專利名稱：好食脈孢霉及由該好食脈孢霉培制纖溶酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種好食脈孢霉，本發(fā)明還涉及一種由該好食脈孢霉培制纖溶酶的方法。
背景技術(shù)：
血栓類疾病嚴(yán)重的威脅著人類的生命和健康，是導(dǎo)致當(dāng)今人類死亡的最主要原 因之一，而且這種病的發(fā)病率目前仍然在逐年上升。溶栓療法是當(dāng)前血栓疾病的一種最 常用的治療手段，所使用的溶栓劑現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到了第三代，從自然界各種生物資源中開 發(fā)溶栓物質(zhì)是這一代溶栓劑產(chǎn)品研發(fā)的重要途徑。本申請人于1999年3月篩選到了一 種具有優(yōu)良溶栓性能的好食脈孢霉菌株，該菌株已由本申請人于2006年10月12日向中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提供了保藏，分類學(xué)命名為好食 脈孢霉(N. sitophila)菌株17號，保藏號為CGMCC No. 1836。利用該菌株本申請人培養(yǎng) 出了一種具有良好溶栓性能的纖溶酶，并于2006年12月14日向國家知識產(chǎn)權(quán)局提交了 申請?zhí)枮?00610163479.6的發(fā)明專利申請。該發(fā)明申請中的纖溶酶具有如下特征"經(jīng) SDS-PAGE法和凝膠過濾層析法的分析測定，被證實該纖溶酶酶分子由兩個亞基組成，相對 分子量分別為30000和15500， IEF測定等電點為7. 9±0. 2。該纖溶酶酶分子有直接溶解 纖維蛋白和激活纖溶酶原間接溶解纖維蛋白的作用，可以順次降解纖維蛋白原a、|3和Y 鏈。還可以水解生色底物N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，測得的酶促反應(yīng)的米氏常 數(shù)為0. 24mmol/L ;該纖溶酶不降解人血清蛋白，最適作用pH為7. 4，適宜在人體生理pH下 發(fā)揮作用，在pH4. 8-9. 8范圍內(nèi)37t:保溫24h后酶活力保持在80%以上；最適作用溫度為 50°C，在32°C -42。C保溫4h酶活力保持在75%以上；Fe2+和Fe3+在離子濃度為0. 5mmo1/ L時對酶的活性有激活作用，該纖溶活性受絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制。"好食脈孢霉 (N. sitophila) 17號菌株是一種很難得的優(yōu)良菌種，在制備該纖溶酶過程中還分離到一種 理化性質(zhì)與該纖溶酶完全不同的纖溶酶，本發(fā)明內(nèi)容屬于對該項目的繼續(xù)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)是提供一種好食脈孢霉菌株發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶，該纖溶酶不 僅具有很好的溶栓性能，而且使用上安全性好，相對分子量小，易于人體吸收，制備成本也 很低廉。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種由該好食脈孢霉培制制纖溶酶的方 法。 本發(fā)明的好食脈孢霉是本申請人于1999年3月在中國北方醬類食品發(fā)酵中間產(chǎn) 物醬塊中分離、篩選得到的，為一種具有良好溶栓性能的好食脈孢霉菌株，該菌株已由本申 請人于2006年IO月12日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提 供了保藏，分類學(xué)命名為好食脈孢霉(N. sitophila)菌株17號，保藏號為CGMCC No. 1836。 脈孢霉廣泛分布在自然界土壤中、禾本科植物上以及富含淀粉的食物上。此脈孢霉屬于好 氧微生物，氧氣充足時，孢子形成迅速。最適生長pH為5 7.5。 25 36"下生長最快，菌
3落最初白色，成叢，很快變?yōu)榈S色，絨毛狀。菌絲蔓延生長，有橫隔。菌落成熟后，上層覆 蓋成團塊的分生孢子。分生孢子球形或近似球形，成鏈，橙紅色。 本發(fā)明產(chǎn)品的培制方法是以微生物好食脈孢霉(N. sitophila)菌株17號為菌種， 經(jīng)淺盤固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生纖溶酶，將發(fā)酵物用生理鹽水浸提6h，濾去菌體和固形物，收集濾 過液，用40% 80% (W/V)飽和度的硫酸銨分級鹽析，再采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)進行純化， 使酶純度達(dá)到色譜純。 本發(fā)明培制的纖溶酶具有以下酶學(xué)性質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE法和凝膠過濾層析法測定 該纖溶酶酶分子相對分子量為34000±3000， IEF測定等電點為9. 3±0. 2。該纖溶酶酶分子 直接溶解纖維蛋白，可以順次降解纖維蛋白a 、P和Y鏈。