一種高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶雙點突變體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種兼具高轉(zhuǎn)糖苷活性、低水解活性的β?半乳糖苷酶雙點突變體，該突變體是對β?半乳糖苷酶BgaB的E303和F341兩個位點進行定點突變，其中，E303點位由原谷氨酸Glu突變?yōu)榘腚装彼酑ys，F(xiàn)341點位由原苯丙氨酸Phe突變?yōu)榻z氨酸Ser，然后將雙點突變體經(jīng)KI氧化處理所得。本發(fā)明還涉及所述雙點突變體的構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明以嗜熱脂肪芽孢桿菌來源β?半乳糖苷酶BgaB為功能改造對象，所得的雙點突變體催化底物乳糖能夠獲得大于二糖的低聚糖混合物，合成量達到9.5％，且降低了其對合成產(chǎn)物的降解能力。此外，本發(fā)明的突變體適用于中性、高溫度條件下催化乳糖水解與低聚半乳糖合成。
【專利說明】一種高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶雙點突變體及 其制備方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性 的β-半乳糖苷酶雙點突變體，還涉及一種高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶雙點突 變體的制備方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 工業(yè)制備低聚半乳糖(G0S)主要以乳糖為底物，通過β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷酶催 化作用合成。0-半乳糖苷酶(0-〖3]^(：1：〇81(^86)全稱為0-〇-半乳糖苷半乳糖水解酶(0-〇-galactoside hydrolase，EC 3.2.1.23)，具有催化乳糖水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種功能。但是，由于 半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性低，且存在底物水解的催化特點，使其成為制約低聚半乳糖合成 量和導(dǎo)致聚合度多樣化的主要技術(shù)瓶頸問題。
[0003] 近年來，雖然人們也對β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性進行了基礎(chǔ)理論研究和功能改 造，但對G0S合成能力的分子改良方法還存在許多不足。主要體現(xiàn)在三個方面，一是酶的最 適作用條件不能完全適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)實際條件;二是分子改造目標位點范圍較大，需通過高 通量篩選獲得優(yōu)化突變體;三是，在針對轉(zhuǎn)糖苷活性的改造過程中沒有考慮到水解活性的 反向催化作用。如，中國發(fā)明專利申請CN 201410148999公開一種半乳糖苷酶突變體。該突 變體為在亮白曲霉或米曲霉半乳糖苷酶的基礎(chǔ)上通過單位點的定點飽和突變而得。由于 亮白曲霉或米曲霉來源β-半乳糖苷酶為適酸性β-半乳糖苷酶，其最適pH在ρΗ2.5~5.5，這 一催化特性一定程度上限制了其作為催化劑在高溫及中性條件下合成低聚半乳糖。
[0004] 另一方面，CN 201410148999的突變體的成功獲得需要依靠生物信息學(xué)及預(yù)測算 法的準確性，同時還需要配合高靈敏度較高的高通量篩選方法，操作繁雜且成功率相對較 低。這種方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)糖苷活性的改造時，由于篩選的單向性，不能有效的兼顧水解活性對 轉(zhuǎn)糖催化效率的影響作用，導(dǎo)致篩選所得轉(zhuǎn)糖苷活性提高突變體存在水解活性同時提高的 現(xiàn)象。
[0005] 近年來，圍繞嗜熱脂肪芽孢桿菌來源β-半乳糖苷酶BgaB結(jié)構(gòu)與功能的研究在不斷 發(fā)展，2〇11年￥6〇即-8111(;[1]1等人對〇&1(1;[。61111108；[1'即1：(^8&(^11&1'0171:;[(3118來源耐熱0-半 乳糖苷酶(Csac_1018)的研究中發(fā)現(xiàn)F349位點對底物抑制作用具有影響。2013年Yi-Ning Dong等人對β-半乳糖苷酶BgaB的F341位點功能進行了研究報道（Yi-Ning Dong, Ling Wang ,Qiong Gu,Haiqinin Chen ,Xiaoming Liu ,Yuanda Song,ffei Chen , Arnold T.Hagler,Hao Zhang,Jun Xu.2013.Optimizing lactose hydrolysis by computer-guided modification of the catalytic site of a wild-type enzyme.Mol Divers, 17:371-382)。