專利名稱：木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木瓜蛋白酶，尤其涉及木瓜蛋白酶作為Knoevenagel (克腦文蓋爾)反 應(yīng)催化劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶(Papain)廣泛存在于番木瓜莖葉和果實(shí)中，以未成熟果實(shí)乳汁的含 量為最高，可以通過化學(xué)方法(沉淀法)和生物技術(shù)方法制備而得。木瓜蛋白酶屬植物蛋 白酶，簡稱木瓜酶，因其含量高、穩(wěn)定性好，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的酶解能 力，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、鞣革領(lǐng)域。近年來，雖然有關(guān)木瓜蛋白酶的研究工作已有很多報(bào)道，但將其應(yīng)用于有機(jī)化學(xué) 中的經(jīng)典反應(yīng)——Knoevenagel反應(yīng)還從未涉及。Knoevenagel反應(yīng)是羰基化合物與活潑 亞甲基化合物之間的縮合反應(yīng)，是有機(jī)合成中形成碳碳雙鍵的重要反應(yīng)，長期以來受到人 們的高度重視并在工業(yè)上已經(jīng)得到了廣泛的運(yùn)用。Knoevenagel反應(yīng)通常采用的催化劑有堿、Lewis酸、沸石和非均相催化劑等，但 這些催化劑缺乏通用性，當(dāng)羰基化合物為芳香醛時(shí)可以取得較好的催化效果，當(dāng)羰基化合 物為雜環(huán)芳香醛、脂肪醛或α，β-不飽和醛時(shí)催化效果則較差；而且，當(dāng)涉及到反應(yīng)活性 較低的活潑亞甲基化合物的Knoevenagel反應(yīng)時(shí)，通常只能得到很低的產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中的新應(yīng)用。實(shí)際上，本發(fā)明涉及木瓜蛋白酶作為催化劑在Knoevenagel反應(yīng)中的應(yīng)用。本發(fā)明具體是這樣實(shí)現(xiàn)的向含有羰基化合物與活潑亞甲基化合物的反應(yīng)體系中 加入木瓜蛋白酶作為催化劑，反應(yīng)介質(zhì)為二甲亞砜(DMSO)和去離子水(反應(yīng)介質(zhì)中去離子 水的體積百分比為20 32% )，在50 61 °C下攪拌反應(yīng)80 120h，過濾除去木瓜蛋白酶， 稀釋反應(yīng)液，用水洗滌反應(yīng)液2次，萃取水洗液2次，合并有機(jī)層，用水洗滌，減壓蒸餾除去 溶劑，得產(chǎn)物粗品，通過硅膠柱層析分離純化(固定相為200 300目硅膠流動(dòng)相為乙酸乙 酯與石油醚的混合液)，即得最終產(chǎn)物。上述羰基化合物為芳香醛、雜環(huán)芳香醛、脂肪醛或α，β _不飽和醛；上述活潑亞 甲基化合物為1，3-二羰基化合物；上述反應(yīng)中，羰基化合物與活潑亞甲基化合物摩爾用量比為1 1 1 1.2， 優(yōu)選1 1.2 ；羰基化合物與木瓜蛋白酶的用量比為lmmol 50mg Immol 150mg，優(yōu) 選Immol 75mg;羰基化合物與反應(yīng)介質(zhì)的用量比為lmmol 3ml Immol 2ml，優(yōu)選 2mmol 5ml ；反應(yīng)介質(zhì)中去離子水的體積百分比優(yōu)選25%；反應(yīng)溫度(即在反應(yīng)中使用木 瓜蛋白酶的溫度)優(yōu)選60°C ；反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選120h。上述芳香醛優(yōu)選芳香環(huán)上含吸電子取代基的芳香醛，上述雜環(huán)芳香醛優(yōu)選親電性 好的雜環(huán)芳香醛，上述α，β-不飽和醛優(yōu)選含有給電子取代基的α，β-不飽和醛。
上述1，3_ 二羰基化合物為乙酰丙酮或乙酰乙酸乙酯。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明對(duì)已知物質(zhì)木瓜蛋白酶發(fā)掘了新的用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域； 本發(fā)明采用的催化劑木瓜蛋白酶，其資源豐富、價(jià)格經(jīng)濟(jì)、使用安全、對(duì)環(huán)境友好；本發(fā)明采用的催化劑木瓜蛋白酶對(duì)反應(yīng)物的通用性好，當(dāng)羰基化合物是芳香醛、 雜環(huán)芳香醛、脂肪醛或α，β-不飽和醛時(shí)，均可以取得良好的催化效果；本發(fā)明采用木瓜蛋白酶作為Knoevenagel反應(yīng)的催化劑，反應(yīng)條件溫和，對(duì)此反 應(yīng)的催化具有專一性，副反應(yīng)少，從而較好地催化了反應(yīng)活性較低的活潑亞甲基化合物的 Knoevenagel反應(yīng)，克服了目前涉及到反應(yīng)活性較低的活潑亞甲基化合物的Knoevenagel 反應(yīng)通常只能得到很低產(chǎn)率的困難?？