屬于GH3家族的耐熱性β-木糖苷酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種耐熱性β-木糖巧酶、編碼上述耐熱性β-木糖巧酶的多核巧酸、 用于表達上述耐熱性β-木糖巧酶的表達載體、整合了上述表達載體的轉(zhuǎn)化體、W及使用 上述耐熱性β-木糖巧酶的木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法。
[0002] 本申請要求基于2014年8月4日在日本申請的特愿第2014-158650號的優(yōu)先權(quán)， 并在本文中引用其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003] 除了對運輸用能源供應(yīng)的擔憂之外，由于全球變暖和大氣污染等環(huán)境上的問題， 近年來，石油替代能源的開發(fā)成為非常重要的課題。植物生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生 能源，作為石油替代資源而備受期待。作為植物生物質(zhì)的主要成分的木質(zhì)纖維素為纖維素、 半纖維素（包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖）等多糖類，W及木質(zhì)素。運些多糖類被各 種糖巧水解酶水解為葡萄糖或木糖等單糖后，用作生物燃料或化學(xué)品原料。
[0004] 具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的木質(zhì)纖維素是難分解性的，難W用單一的酶分解或糖化 (hy化olysis)。因此，對于多糖類中的纖維素的水解，通常需要糖巧水解酶中的內(nèi)切葡聚糖 酶（內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶，EC3. 2. 1. 4)、外切型纖維二糖水解酶（1，4-β-纖維二糖 糖巧酶（cellobiosidase)或纖維二糖水解酶，EC3. 2. 1. 91、EC3. 2. 1. 176)、β-葡糖巧酶 巧C3. 2. 1. 21)運Ξ種酶。另一方面，半纖維素的構(gòu)成因植物的種類而異，例如，在闊葉樹和 草本植物中，木聚糖構(gòu)成了主要成分。對于木聚糖的水解，需要木聚糖酶（內(nèi)切-1，4-β-木 聚糖酶，EC3. 2. 1.8)、β-木糖巧酶巧C3. 2. 1. 37)。β-木糖巧酶對通過木聚糖酶水解半 纖維素生成的低聚糖進行水解，是設(shè)及單糖生成工藝的水解酶之一。 陽0化]在W往的W木質(zhì)纖維素為資源的生物乙醇的制造中，W乙醇的高能效轉(zhuǎn)化為目 的，嘗試了基于高固液比（30~60%的固液比）的糖化處理（hy化olysisprocess)。運種 基于高固液比的木質(zhì)纖維素的酶糖化，生物質(zhì)糖化液的粘性高，難W進行木質(zhì)纖維素的水 解反應(yīng)。因此，通過使用耐熱性酶在例如80°CW上的高溫下進行木質(zhì)纖維素的酶解糖化處 理，除了加快水解反應(yīng)速度之外，降低了生物質(zhì)糖化液的粘性，從而有望實現(xiàn)縮短糖化反應(yīng) 時間并降低酶量。因此，對于各種糖巧水解酶，期望開發(fā)耐熱性更優(yōu)異的酶。
[0006] 大多數(shù)耐熱性糖巧水解酶可W通過如下方式獲得：對生存于高溫環(huán)境下的嗜熱性 微生物進行分離鑒定，從運些分離培養(yǎng)的微生物中克隆基因，確定DNA序列后，利用大腸桿 菌或絲狀真菌等表達而獲得。例如，專利文獻1公開了來源于絲狀真菌的β-木糖巧酶，專 利文獻2公開了在30°C表現(xiàn)出酶活性的、來源于絲狀真菌米曲霉（Aspergillus0巧zae)的 0-木糖巧酶。專利文獻3中公開了在抑5.5W下、50°CW上表現(xiàn)出酶活性的、來源于酸熱 脂環(huán)酸芽抱桿菌（Alixyclobacillusacidocaldarius)的β-木糖巧酶。專利文獻4公開 了在45°C表現(xiàn)出酶活性的、來源于解纖維頂抱霉（Acremoniumcellulolyticus)的β-木 糖巧酶。另外，非專利文獻1~6報道了最適溫度為6(TC左右的、分離自特定細菌或絲狀真 菌的β-木糖巧酶。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 陽00引專利文獻
[0009] 專利文獻1 :特表平第11-507837號公報
[0010] 專利文獻2 :特開平第11-313683號公報
[0011] 專利文獻3 :特表第2011-523346號公報
[0012] 專利文獻4 :特開第2013-59272號公報
[0013] 非專利文獻
