酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酸性耐高溫α?淀粉酶的生產(chǎn)方法，選用基因改良的枯草芽孢桿菌，通過(guò)平皿培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、酶的提取制得，該生產(chǎn)方法采用的經(jīng)過(guò)基因工程改良的枯草芽孢桿菌不會(huì)產(chǎn)生芽孢、適應(yīng)能力強(qiáng)、不容易染菌、活力高、周期短。生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)調(diào)整風(fēng)量控制，培養(yǎng)基的配比以及有效控制pH，最終制得的酸性耐高溫α?淀粉酶最佳反應(yīng)條件在90?110℃、pH在4.0?5.5，酶活力達(dá)到40000U/mL，發(fā)酵周期僅為120小時(shí)，是目前國(guó)內(nèi)在最短的發(fā)酵周期內(nèi)酶活力最高的耐酸性淀粉酶。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物酶制劑的生產(chǎn)方法，特別是涉及一種酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]α-淀粉酶(α-l，4-D_葡萄糖-葡萄糖苷水解酶)普遍分布在動(dòng)物、植物和微生物中，是一種重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉時(shí)從淀粉分子的內(nèi)部隨機(jī)切開(kāi)α_1，4糖苷鍵，生成糊精和還原糖。由于產(chǎn)物的末端殘基碳原子構(gòu)型為α構(gòu)型，故稱(chēng)α-淀粉酶。α-淀粉酶是一種十分重要的酶制劑，大量應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等，是應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一。
[0003]酸性高溫α-淀粉酶一般最佳反應(yīng)條件在80-100°C、pH在3.0-6.0之間，能在適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)中的高溫偏酸性環(huán)境，提高工業(yè)生產(chǎn)效率。目前我國(guó)自主研究生產(chǎn)的耐酸性高溫α-淀粉酶還不是很多，常見(jiàn)的OGO耐高溫酸性α-淀粉酶是采用地衣芽孢桿菌(BacillusIicheniformis )經(jīng)液體深層發(fā)酵、超濾等工序精制而成，然而其酶活一般只能達(dá)到20000U/mL，并且發(fā)酵周期較長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種在更短的發(fā)酵周期內(nèi)酶活更高的酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，選用基因改良的枯草芽孢桿菌，通過(guò)平皿培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、酶提取制得，其特征在于:其步驟如下:
(1)平皿培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:蛋白胨:0.5-1.5%，酵母粉:0.1 -0.3%，牛肉粉:0.1 -0.5%，氯化鈉:0.1-0.3%，葡萄糖:3-7%，玉米淀粉:0.5-1.5%，瓊脂粉:1.5_2%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)，控制pH為6.5-7.0，然后在溫度121°C、壓力0.1Mpa條件下滅菌30min，接種后36°C十旦溫培養(yǎng)36_48h ；
(2)搖瓶培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:酵母粉1_2%，葡萄糖0.3-0.7%，磷酸二氫鉀0.1-0.5%，硫酸鎂0.05-0.15%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)；調(diào)pH至7.5后滅菌，接種，37 °(:搖瓶培養(yǎng)8_12h，當(dāng)pH下降至6.5-6.7時(shí)進(jìn)入種子罐；
(3)種子罐發(fā)酵:配料A:硫酸銨:3.5kg，脫脂大豆粉:17kg，磷酸二氫鈉:13kg，磷酸二氫鉀:4.2kg，玉米漿:60kg，硫酸鎂:1.39kg，硫酸亞鐵:3.06g，硫酸錳:18.2g，硫酸鋅:4.8g，消泡劑:1.51^，在種子罐中121-123°(:條件下滅菌501^11;配料8:結(jié)晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C滅菌35min，冷卻后并入滅菌冷卻后的種子罐中，然后將種子罐調(diào)整到溫度32-340C，pH為6.6-6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接種后在溫度32-340C，pH為6.6-6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h的條件下發(fā)酵20_30h，當(dāng)溶氧68-72%，鏡檢菌體正常時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐； (4)發(fā)酵罐發(fā)酵:配料A:脫脂大豆粉:180