傊?，木瓜蛋白酶作為Knoevenagel反應(yīng)催化劑的應(yīng)用具有較好的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步證明木瓜蛋白酶的催化效應(yīng)。發(fā)明人進(jìn)行了控制實(shí)驗(yàn)。具體采用的催 化劑、反應(yīng)條件和產(chǎn)物收率詳見表1。編號(hào) 1 6 的 Knoevenagel 反應(yīng) 表1控制實(shí)驗(yàn)3 a所有反應(yīng)在60°C下進(jìn)行，苯甲醛(2mmol)，乙酰丙酮(2. 4mmol)，催化劑(150mg)， 去離子水(1. 25ml)，DMSO (3. 75ml)。b最終產(chǎn)物通過硅膠柱層析分離。 通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，在100°C失活的木瓜蛋白酶催化苯甲醛與乙酰丙酮 的Knoevenagel反應(yīng)，最終只得到了 5%的產(chǎn)率。用尿素或者EDTA失活了的木瓜蛋白酶做 催化劑的時(shí)候，通過薄層色譜分析發(fā)現(xiàn)，只有痕量的產(chǎn)物。然后，發(fā)明人用PMSF對(duì)木瓜蛋白 酶失活，再讓其催化Knoevenagel反應(yīng)，最終只得到了 8%的產(chǎn)率。為了排除蛋白質(zhì)催化的 可能性，反應(yīng)用牛血清蛋白代替木瓜蛋白酶后只得到了 10%的產(chǎn)率。上述結(jié)果表明，該反應(yīng) 發(fā)生在木瓜蛋白酶的活性位點(diǎn)上，說明木瓜蛋白酶對(duì)Knoevenagel反應(yīng)的催化效應(yīng)是利用 了其酶的活性。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，下面將描述本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。在實(shí)施例中，原料和試劑均為市售品且未經(jīng)進(jìn)一步純化，其中木瓜蛋白酶是從廣 西南寧龐博生物工程有限公司購得；核磁共振氫譜(1HNMR)用Bruker AV-300核磁共振波 譜儀進(jìn)行測定，頻率為300MHz，溶劑為氘代氯仿，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅(TMS)。所有實(shí)施例中，木瓜蛋白酶催化的Knoevenagel反應(yīng) EffG1和EWG2為吸電子官能團(tuán)實(shí)施例1 14 向含有羰基化合物(2mmol)、活潑亞甲基化合物(2. 4mmol)、 DMSO(3. 75ml)與去離子水(1.25ml)的反應(yīng)體系中加入木瓜蛋白酶(150mg)，在60°C下攪 拌反應(yīng)120h，過濾除去木瓜蛋白酶，加入乙酸乙酯(IOml)稀釋反應(yīng)液，用水洗滌2次(每 次5ml)，水洗液用乙酸乙酯萃取2次(每次10ml)，合并有機(jī)層，用水(30ml)洗滌，減壓蒸 餾除去溶劑，得縮合產(chǎn)物粗品，通過硅膠柱層析分離純化(固定相為200 300目硅膠流動(dòng) 相為乙酸乙酯與石油醚的混合液)，即得縮合的最終產(chǎn)物。具體原料、反應(yīng)條件和產(chǎn)物收率 詳見表2。表2木瓜蛋白酶催化的Knoevenagel反應(yīng)
R^GHO + <
5 注3為通過硅膠柱層析分離后的最終產(chǎn)物；b為產(chǎn)物中Z/E-異構(gòu)體的摩爾比，Z/ E-異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)用1HNMR表征。
由表2可知(1)活潑亞甲基化合物用乙酰丙酮比乙酰乙酸乙酯產(chǎn)率要高一些，是因?yàn)樵诓捎?優(yōu)選實(shí)驗(yàn)條件之下，乙酰丙酮比乙酰乙酸乙酯反應(yīng)活性更強(qiáng)。這與已經(jīng)報(bào)道過的用氨基酸 催化的結(jié)果相反，這說明了酶特殊的催化效應(yīng)。(2)在芳香環(huán)上取代基的電子效應(yīng)對(duì)整個(gè)反應(yīng)有明顯的影響。含有吸電子取代基 的芳香醛，反應(yīng)產(chǎn)率較高；含有給電子取代基的芳香醛，反應(yīng)產(chǎn)率較低。這是因?yàn)?，吸電子?團(tuán)活化了醛上的羰基，更有利于這個(gè)反應(yīng)。但對(duì)于α，β-不飽和醛卻得到了完全相反的結(jié)果。