該纖溶酶最適作用pH為7.6，適 宜在人體生理pH下發(fā)揮作用，在pH5. 8-10范圍內(nèi)37°C保溫24h后酶活力保持在80 %以上； 最適作用溫度為4rC，在23t: -42°〇范圍內(nèi)酶活力保持較穩(wěn)定，適宜在人體溫度條件下發(fā) 揮作用；C^+、Mg"、Na+、M^+、K+、Z^+對酶的活性有不同程度激活作用，該酶為絲氨酸蛋白酶， Q-T0F2串聯(lián)質(zhì)譜鑒定此脈孢霉纖溶酶為新型蛋白質(zhì)，并測得其中三個肽段的序列分別為 L-A-S-T-A-N-S-G-V-L-S-G-L-L-A-G-T-V-G-G-K ;A-Y-T-S-K-S-S-V-P-S-S-V-G-L-A-R ; L-L-D-T-G-L-N-T-A-H-S-D-F-N-R 。 本發(fā)明與申請?zhí)?00610163479. 6發(fā)明專利申請技術(shù)方案中的產(chǎn)品制備方法對 比，原方案中纖溶酶色譜提純方法S印hadex G-25凝膠過濾層析使用pH7. 4磷酸鹽緩沖液 洗脫，收集有纖溶活性組分；SP-S印har離子交換層析使用含0 0. 8mol/L NaCl的磷酸 鹽緩沖溶液(pH7.4)梯洗，收集有纖溶活性組分。本發(fā)明中纖溶酶色譜提純方法S印hadex G-25凝膠過濾層析使用pH6. 0磷酸鹽緩沖液洗脫，收集有纖溶活性組分；SP-S印har離子交 換層析使用含0 0. 8mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH6. 0)梯洗，收集有纖溶活性組分。
本發(fā)明的優(yōu)點是原方案中纖溶酶酶分子復(fù)雜，分子量相對較大，而本發(fā)明中纖 溶酶分子小，分子量為34000±3000，易于人體吸收；原方案中纖溶酶的最適作用溫度為 5(TC，本發(fā)明產(chǎn)品纖溶酶的最適作用溫度為4rC，溫度下限明顯降低，更加接近于人體的體 溫。原方案中纖溶酶酶活力的穩(wěn)定范圍為32-42t:，本發(fā)明產(chǎn)品纖溶酶酶活力的穩(wěn)定范圍為 23°C -42"，適宜溫度更加放寬，可以置于室溫下保存。原方案的纖溶酶只有Fe"和Fe"對 其有激活作用，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，Ca2+、Mg、Na+、M^+、K+、Z^+對本發(fā)明的纖溶酶都有 不同程度激活作用。


圖1一級MS譜圖I
圖2—級MS譜圖工I
圖3—級MS譜圖ni
圖4二級MS譜圖I
圖5二級MS譜圖工I 圖6為利用血纖維蛋白平板法證實本發(fā)明產(chǎn)品纖溶酶溶纖作用的圖片 圖7為SDS-PAGE測定本發(fā)明產(chǎn)品纖溶酶對人血纖維蛋白原的降解圖片 本發(fā)明所使用的菌種好食脈孢霉(N. sitophila) 17號已由本申請人于2006年10
月12日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心具體實施例 實施例1 : 1、菌種好食脈孢霉(N. sitophila)菌株17號
2、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 (1)斜面培養(yǎng)基(PDA斜面)葡萄糖2%、瓊脂2%、用20X土豆汁配制，pH自然， 28t:恒溫培養(yǎng)3d。 (2)制霉素抗性初篩平板培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基中含10U/ml制霉菌素，0.02X (w/v) 入LiCl H20，0. 08(w/v)去氧膽酸鈉，25 28"恒溫培養(yǎng)36h ; (3)復(fù)篩用固體發(fā)酵培養(yǎng)基豆渣麩皮=4 : l(干重比)，CaCl20.75 %、
FeS04* 7H20 0. 045%、pH自然，接種量為5X 105個/瓶，28 30。C發(fā)酵3d。 實施例2 1、斜面培養(yǎng)同實施例1 2、固體發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是豆渣麩皮(4 : l)+CaCl20. 75% +FeS04*7H20 0.045%。每瓶培養(yǎng)基接種3. 4X 105個孢子，在28。C恒溫箱培養(yǎng)48h，然后用 生理鹽水浸提4 6h，淺盤發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件同搖瓶培養(yǎng)。 3、纖溶酶的分離純化固體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過生理鹽水浸提后，依次經(jīng)過40 80% (W/V)飽和度硫酸銨分級鹽析、Octyl-S印haroseFF疏水相互作用層析、SP-S印haroseHP離 子交換層析、Phenyl疏水相互作用層析和RESOURCE疏水相互作用層析，收集有纖溶活性成 分。 實施例3 1、斜面培養(yǎng)同實施例1 2 、固體發(fā)酵同實施例2淺盤發(fā)酵； 3、纖溶酶的分離純化脈孢霉固體發(fā)酵液經(jīng)過生理鹽水浸提、40 80% (W/V)硫