08&(：_1018與88&8同屬6!1-42家族，二者比對結(jié)果顯示序列同源性為98%， BgaB的F341位點與Csac_1018的F349為同一保守功能位點。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006]本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，通過對Phe341位點的改造獲得具有底物抑 制作用的突變體酶(F341S)，再以突變體酶F341S為對象，通過對其E303位點的定點突變，獲 得了兼具高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的半乳糖苷酶BgaB雙點突變體。
[0007]此外，通過制備方案的改進，本發(fā)明將定點突變與化學(xué)修飾相結(jié)合的基因改造方 法應(yīng)用于β-半乳糖苷酶的雙向催化功能改造，期望獲得一種不依賴高通量活性篩選的高效 定向功能改造方法。
[0008] 為此，本發(fā)明的目的是提供一種高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶雙點突 變體。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述雙點突變體的制備方法，以及所述雙點突變體的 應(yīng)用。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種兼具高轉(zhuǎn)糖苷活性、低水解活性的β-半乳糖 苷酶雙點突變體，該突變體是對β-半乳糖苷酶BgaB的Ε303和F341兩個位點進行定點突變， 其中，E303點位由原谷氨酸Glu突變?yōu)榘腚装彼酑ys，F(xiàn)341點位由原苯丙氨酸Phe突變?yōu)榻z氨 酸Ser，然后將雙點突變體經(jīng)KI氧化處理所得。
[0011]在本發(fā)明中，所述半乳糖苷酶BgaB是嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷 酶BgaB。
[0012] 優(yōu)選地，用于進行氧化處理的所述KI的濃度為0.2M或以上。
[0013] 本發(fā)明還提供上述雙點突變體的制備方法，該制備方法的步驟如下：
[0014] A、雙點突變體酶的構(gòu)建
[0015] 以含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的突變體耐熱β-半乳糖苷酶基因 BgaB'質(zhì)粒 pKK223-3-bgaB-F341S為模板，以快速全質(zhì)粒擴增突變法對位點E303構(gòu)建半胱氨酸(Cys)替 換單點突變體，得到雙位點突變體E303C/F341S:
[0016] B、雙點突變體酶的表達與純化
[0017]將全質(zhì)粒擴增得到的雙點突變PCR片段經(jīng)膠回收及雙酶切后，與pKK223-3載體的 雙酶切產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞（由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌 種庫（Culture Collection ofFood Microorganisms , Jiangnan University CCFM)。挑取 重組菌單克隆接種于5mL含有l(wèi)OOyg/mL氨芐青霉素的LB抗性培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培 養(yǎng)過夜，按以體積比計1 %接種量將種子液接種于含有l(wèi)OOyg/mL氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng) 基中，37°C振蕩培養(yǎng)，當OD600達到0.6~1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG直至終濃度為lmM，20°C過夜 誘導(dǎo)表達后，對發(fā)酵液進行離心，去上清、收集菌體，再以5~10倍體積100mM磷酸緩沖液重 懸，加入蛋白酶抑制劑后進行超聲波破壁，得到破胞液;將破胞液進行熱處理去除不耐熱的 雜蛋白后，離心收集上清液，得到粗酶液；
[0018] 將上述粗酶液經(jīng)0.22μπι濾膜過濾，再用鎳親和柱純化分離后收集洗脫液，然后用 50mM pH 7.0磷酸緩沖液透析去除咪唑，再用聚乙二醇包埋濃縮制得純化的突變體酶；
[0019] C、突變體酶的氧化