含有給電子取代基的α， β-不飽和醛比含有吸電子取代基的α，β-不飽和醛產(chǎn)率更高。比如4-甲氧基肉桂醛與 乙酰丙酮反應(yīng)產(chǎn)率為81%，然而4-氟肉桂醛與乙酰丙酮反應(yīng)的產(chǎn)率為66%。此外，2-呋喃甲醛與乙酰丙酮和乙酰乙酸乙酯反應(yīng)分別得到了 77%和70%的產(chǎn) 率。相比之下，2-噻吩甲醛與乙酰丙酮和乙酰乙酸乙酯卻分別得到了 51%和43%的產(chǎn)率。 這源于2-呋喃甲醛比2-噻吩甲醛更高的親電性。(3)在木瓜蛋白酶催化下，芳香醛(實(shí)施例1 4、14)、雜環(huán)芳香醛(實(shí)施例10 13)或α，β-不飽和醛(實(shí)施例5 9)與反應(yīng)活性較低的活潑亞甲基化合物1，3_ 二羰 基化合物(乙酰丙酮和乙酰乙酸乙酯)的反應(yīng)都取得了較好的結(jié)果，當(dāng)然，當(dāng)使用反應(yīng)活性 較高的活潑亞甲基化合物時(shí)可以取得更好的結(jié)果。
權(quán)利要求
木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于使用木瓜蛋白酶時(shí)的溫度為50 61°C。
3.如權(quán)利要求2所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于使用木瓜蛋白酶時(shí)以二甲亞砜和去離子水為反應(yīng)介質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于所述反應(yīng)介質(zhì)中去離子水的體積百分比為20 32%。
5.如權(quán)利要求4所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于所述應(yīng)用是向羰基化合物與活潑亞甲基化合物的反應(yīng)體系中加入木瓜蛋白酶作為催 化劑，反應(yīng)時(shí)間80 120h。
6.如權(quán)利要求5所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于所述羰基化合物為芳香醛、雜環(huán)芳香醛、脂肪醛或α，不飽和醛；所述活潑亞甲基 化合物為1，3-二羰基化合物。
7.如權(quán)利要求6所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于所述反應(yīng)中，羰基化合物與活潑亞甲基化合物摩爾用量比為1 1 1 1.2，羰基 化合物與木瓜蛋白酶的用量比為=Immol 50mg Immol 150mg，羰基化合物與反應(yīng)介質(zhì) 的用量比為Immol 3ml Immol 2ml。
8.如權(quán)利要求7所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于所述芳香醛為芳香環(huán)上含吸電子取代基的芳香醛，所述雜環(huán)芳香醛為親電性好的雜 環(huán)芳香醛，所述α，β-不飽和醛為含有給電子取代基的α，β-不飽和醛。
9.如權(quán)利要求8所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，其特征 在于所述1，3_ 二羰基化合物為乙酰丙酮或乙酰乙酸乙酯。
10.如權(quán)利要求2-9任一所述的木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng) 用，其特征在于所述木瓜蛋白酶的使用溫度為60°C，所述反應(yīng)介質(zhì)中去離子水的體積百 分比為25%，所述反應(yīng)時(shí)間為120h，所述羰基化合物與活潑亞甲基化合物摩爾用量比為 1 1.2，所述羰基化合物與木瓜蛋白酶的用量比為Immol 75mg，所述羰基化合物與反應(yīng) 介質(zhì)的用量比為:2mmol 5ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了木瓜蛋白酶在Knoevenagel反應(yīng)中作為催化劑的應(yīng)用，具有通用性好、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)成本低、使用安全、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，且在羰基化合物與1，3-二羰基化合物的Knoevenagel反應(yīng)中可以獲得較好的產(chǎn)率，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P7/26GK101892270SQ201010195888
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者何延紅, 官智, 胡文 申請(qǐng)人:西南大學(xué)