GH61家族糖苷水解酶基因PpGH61及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從真菌中分離的GH61家族糖苷水解酶基因，尤其涉及一種從檜狀青 霉（Penicillium piceum)中克隆得到的GH61家族糖苷水解酶基因及其cDNA序列，本發(fā)明 還提供了涉及含有該GH61家族糖苷水解酶cDNA序列的重組表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞，以 及它們在木質(zhì)纖維素水解等的應(yīng)用，屬于真菌的功能基因的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著能源危機(jī)的加劇，可持續(xù)再生能源的研究成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。利用可 再生的纖維素資源生產(chǎn)生物乙醇（bioethanol)已成為克服能源危機(jī)的有效途徑之一。在 生產(chǎn)生物乙醇的流程中，纖維素酶降解木質(zhì)纖維素是整個(gè)過程的至關(guān)重要的一步。目前，纖 維素酶水解效率低下是纖維素乙醇（由木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生成的燃料乙醇）工業(yè)化生產(chǎn)的主 要瓶頸之一。除提高纖維素酶的本身活性外，一些具有促進(jìn)纖維素酶活性的蛋白逐漸進(jìn)入 人們的視野，如GH61糖苷水解酶家族蛋白。
[0003] GH61家族蛋白在水解過程中起的作用直到近年來才被認(rèn)知。Thielavia terrestris的胞外酶液對木質(zhì)纖維素和傳統(tǒng)的糖苷水解酶底物無水解作用。但將 T.terrestris的發(fā)酵液與等量的里氏木霉（Trichoderma reesei)纖維素酶混合后，使 復(fù)合纖維素酶的總量減少一半仍能保證相同的水解效果。通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，在 T.terrestris找到了 3個(gè)蛋白，可以顯著提高纖維素酶水解效率（Harris et al. 2010)。這 一系列的酶由于具有具有微弱的內(nèi)切葡聚糖酶活性，所以起初一直被作為糖苷水解酶。后 來發(fā)現(xiàn)GH61蛋白并不是傳統(tǒng)意義上的糖苷水解酶，GH61蛋白的這種結(jié)構(gòu)類似于CBM33家 族蛋白，被認(rèn)為是CBM33家族的真菌類似物（Vaajc-Kolstad et al.2010)，但目前尚沿用 GH61糖苷水解酶這個(gè)名稱。GH61家族糖苷水解酶在纖維素的水解中起著關(guān)鍵的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人在已有檜狀青霉9-3中克隆得到GH61家族糖苷酶編碼基因，研究該基因 對水解的影響。通過與對照組相比，發(fā)現(xiàn)PPGH61糖苷水解酶基因與纖維素酶的機(jī)制不同， GH61蛋白雖然沒有酶活，但是通過在木質(zhì)纖維素水解過程中在固有酶系里添加GH61蛋白 能夠促使其他纖維素酶發(fā)揮更高效力。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證了其功能，初步驗(yàn)證了 PPGH61基 因促使纖維素水解。
[0005] 鑒于上述狀況，本發(fā)明目的之一在于提供一種從檜狀青霉中克隆得到的GH61家 族糖苷酶編碼基因PpGH61及其cDNA序列以及編碼蛋白。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于構(gòu)建一種涉及包括所述GH61家族糖苷酶PpGH61cDNA的重 組表達(dá)載體及重組宿主細(xì)胞。
[0007] 本發(fā)明的目的之三是將含有該GH61糖苷酶編碼基因PpGH61或其cDNA應(yīng)用于木 質(zhì)纖維素水解等方面的作用。
[0008] 具體地，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0009] -種具有促進(jìn)纖維素水解功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的堿基序列如（a) 或（b)或（c)或（d)所示：
[0010] (a)如 SEQ ID N0 :1 所示；
[0011] (b)如 SEQ IDN0 :2 所示；
[0012] (c)編碼如SEQ ID N0 :3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0013] (d)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與（a)或（b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有促進(jìn)纖維 素底物水解功能的核苷酸序列。
[0014] -種具有促進(jìn)纖維素水解功能的蛋白質(zhì)，其氣基酸序列如SEQIDN0 :3所不。由 于氨基酸密碼子存在簡并性，同一種氨基酸具有兩個(gè)或更多個(gè)密碼子的現(xiàn)象稱為密碼子的 簡并性（degeneracy)。對應(yīng)于同一種氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼子（synonymous codon)。簡并性使得那些即使密碼子中堿基被改變，仍然能編碼出原氨基酸。密碼子的簡 并性也使核苷酸分子上堿基組成有較大余地的變動。所以，本發(fā)明所述的核苷酸分子包括 但不限于以上的多核苷酸序列，還存在很多能夠編碼PPGH61蛋白的可能的多核苷酸序列， 這里不在一一列舉。
[0015] -種載體，所述載體含有所述的核苷酸序列和與所述核苷酸序列可操作地連接的 用于表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明中使用的用于表達(dá)的調(diào)節(jié)序列可以使用多種適于該核苷酸序 列的表達(dá)載體，它們能夠在多種真核宿主細(xì)胞和原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