kg，玉米漿:500kg，磷酸氫二鉀:175kg，磷酸二氫鉀:57kg，硫酸銨:33kg，硫酸鎂:0.77kg，硫酸亞鐵17g，硫酸錳6.67g，硫酸鋅5g，消泡劑:12kg，在發(fā)酵罐中121-123°C滅菌50min;配料B:氯化鈣33kg在另一罐中121-123°C滅菌40min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；配料C:結(jié)晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123°C滅菌35min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；將發(fā)酵罐調(diào)整到pH為6.6-6.8，罐壓0.4Mpa，空氣流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接種后在溫度38°C，pH為6.6-6.8，風(fēng)量650 m3/h，罐壓0.4Mpa條件下發(fā)酵100-120h ；
(5)酶的提取:取發(fā)酵醪液，調(diào)pH至9.0，然后依次加入醪液體積量2.5-4%的CaCl2,2.5-4%的Na2HPO4，稀釋2倍后加醪液體積量2%的硅藻土進(jìn)行絮凝處理，加熱至65-70°C后，經(jīng)板框壓濾、超濾栗超濾后獲得濾液，然后向?yàn)V液中依次加入干糊精2%、醋酸鈉8-10%、氯化鈉18-22%進(jìn)行調(diào)配，之后用醋酸調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，迅速加熱至65-70°C，保持5_10min，立即冷卻，取樣測(cè)酶活，酶活力可達(dá)20000-40000U/mL，之后用硅藻土進(jìn)行成品精過(guò)濾，裝入成品儲(chǔ)罐。
[0006]所述搖瓶培養(yǎng)中每150mL種母液接1-2個(gè)培養(yǎng)好的單菌落，每毫升種母液加氯霉素2.5單位后接種。
[0007]所述發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%時(shí)可通過(guò)提高風(fēng)量、提高罐壓、降低補(bǔ)糖速度來(lái)提高溶氧。
[0008]所述超濾栗超濾時(shí)維持系統(tǒng)壓力在正常范圍之內(nèi)，初始?jí)毫?.3MPa，后期0.5MPa。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
1、本發(fā)明酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法采用的經(jīng)過(guò)基因工程改良的枯草芽孢桿菌不會(huì)產(chǎn)生芽孢、適應(yīng)能力強(qiáng)、不容易染菌、活力高、周期短。
[0010]2、通過(guò)調(diào)整風(fēng)量控制，培養(yǎng)基的配比以及有效控制pH，最終制得的酸性耐高溫α-淀粉酶最佳反應(yīng)條件在90-110 °C、ρΗ在4.0-5.5，酶活力達(dá)到40000U/mL，發(fā)酵周期僅為120小時(shí)，是目前國(guó)內(nèi)在最短的發(fā)酵周期內(nèi)酶活力最高的耐酸性淀粉酶。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]實(shí)施例1酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，選用基因改良的枯草芽孢桿菌，通過(guò)平皿培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、酶的提取制得，其特征在于:其步驟如下:
(I)平皿培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:蛋白胨:1%，酵母粉:0.2%，牛肉粉:0.3%，氯化鈉:0.2%，葡萄糖:5%，玉米淀粉:1%，瓊脂粉:1.7%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)，控制pH為6.7，然后在溫度121°C、壓力0.謂?&條件下滅菌3011^11，接種后36°(:恒溫培養(yǎng)4011;
(2 )搖瓶培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:酵母粉1.5%，葡萄糖0.5%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.1%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)；調(diào)PH至7.5后滅菌，接種，37°C搖瓶培養(yǎng)10h，當(dāng)pH下降至6.6時(shí)進(jìn)入種子罐；
(3)種子罐發(fā)酵:配料A:硫酸銨:3.5kg，脫脂大豆粉:17kg，磷酸二氫鈉:13kg，磷酸二氫鉀:4.2kg，玉米漿:60kg，硫酸鎂:1.39kg，硫酸亞鐵:3.06g，硫酸錳:18.2g，硫酸鋅:4.8g，消泡劑:1.5kg，在種子罐中122°C條件下滅菌50min;配料B:結(jié)晶葡萄糖35kg在另外一罐中122°C滅菌35min，冷卻后并入滅菌冷卻后的種子罐中，然后將種子罐調(diào)整到溫度33°C，pH為6.7，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接種后在溫度33 °C，pH為6.7，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h的條件下發(fā)酵20h，當(dāng)溶氧70%，鏡檢菌體正常時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐；