酸銨分級鹽析后，采用Octyl-S印harose FF疏水相互作用層析、S印hadex G-25凝膠過濾層
析、SP-S印haroseHP強陽離子交換層析、Superdex75凝膠過濾層析，收集有纖溶活性組分。 實施例4 1、斜面培養(yǎng)同實施例1 2 、固體發(fā)酵同實施例2淺盤發(fā)酵； 3、纖溶酶分離純化同實施例3 4、測定分離純化后的纖溶酶的性質(zhì)脈孢霉纖溶酶相對分子量為34000±3000，
等電點9.3士0.2，順次降解纖維蛋白a、 13和Y鏈，測得其中三個肽段的序列分別為
L-A-S-T-A-N-S-G-V-L-S-G-L-L-A-G-T-V-G-G-K ;A+T-S-K-S-S-V-P-S-S-V-G-L-A-R ;
L-L-D-T-G-L-N-T-A-H-S-D-F-N-R，見圖1-圖5。 實施例5 纖溶酶纖溶活性證明 采用血纖維蛋白平板法和電泳法檢驗此酶對纖維蛋白的溶解性。
A血纖維蛋白平板法
此平板法含有血纖維蛋白原(市售的血纖維蛋白原中可能含有纖維蛋白)和凝血 酶，可溶性纖維蛋白原在凝血酶作用形成纖維蛋白單體，血纖維蛋白單體自發(fā)締結(jié)，多聚化 形成可見的血纖維蛋白凝膠，將酶液加到平板凝膠表面后，經(jīng)過一段時間培養(yǎng)后即將血纖 維蛋白溶解，在平板凝膠表面形成透明圈。見圖6。
B電泳法 將纖溶酶和人血纖維蛋白原等體積混勻在37t:作用，用SDS—PAGE檢測脈孢霉纖
溶酶是否降解人血纖維蛋白原，降解圖譜見圖7(從右至左泳道依次為人血纖維蛋白原、脈
孢霉纖溶酶與纖維蛋白原混合后作用5min、30min、lh、2h、4h、6h、8h、12h、24h)。 如圖7所示5min后對a鏈降解完全，lh后對P鏈降解完全，而在24h時對Y
鏈已經(jīng)完全降解，這一降解順序與人纖溶酶降解纖維蛋白原各亞基的情況相似。見圖6、圖7。
權(quán)利要求
好食脈孢霉，該菌株已向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提供保藏，分類學(xué)命名為好食脈孢霉(N.sitophila)17號，保藏號為CGMCC No.1836。
2. 如權(quán)利要求l所述好食脈孢霉培制纖溶酶的方法，是以微生物好食脈孢霉 (N. sitophila)菌株17號為菌種，經(jīng)淺盤固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生纖溶酶，將發(fā)酵物用生理鹽水 浸提6h，濾去菌體和固形物，收集濾過液，用40% 80% (W/V)飽和度的硫酸銨分級鹽析， 再采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)進行純化，包括使用S印hadex G-25凝膠過濾層析，使用pH6. 0 磷酸鹽緩沖液洗脫，收集有纖溶活性組分；SP-S印har離子交換層析使用含0 0. 8mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖溶液(pH6. 0)梯洗，收集有纖溶活性組分，最終使酶純度達(dá)到色譜純。
3. 由如權(quán)利要求2所述好食脈孢霉培制纖溶酶的方法制備的纖溶酶，其相 對分子量為34000±3000，等電點9. 3±0. 2，順次降解纖維蛋白a 、 P禾P Y鏈， 其中三個肽段的序列分別為L-A-S-T-A-N-S-G-V-L-S-G-L-L-A-G-T-V-G-G-K ; A-Y-T-S-K-S-S-V-P-S-S-V-G-L-A-R ; L-L-D-T-G-L-N-T-A-H-S-D-F-N-R 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種好食脈孢霉以及由該好食脈孢霉培制纖溶酶的方法，是以微生物好食脈孢霉(N.sitophila)菌株17號為菌種，經(jīng)淺盤固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生纖溶酶，將發(fā)酵物用生理鹽水浸提6h，濾去菌體和固形物，收集濾過液，用硫酸銨分級鹽析，再采用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)進行純化，使酶純度達(dá)到色譜純。優(yōu)點是本發(fā)明中纖溶酶分子小，分子量為34000±3000，易于人體吸收；最適作用溫度為41℃，更加接近于人體的體溫。本發(fā)明產(chǎn)品纖溶酶酶活力的穩(wěn)定范圍為23℃-42℃，適宜溫度更加放寬，可以置于室溫下保存。原方案的纖溶酶只有Fe2+和Fe3+對其有激活作用，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，Ca2+、Mg2+、Na+、Mn2+、K+、Zn2+對本發(fā)明的纖溶酶都有不同程度激活作用。
文檔編號C12N1/14GK101701191SQ200910072630
公開日2010年5月5日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者劉曉蘭, 鄧永平, 鄭喜群, 鄭宏臣 申請人:齊齊哈爾大學(xué)