[0014] 非專利文獻 1 :Ko;rmelink等，《JournalofBiotechnology(生物技術(shù)雜志）》， 1993 年，第 27 卷，第 249-265 頁。
[0015] 非專利文獻 2iHerrmann等，《BiochemicalJournal(生化雜志）》，1997 年，第 321 卷，第375-381頁。
[0016] 非專利文獻 3:kitamoto等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology應(yīng)用 與環(huán)境微生物學(xué)）》，1999年，第65卷，第20-24頁。
[0017] 非專利文獻 4:LaGrange等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology應(yīng)用 與環(huán)境微生物學(xué)）》，2001年，第67卷，第5512-5519頁。
[0018] 非專利文獻 5 :化ao等，《AppliedandlinvironmentalMicrobiology(應(yīng)用與環(huán) 境微生物學(xué)）》，2011年，第77卷，第719-726頁。
[0019] 非專利文獻6:Morais等，《JournalofBiologicalQiemistry(生物化學(xué)雜 志）》，2012年，第287卷，第9213-9221頁。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0021] 本發(fā)明的目的是提供一種至少在85°C且P冊.0的條件下表現(xiàn)出W對硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧（PNP訝為底物的水解活性的新耐熱性β-木糖巧酶、編碼上述耐熱 性β-木糖巧酶的多核巧酸、用于表達上述耐熱性β-木糖巧酶的表達載體、整合了上述表 達載體的轉(zhuǎn)化體、W及使用上述耐熱性β-木糖巧酶制造木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的方法。
[0022] 解決技術(shù)問題的技術(shù)手段
[0023] 本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題，通過從溫泉高溫±壤中直接提取DNA來進行 難培養(yǎng)微生物群的大規(guī)模宏基因組測序，成功獲取具有新的氨基酸序列的耐熱性β-木糖 巧酶，從而完成了本發(fā)明。
[0024]目Ρ，作為本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶、多核巧酸、表達載體、轉(zhuǎn)化體、耐熱性 0-木糖巧酶的制造方法、糖巧水解酶混合物、W及木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法，可W 列舉下列山~[10]。
[00對 山一種耐熱性β-木糖巧酶，其特征在于具有由下列（Α)、做或似構(gòu)成的 β-木糖巧酶催化區(qū)域：
[0026] (Α)由序列號1所示氨基酸序列構(gòu)成的多膚；
[0027] 度）由序列號1所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添加而形成 的氨基酸序列所構(gòu)成的、并且至少在85°C且Ρ冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃 木糖巧為底物的水解活性的多膚； 陽02引 似由與序列號1所示氨基酸序列具有80%W上序列一致性的氨基酸序列構(gòu)成 的、并且至少在85°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木糖巧為底物的水解 活性的多膚。
[0029] 凹上述山的耐熱性β-木糖巧酶，其進一步具有β-葡糖巧酶活性。
[0030] 閒一種多核巧酸，其具有由下列（a)~（e)的堿基序列構(gòu)成的編碼β-木糖巧酶 催化區(qū)域的區(qū)域：
[0031] (a)編碼由序列號1所示氨基酸序列構(gòu)成的多膚的堿基序列；
[0032] 化）編碼由序列號1所示氨基酸序列中的至少一個氨基酸的缺失、取代或添 加而形成的氨基酸序列所構(gòu)成的、并且至少在85 °C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧為底物的水解活性的多膚的堿基序列；
[0033] (C)編碼由與序列號1所示氨基酸序列具有80%W上序列一致性的氨基酸序列構(gòu) 成的、并且至少在85°C且Ρ冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木糖巧為底物的水 解活性的多膚的堿基序列；