(4)發(fā)酵罐發(fā)酵:配料A:脫脂大豆粉:180kg，玉米漿:500kg，磷酸氫二鉀:175kg，磷酸二氫鉀:57kg，硫酸銨:33kg，硫酸鎂:0.77kg，硫酸亞鐵17g，硫酸錳6.67g，硫酸鋅5g，消泡劑:12kg，在發(fā)酵罐中122°C滅菌50min;配料B:氯化鈣33kg在另一罐中122°C滅菌40min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；配料C:結(jié)晶葡萄糖70kg在另一罐中122°C滅菌35min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；將發(fā)酵罐調(diào)整到PH為6.7，罐壓0.4Mpa，空氣流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接種后在溫度38 °C，pH為6.7，風(fēng)量650 m3/h，罐壓0.4Mpa條件下發(fā)酵10h ；
(5)酶的提取:取發(fā)酵醪液，調(diào)pH至9.0，然后依次加入醪液體積量3%的CaCl2，3%的Na2HPO4，稀釋2倍后加醪液體積量2%的硅藻土進(jìn)行絮凝處理，加熱至68 °C后，經(jīng)板框壓濾、超濾栗超濾后獲得濾液，然后向?yàn)V液中依次加入干糊精2%、醋酸鈉9%、氯化鈉20%進(jìn)行調(diào)配，之后用醋酸調(diào)節(jié)PH至6.3，迅速加熱至68°C，保持Smin，立即冷卻，取樣測(cè)酶活，酶活力為40000U/mL，之后用娃藻土進(jìn)行成品精過(guò)濾，裝入成品儲(chǔ)罐。
[0013]所述搖瓶培養(yǎng)中每150mL種母液接2個(gè)培養(yǎng)好的單菌落，每毫升種母液加氯霉素2.5單位后接種。
[0014]所述發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%時(shí)可通過(guò)提高風(fēng)量、提高罐壓、降低補(bǔ)糖速度來(lái)提高溶氧。
[0015]所述超濾栗超濾時(shí)維持系統(tǒng)壓力在正常范圍之內(nèi)，初始?jí)毫?.3MPa，后期0.5MPa。
[0016]實(shí)施例2酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，選用基因改良的枯草芽孢桿菌，通過(guò)平皿培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、酶的提取制得，其特征在于:其步驟如下:
(1)平皿培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:蛋白胨:0.5%，酵母粉:0.1%，牛肉粉:0.1%，氯化鈉:0.1%，葡萄糖:3%，玉米淀粉:0.5%，瓊脂粉:1.5%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)，控制pH為6.5，然后在溫度121°C、壓力0.謂?&條件下滅菌3011^11，接種后36°(:恒溫培養(yǎng)3611;
(2)搖瓶培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:酵母粉1%，葡萄糖0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，余量為水，各組分以重量百分計(jì);調(diào)PH至7.5后滅菌，接種，37°C搖瓶培養(yǎng)8h，當(dāng)pH下降至6.5時(shí)進(jìn)入種子觸;
(3)種子罐發(fā)酵:配料A:硫酸銨:3.5kg，脫脂大豆粉:17kg，磷酸二氫鈉:13kg，磷酸二氫鉀:4.2kg，玉米漿:60kg，硫酸鎂:1.39kg，硫酸亞鐵:3.06g，硫酸錳:18.2g，硫酸鋅:4.8g，消泡劑:1.51^，在種子罐中121-123°(:條件下滅菌501^11;配料8:結(jié)晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C滅菌35min，冷卻后并入滅菌冷卻后的種子罐中，然后將種子罐調(diào)整到溫度320C，pH為6.6，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接種后在溫度32-34°C，pH為6.6，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h的條件下發(fā)酵25h，當(dāng)溶氧68%，鏡檢菌體正常時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐；
(4)發(fā)酵罐發(fā)酵:配料A:脫脂大豆粉:180kg，玉米漿:500kg，磷酸氫二鉀:175kg，磷酸二氫鉀:57kg，硫酸銨:33kg，硫酸鎂:0.77kg，硫酸亞鐵17g，硫酸錳6.67g，硫酸鋅5g，消泡劑:121^，在發(fā)酵罐中121<€滅菌50111；[11;配料13:氯化|丐331^在另一罐中121°C滅菌40min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；配料C:結(jié)晶葡萄糖70kg在另一罐中121°C滅菌35min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；將發(fā)酵罐調(diào)整到PH為6.6，罐壓0.4Mpa，空氣流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接種后在溫度38 °C，pH為6.6，風(fēng)量650 m3/h，罐壓0.4Mpa條件下發(fā)酵I 1h;
