含量為20-60％的干磨谷粒裝入重力混合機中。同時添加冷的糖化酶NS50033(Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)或α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。然后可以以一鍋法進行淀粉的完全液化和糖化。酶水解工藝中的溫度和pH范圍由酶限定，并分別在25-60℃，優(yōu)選40-55℃，和pH為3-12，優(yōu)選pH為3-8的范圍內(nèi)。
該方法可與SSF結(jié)合。
引用文獻Galbe，M.，Zacchi，G.(2002).A review of the production of ethanolfrom softwood.Appl.Microbiol.Biotechnol.59618-628。
Giovannozzi-Sermanni，G.，D′Annibale，A.，Perani，C，Porri，A.，F(xiàn)alesiedi，G.(2002).Solid-state bioreactors for the sustainability。
http://www.unitus.it/dipartimenti/dabac/progetti/ssbioreactors/solidstatebioreactor.htmGregg，D.，Saddler，J.N.(1995).Bioconversion of lignocellulosicresidues to ethanolProcess flow-sheet development.Biomass Bioenerg.9287-302。
Mais，U.，Esteghalalian，A.R.，Saddler，J.N.(2002)。Influence ofmixing regime on enzymatic saccharification of steam-exploded softwoodchips.Appl.Biochem.Biotechnol.98-100463-472。
US4409329US2002117167AUS2004005674A
權(quán)利要求
1.一種將具有20％以上干物質(zhì)含量的含多糖生物質(zhì)進行液化和糖化的方法，其特征在于使所述生物質(zhì)經(jīng)受a)酶水解，和b)通過基于重力的混合類型進行混合，提供對生物質(zhì)的機械加工和/或降解。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含多糖生物質(zhì)是木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，源自由例如玉米桿，甘蔗渣，源自例如稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜和高梁的秸稈，如甜菜、土豆的塊莖，源自例如稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜、高梁的谷類組成的農(nóng)作物；由如樟子松、放射松的軟木，如柳樹、桉樹的硬木組成的木材；或城市固體廢物，廢紙，來自生物氣加工的纖維部分，肥料和類似生物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含多糖生物質(zhì)是淀粉，例如含淀粉的谷?；蚓频矸邸?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述含多糖生物質(zhì)是淀粉和木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的混合物，所述淀粉例如含淀粉的谷?；蚓频矸?，所述木質(zhì)纖維素生物質(zhì)源自由例如玉米桿，源自例如稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜和高梁的秸稈，如甜菜、土豆的塊莖，源自例如稻、小麥、黑麥、燕麥、大麥、黑麥、油菜、高梁的谷類組成的農(nóng)作物；由如樟子松、放射松的軟木，如柳樹、桉樹的硬木組成的木材；城市固體廢物，廢紙和類似生物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中含多糖生物質(zhì)的干物質(zhì)含量為25-80％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4中任一項的方法，其中至少20％(w/w)的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)具有26mm以上的纖維尺寸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2或4中任一項的方法，其中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)已經(jīng)受110-250℃之間的熱預處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中利用包括糖水解酶的水解酶和氧化酶的組合進行酶水解。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、3或4中任一項的方法，其中利用水解酶和蛋白水解酶的組合進行含淀粉的谷粒的酶水解。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中酶水解在0-105℃進行。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中含多糖生物質(zhì)的混合依賴于自由降落混合機，例如鼓式混合機、翻轉(zhuǎn)式混合機或類似混合裝置。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中酶水解的處理時間為0-72小時。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其以批式、流加式、連續(xù)或類似方法進行。
14.由權(quán)利要求1-13中任一項的方法生產(chǎn)的物質(zhì)在乙醇生產(chǎn)方法中的應用。
15.由權(quán)利要求1-13中任一項的方法生產(chǎn)的物質(zhì)在乳酸生產(chǎn)方法中的應用。
16.由權(quán)利要求1-13中任一項的方法生產(chǎn)的物質(zhì)在生物氣生產(chǎn)方法中的應用。
17.由權(quán)利要求1-13中任一項的方法生產(chǎn)的物質(zhì)在飼料生產(chǎn)方法中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種將具有相對較高干物質(zhì)含量的含多糖的生物質(zhì)液化和糖化的方法。本發(fā)明結(jié)合了酶水解與依賴于重力原理的混合類型，所述重力原理確保機械力，主要是剪切力和撕裂力作用于生物質(zhì)。此外，本發(fā)明還涉及進一步利用由此加工的生物質(zhì)，例如用于后續(xù)發(fā)酵成乙醇、生物氣、用于食品和飼料的專用碳水化合物以及用于加工成塑料和化學品的碳原料。
文檔編號C12P19/14GK101090962SQ200580040982
公開日2007年12月19日 申請日期2005年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者克勞斯·費爾比, 揚·拉森, 亨寧·約爾根森, 雅各布·維伯-佩德森 申請人:艾爾薩姆工程有限公司, 哥本哈根大學