[0016] 在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，所述載體為PpGH61的敲除載體。所述基因敲除 載體包括GH61糖苷酶PpGH61DNA的上游1000bp-2000bp長度序列，抗性篩選基因，GH61 糖苷酶PPGH61DNA的下游1000bp-2000bp長度序列；其中，抗性篩選基因在GH61糖苷酶 PpGH61DNA的上游序列和下游序列中間。通過將該基因敲除載體轉(zhuǎn)化至檜狀青霉中得到重 組轉(zhuǎn)化體，即GH61糖苷酶PpGH61基因功能缺失的突變體。
[0017] 本發(fā)明構(gòu)建的PpGH61基因敲除載體包含PpGH61DNA序列的上下游同源重組片段， 利用重組質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除時(shí)，目的基因就能被抗性篩選基因完全替換。
[0018] 對PpGH61敲除突變體的酶活以及水解效率測定結(jié)果表明，該基因的缺失并不影 響纖維素酶各個(gè)組分酶活以及蛋白分泌量。但是PPGH61敲除突變體的水解效率大大降低。
[0019] 宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有所述的核苷酸序列、或所述的載體。該宿主細(xì)胞可以 與PpGH6同源或異源。
[0020] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為里氏木霉細(xì)胞。
[0021 ] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，一種獲得所述的載體的方法，包括：
[0022] 利用 SEQ ID N0 :6 和 SEQ ID N0 :7 所示的引物序列，及 SEQ ID N0 :8 和 SEQ ID N0:9所示的引物序列，分別各自從檜狀青霉（Penicillium piceum)9-3中克隆得到如SEQ ID NO :4和SEQ ID N0:5所示的兩條核苷酸序列，并將所述兩條多核苷酸序列分別各自連 接到敲除載體 pBS-Hygr (Liu XH，Lu JP，Zhang L，Dong B，Min H，Lin FC. Involvement of a Magnaporthe grisea serine/threonine kinase gene，MgATGl，in appressorium turgor and pathogenesis. Eukaryotic Cell 2007;6:997-1005.)上，以構(gòu)建得到 PpGH61 基因的 敲除載體。
[0023] -種促進(jìn)纖維素水解的方法，包括：
[0024] a?提供
[0025] (1)纖維素水解過程中的固有酶系；和，
[0026] (2)PpGH61蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0 :3所示；以及，
[0027] b.提供含有纖維素底物的樣品，并使該含有纖維素底物的樣品暴露于a中。
[0028] 優(yōu)選的是，所述的促進(jìn)纖維素水解的方法中，所述步驟a中，提供纖維素水解過程 中的固有酶系和PpGH61蛋白的具體步驟包括：
[0029] 步驟一、構(gòu)建PpGH61基因過表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化到里氏木霉中異源表達(dá)獲得里 氏木霉PpGH61基因過表達(dá)菌株；
[0030] 步驟二、培養(yǎng)步驟一中得到的里氏木霉PpGH61基因異源過表達(dá)菌株并收集發(fā)酵 液；所述發(fā)酵液中含有纖維素水解過程中的固有酶系和PPGH61蛋白；
[0031] 所述b中，所述發(fā)酵液的用量按照該發(fā)酵液中的纖維素酶活為10IU/g纖維素底物 添加，使該含有纖維素底物的樣品暴露于所述發(fā)酵液中。所述的核苷酸序列、所述的蛋白 質(zhì)、所述的載體、或所述的宿主細(xì)胞用于促進(jìn)纖維素底物水解的用途。
[0032] 所述的蛋白質(zhì)用于在絲狀真菌中尋找同源蛋白的用途。本發(fā)明提供了利用上述 PpGH61編碼的蛋白質(zhì)為目標(biāo)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其他親緣關(guān)系較近的絲狀真菌中尋找 同源蛋白的思路上，如：黑曲霉（Aspergillus niger)，里氏木霉等。
[0033] 本發(fā)明所述的蛋白可具有多種蛋白變體，蛋白變體可由遺傳多態(tài)性或人為操作產(chǎn) 生，這些操作方法通常為本領(lǐng)域所了解。例如，可通過DNA的突變來制備轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸 序列變體或片段，其中由于誘變或改變多核苷酸的方法為本領(lǐng)域所習(xí)知。其中，保守的取代 是將一種氨基酸殘基替換成具有相似性質(zhì)的另一種氨基酸。
[0034] 本發(fā)明將克隆得到的GH61糖苷酶PpGH61eDNA或全基因可操作的與表達(dá)調(diào)控元件 相連接，構(gòu)建獲得重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到里氏木霉中異源表達(dá)，可以提高里 氏木霉的水解率。所述重組表達(dá)載體或表達(dá)盒包括啟動子、PpGH61cDNA或全基因、終止子； 其中，PpGH61cDNA序列或全基因位于啟動子的下游，終止子在PpGH61cDNA序列的下游。
[0035] 本發(fā)明的有益效果為：
[0036] 本發(fā)明在檜狀青霉中克隆得到GH61糖苷酶編碼基因，初步驗(yàn)證了GH61基因促使 纖維素水解。因此，通過在木質(zhì)纖維素水解過程中在固有酶系里添加GH61蛋白，可以大大 提高酶解效率，降低酶用量，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本。