(5)酶的提取:取發(fā)酵醪液，調(diào)pH至9.0，然后依次加入醪液體積量2.5%的CaCl2，2.5%的Na2HPO4，稀釋2倍后加醪液體積量2%的硅藻土進(jìn)行絮凝處理，加熱至65 °C后，經(jīng)板框壓濾、超濾栗超濾后獲得濾液，然后向?yàn)V液中依次加入干糊精2%、醋酸鈉8%、氯化鈉18%進(jìn)行調(diào)配，之后用醋酸調(diào)節(jié)PH至6.0，迅速加熱至65°C，保持5min，立即冷卻，取樣測(cè)酶活，酶活力為30000U/mL，之后用娃藻土進(jìn)行成品精過(guò)濾，裝入成品儲(chǔ)罐。
[0017]所述搖瓶培養(yǎng)中每150mL種母液接I個(gè)培養(yǎng)好的單菌落，每毫升種母液加氯霉素2.5單位后接種。
[0018]所述發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%時(shí)可通過(guò)提高風(fēng)量、提高罐壓、降低補(bǔ)糖速度來(lái)提高溶氧。
[0019]所述超濾栗超濾時(shí)維持系統(tǒng)壓力在正常范圍之內(nèi)，初始?jí)毫?.3MPa，后期0.5MPa。
[0020]實(shí)施例3酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，選用基因改良的枯草芽孢桿菌，通過(guò)平皿培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、酶的提取制得，其特征在于:其步驟如下:
(1)平皿培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:蛋白胨:1.5%，酵母粉:0.3%，牛肉粉:0.5%，氯化鈉:0.3%，葡萄糖:7%，玉米淀粉:1.5%，瓊脂粉:2%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)，控制pH為7.0，然后在溫度121°C、壓力0.謂?&條件下滅菌3011^11，接種后36°(:恒溫培養(yǎng)4811;
(2)搖瓶培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:酵母粉2%，葡萄糖0.7%，磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.15%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)；調(diào)PH至7.5后滅菌，接種，37°C搖瓶培養(yǎng)12h，當(dāng)pH下降至6.7時(shí)進(jìn)入種子罐；
(3)種子罐發(fā)酵:配料A:硫酸銨:3.5kg，脫脂大豆粉:17kg，磷酸二氫鈉:13kg，磷酸二氫鉀:4.2kg，玉米漿:60kg，硫酸鎂:1.39kg，硫酸亞鐵:3.06g，硫酸錳:18.2g，硫酸鋅:4.8g，消泡劑:1.5kg，在種子罐中123°C條件下滅菌50min;配料B:結(jié)晶葡萄糖35kg在另外一罐中123°C滅菌35min，冷卻后并入滅菌冷卻后的種子罐中，然后將種子罐調(diào)整到溫度34°C，pH為6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接種后在溫度34 °C，pH為6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h的條件下發(fā)酵30h，當(dāng)溶氧72%，鏡檢菌體正常時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐；
(4)發(fā)酵罐發(fā)酵:配料A:脫脂大豆粉:180kg，玉米漿:500kg，磷酸氫二鉀:175kg，磷酸二氫鉀:57kg，硫酸銨:33kg，硫酸鎂:0.77kg，硫酸亞鐵17g，硫酸錳6.67g，硫酸鋅5g，消泡劑:12kg，在發(fā)酵罐中123 °C滅菌50min;配料B:氯化I丐33kg在另一罐中123°C滅菌40min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；配料C:結(jié)晶葡萄糖70kg在另一罐中123°C滅菌35min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；將發(fā)酵罐調(diào)整到PH為6.8，罐壓0.4Mpa，空氣流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接種后在溫度38 °C，pH為6.8，風(fēng)量650 m3/h，罐壓0.4Mpa條件下發(fā)酵120h;
(5)酶的提取:取發(fā)酵醪液，調(diào)pH至9.0，然后依次加入醪液體積量4%的CaCl2，4%的Na2HPO4，稀釋2倍后加醪液體積量2%的硅藻土進(jìn)行絮凝處理，加熱至70°C后，經(jīng)板框壓濾、超濾栗超濾后獲得濾液，然后向?yàn)V液中依次加入干糊精2%、醋酸鈉10%、氯化鈉22%進(jìn)行調(diào)配，之后用醋酸調(diào)節(jié)PH至6.5，迅速加熱至70°C，保持lOmin，立即冷卻，取樣測(cè)酶活，酶活力為35000U/mL，之后用娃藻土進(jìn)行成品精過(guò)濾，裝入成品儲(chǔ)罐。