[0034] (d)與序列號2或3所示堿基序列具有80%W上序列一致性、并且編碼至少在 85°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木糖巧為底物的水解活性的多膚的 堿基序列；
[0035] (e)與由序列號2或3所示堿基序列構(gòu)成的多核巧酸在嚴格條件下進行雜交的多 核巧酸的堿基序列、且編碼至少在85°C且P冊.0的條件下具有W對硝基苯基-β-D-化喃木 糖巧為底物的水解活性的多膚的堿基序列。
[0036] [4]上述巧]的多核巧酸，上述多膚進一步具有β-葡糖巧酶活性。
[0037] [引一種表達載體，其整合了上述[3]或[4]的多核巧酸，在宿主細胞中可表達具 有0-木糖巧酶活性的多膚。
[00測 [6] -種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有上述閒的表達載體。
[0039] [7]上述[6]的轉(zhuǎn)化體，其為真核微生物。 W40] 閒上述耐熱性β-木糖巧酶的制造方法，其包括在上述[6]或[7]的轉(zhuǎn)化體中生 產(chǎn)上述耐熱性β-木糖巧酶。
[OOW[9] -種糖巧水解酶混合物，其包含上述山或凹的耐熱性β-木糖巧酶、上述 [3]或[4]的多核巧酸編碼的耐熱性β-木糖巧酶、或者利用上述[引的耐熱性β-木糖巧 酶的制造方法制得的耐熱性β-木糖巧酶及至少一種其他糖巧水解酶。
[0042] [10] -種木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物的制造方法，其包括使含有纖維素、半纖維素及木 質(zhì)素的木質(zhì)纖維素所形成的材料與上述[1]或[2]的耐熱性β-木糖巧酶、上述[3]或[4] 的多核巧酸編碼的耐熱性β-木糖巧酶、上述[6]或上述[7]中記載的轉(zhuǎn)化體、利用上述 [引的耐熱性β-木糖巧酶的制造方法制得的耐熱性β-木糖巧酶、或者上述[9]的糖巧水 解酶混合物接觸，由此生產(chǎn)木質(zhì)纖維素分解產(chǎn)物。 陽0創(chuàng)發(fā)明效果
[0044] 本發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶至少在85°C且Ρ冊.0的條件下具有W對硝基苯 基-β-D-化喃木糖巧（下面有時縮寫為PNP訝為底物的水解活性。因此，上述耐熱性β-木 糖巧酶適合于高溫條件下的、木質(zhì)纖維素所形成的材料的糖化處理。
[0045] 此外，作為另一方面，上述耐熱性β-木糖巧酶適合于高溫條件下的、包含具有 e-木糖巧鍵的低聚糖的材料的糖化處理。
[0046] 此外，作為又一方面，上述耐熱性β-木糖巧酶適合于高溫條件下的、包含具有 0 -木糖巧鍵的低聚糖、或具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料的糖化處理。
[0047]另外，上述包含具有β-木糖巧鍵的低聚糖的材料可通過例如對包含半纖維素的 木質(zhì)纖維素進行木聚糖酶的水解而得到。上述包含具有β-葡糖巧鍵的低聚糖的材料可通 過例如對包含纖維素的木質(zhì)纖維素進行纖維二糖水解酶的水解而得到。此外，本發(fā)明的多 核巧酸、整合了上述多核巧酸的表達載體、導(dǎo)入有上述表達載體的轉(zhuǎn)化體適合用于制造本 發(fā)明的耐熱性β-木糖巧酶。
【附圖說明】
[0048] 圖1為基因克隆AR19M-346-18的β-木糖巧酶活性催化區(qū)域的氨基酸序列（序 列號1)與F'ervidobacteriumgondwanense的G冊木糖巧酶（序列號7)的氨基酸序列的 比對圖。 W例 圖2為表示實施例1中的AR19M-346-18基因在大腸桿菌中表達得到的 AR19M-346-18蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果的圖。
[0050] 圖3為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白對各底物的水解 活性的測定結(jié)果的圖。
[0051] 圖4為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白在各溫度下的 PNK(水解活性（P冊.0)的測算結(jié)果的圖。 陽05引 圖5為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白在各抑的PNPX 水解活性（70°C)的測算結(jié)果的圖。
[0053] 圖6為表示實施例1中的大腸桿菌所表達的AR19M-346-18蛋白示出的、伴隨熱變 性而引發(fā)的SYPR0化ange(寶石澄蛋白染色試劑）的巧光強度變化的圖。
【具體實施方式】
[0054][耐熱性β-木糖巧酶]
[0055] 眾所