[0021]所述搖瓶培養(yǎng)中每150mL種母液接2個(gè)培養(yǎng)好的單菌落，每毫升種母液加氯霉素2.5單位后接種。
[0022]所述發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%時(shí)可通過(guò)提高風(fēng)量、提高罐壓、降低補(bǔ)糖速度來(lái)提高溶氧。
[0023]所述超濾栗超濾時(shí)維持系統(tǒng)壓力在正常范圍之內(nèi)，初始?jí)毫?.3MPa，后期0.5MPa。
[0024]1、超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，選用基因改良的枯草芽孢桿菌，通過(guò)平皿培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、酶的提取制得，其特征在于:其步驟如下:
(1)平皿培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:蛋白胨:0.5-1.5%，酵母粉:0.1 -0.3%，牛肉粉:0.1 -0.5%，氯化鈉:0.1-0.3%，葡萄糖:3-7%，玉米淀粉:0.5-1.5%，瓊脂粉:1.5_2%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)，控制PH為6.5-7.0，然后在溫度121°C、壓力0.1Mpa條件下滅菌30min，接種后36°(:恒溫培養(yǎng)36-48h;
(2)搖瓶培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:酵母粉1_2%，葡萄糖0.3-0.7%，磷酸二氫鉀0.1-0.5%，硫酸鎂0.05-0.15%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)；調(diào)pH至7.5后滅菌，接種，37 °(:搖瓶培養(yǎng)8_12h，當(dāng)pH下降至6.5-6.7時(shí)進(jìn)入種子罐；
(3)種子罐發(fā)酵:配料A:硫酸銨:3.5kg，脫脂大豆粉:17kg，磷酸二氫鈉:13kg，磷酸二氫鉀:4.2kg，玉米漿:60kg，硫酸鎂:1.39kg，硫酸亞鐵:3.06g，硫酸錳:18.2g，硫酸鋅:4.8g，消泡劑:1.51^，在種子罐中121-123°(:條件下滅菌501^11;配料8:結(jié)晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C滅菌35min，冷卻后并入滅菌冷卻后的種子罐中，然后將種子罐調(diào)整到溫度32-340C，pH為6.6-6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接種后在溫度32-340C，pH為6.6-6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h的條件下發(fā)酵20_30h，當(dāng)溶氧68-72%，鏡檢菌體正常時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐；
(4)發(fā)酵罐發(fā)酵:配料A:脫脂大豆粉:180kg，玉米漿:500kg，磷酸氫二鉀:175kg，磷酸二氫鉀:57kg，硫酸銨:33kg，硫酸鎂:0.77kg，硫酸亞鐵17g，硫酸錳6.67g，硫酸鋅5g，消泡劑:12kg，在發(fā)酵罐中121-123°C滅菌50min;配料B:氯化鈣33kg在另一罐中121-123°C滅菌40min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；配料C:結(jié)晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123°C滅菌35min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；將發(fā)酵罐調(diào)整到pH為6.6-6.8，罐壓0.4Mpa，空氣流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接種后在溫度38°C，pH為6.6-6.8，風(fēng)量650 m3/h，罐壓0.4Mpa條件下發(fā)酵100-120h ；
(5)酶的提取:取發(fā)酵醪液，調(diào)pH至9.0，然后依次加入醪液體積量2.5-4%的CaCl2,2.5-4%的Na2HPO4，稀釋2倍后加醪液體積量2%的硅藻土進(jìn)行絮凝處理，加熱至65-70°C后，經(jīng)板框壓濾、超濾栗超濾后獲得濾液，然后向?yàn)V液中依次加入干糊精2%、醋酸鈉8-10%、氯化鈉18-22%進(jìn)行調(diào)配，之后用醋酸調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，迅速加熱至65-70°C，保持5_10min，立即冷卻，取樣測(cè)酶活，最終發(fā)酵酶可達(dá)20000-40000U/mL，之后用硅藻土進(jìn)行成品精過(guò)濾，裝入成品儲(chǔ)觸。
[0025]2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:搖瓶培養(yǎng)中每150mL種母液接1-2個(gè)培養(yǎng)好的單菌落，每毫升種母液加氯霉素2.5單位后接種。
[0026]3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%時(shí)可通過(guò)提高風(fēng)量、提高罐壓、降低補(bǔ)糖速度來(lái)提尚溶氧。
[0027]4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:超濾栗超濾時(shí)維持系統(tǒng)壓力在正常范圍之內(nèi)，初始?jí)毫?.3MPa，后期0.5MPa。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，選用基因改良的枯草芽孢桿菌，通過(guò)平皿培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)、種子罐發(fā)酵、發(fā)酵罐發(fā)酵、酶的提取制得，其特征在于:其步驟如下: (1)平皿培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:蛋白胨:0.5-1.5%，酵母粉:0.1-0.3%，牛肉粉:0.1-0.5%，氯化鈉:0.1-0.3%，葡萄糖:3-7%，玉米淀粉:0.5-1.5%，瓊脂粉:1.5_2%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)，控制PH為6.5-7.0，然后在溫度121°C、壓力0.1Mpa條件下滅菌30min，接種后36°(:恒溫培養(yǎng)36-48h; (2)搖瓶培養(yǎng):培養(yǎng)基配方:酵母粉1_2%，葡萄糖0.3-0.7%，磷酸二氫鉀0.1-0.5%，硫酸鎂0.05-0.15%，余量為水，各組分以重量百分計(jì)；調(diào)pH至7.5后滅菌，接種，37 °(:搖瓶培養(yǎng)8_12h，當(dāng)pH下降至6.5-6.7時(shí)進(jìn)入種子罐； (3)種子罐發(fā)酵:配料A:硫酸銨:3.5kg，脫脂大豆粉:17kg，磷酸二氫鈉:13kg，磷酸二氫鉀:4.2kg，玉米漿:60kg，硫酸鎂:1.39kg，硫酸亞鐵:3.06g，硫酸錳:18.2g，硫酸鋅:4.8g，消泡劑:1.51^，在種子罐中121-123°(:條件下滅菌501^11;配料8:結(jié)晶葡萄糖351^在另外一罐中121-123°C滅菌35min，冷卻后并入滅菌冷卻后的種子罐中，然后將種子罐調(diào)整到溫度32-340C，pH為6.6-6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h，溶氧100%，定容Im3，然后接種后在溫度32-340C，pH為6.6-6.8，罐壓0.5Mpa，空氣流量40m3/h的條件下發(fā)酵20_30h，當(dāng)溶氧68-72%，鏡檢菌體正常時(shí)轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐； (4)發(fā)酵罐發(fā)酵:配料A:脫脂大豆粉:180kg，玉米漿:500kg，磷酸氫二鉀:175kg，磷酸二氫鉀:57kg，硫酸銨:33kg，硫酸鎂:0.77kg，硫酸亞鐵17g，硫酸錳6.67g，硫酸鋅5g，消泡劑:12kg，在發(fā)酵罐中121-123°C滅菌50min;配料B:氯化鈣33kg在另一罐中121-123°C滅菌40min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；配料C:結(jié)晶葡萄糖70kg在另一罐中121-123°C滅菌35min，冷卻并入滅菌冷卻后的發(fā)酵罐中；將發(fā)酵罐調(diào)整到pH為6.6-6.8，罐壓0.4Mpa，空氣流量650 m3/h，溶氧100%，定容1m3，接種后在溫度38°C，pH為6.6-6.8，風(fēng)量650 m3/h，罐壓0.4Mpa條件下發(fā)酵100-120h ； (5)酶的提取:取發(fā)酵醪液，調(diào)pH至9.0，然后依次加入醪液體積量2.5-4%的CaCl2，2.5-4%的Na2HPO4，稀釋2倍后加醪液體積量2%的硅藻土進(jìn)行絮凝處理，加熱至65-70°C后，經(jīng)板框壓濾、超濾栗超濾后獲得濾液，然后向?yàn)V液中依次加入干糊精2%、醋酸鈉8-10%、氯化鈉18-22%進(jìn)行調(diào)配，之后用醋酸調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，迅速加熱至65-70°C，保持5_10min，立即冷卻，取樣測(cè)酶活，最終發(fā)酵酶可達(dá)20000-40000U/mL，之后用硅藻土進(jìn)行成品精過(guò)濾，裝入成品儲(chǔ)觸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:搖瓶培養(yǎng)中每150mL種母液接1-2個(gè)培養(yǎng)好的單菌落，每毫升種母液加氯霉素2.5單位后接種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中控制溶氧>20%，在溶氧低于20%時(shí)可通過(guò)提高風(fēng)量、提高罐壓、降低補(bǔ)糖速度來(lái)提高溶氧。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超酸性耐高溫α-淀粉酶的生產(chǎn)方法，其特征在于:超濾栗超濾時(shí)維持系統(tǒng)壓力在正常范圍之內(nèi)，初始?jí)毫?.3MPa，后期0.5MPa。
【文檔編號(hào)】C12N9/26GK105861467SQ201610494431
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月30日
【發(fā)明人】溫文偉, 溫明
【申請(qǐng)人】溫文偉