[0020] 將步驟B得到的突變體酶進行氧化反應(yīng)，氧化反應(yīng)體系如下：100yL0.25M PH6.5磷 酸鹽緩沖溶液、〇. 2M KI溶液、10μΜ Br、3μΜ突變體酶，在溫度25°C條件下處理30h，得到所述 高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的半乳糖苷酶雙點突變體。
[0021] 根據(jù)一種可選的實施方式，步驟Α的擴增引物為：
[0022] E303C/F341S 上游引物：
[0023] 5 '-GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3'
[0024] E303C/F341S 下游引物：
[0025] 5 '-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3，
[0026] PCR 反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 2min; 95 °C 變性 30s; 58 °C ~64°C 30s; 68 °C 7min，16 個 循環(huán)后，最后68°C延伸15min;
[0027] PCR反應(yīng)體系為：
[0029] 步驟A中，含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的突變體耐熱β-半乳糖苷酶基因 BgaB'質(zhì)粒 模板pKK223-3-bgaB_F341 S可根據(jù)已公開的文獻（Y · N· Dong，Ling Wang，Qiong Gu，Haiqin Chen ,Xiaoming Liu ,Yuanda Song,Wei Chen , Arnold T.Hagler,Hao Zhang ,Jun Xu. Optimizing lactose hydrolysis by computer-guided modification of the catalytic site of a wild-type enzyme .Molecular Diversity · 2013，17:371-382)直接 構(gòu)建獲得。通過含有F341S突變的酶基因的質(zhì)粒模板pKK223-3-bgaB-F341S，進過一次擴增 實現(xiàn)相對于原始酶基因發(fā)生了兩個位點突變的雙位點突變體E303C/F341S。
[0030] 其中，全質(zhì)粒擴展產(chǎn)物可直接用于轉(zhuǎn)化表達，優(yōu)選地，步驟A中進行基因構(gòu)建可防 止載體發(fā)生突變干擾正常表達。
[0031] 優(yōu)選地，步驟B中超聲波破壁的工作條件為：功率400W循環(huán)工作，每個循環(huán)包括工 作Is和停止9s，總破壁時間為30min。
[0032] 優(yōu)選地，步驟B的熱處理條件為破胞液在55°C下熱處理30min。
[0033] 根據(jù)另一種優(yōu)選的實施方式，步驟B中，用鎳親和柱純化分離后收集洗脫液的過程 如下：向4mL鎳親和柱加入5倍柱體積去離子水至柱頂端自然洗脫后用2~3倍體積的含20mM 咪挫的Binding buff er自然洗脫;再將經(jīng)0.22μηι濾膜過濾的粗酶液上柱，慢流使樣品與柱 充分結(jié)合，待樣品流干后分別用6倍柱體積的Washing buff er連續(xù)梯度洗脫洗脫雜蛋白質(zhì) 三次，最后用4倍Elution buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫液；
[0034] 所述Washing buffer分別含咪唑20mM、80mM、100mM;所述Elution buffer含250mM 咪唑。
[0035] 根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，步驟C中，雙點突變體氧化反應(yīng)體系組成包括:100yL磷 酸鹽緩沖溶液中包含有KI溶液、Br、突變體酶;氧化反應(yīng)條件為：在溫度25°C條件下處理 30h〇
[0036] 特別優(yōu)選地，步驟C中ΚΙ溶液濃度為0.2-0.3M。
[0037] 本發(fā)明還涉及上述高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶雙點突變體在生產(chǎn) 低聚半乳糖中的用途。
[0038]與野生型酶對比，在乳糖初始濃度為500mM條件下，通過本發(fā)明的雙點突變體催化 能夠獲得大于二糖的低聚糖混合物，且將野生型酶在20h的G0S合成量由0%提高到9.5%。 以上結(jié)果表明本發(fā)明的雙點突變體相對野生型酶，降低了水解活性低，提高了轉(zhuǎn)糖基活性， 并同時降低了其對合成產(chǎn)物的降解能力。
[0039]另一方面，本發(fā)明所涉及的嗜熱脂肪芽孢桿菌來源β_半乳糖苷酶BgaB屬于糖苷水 解酶GH42家族，是一種具有工業(yè)應(yīng)用潛力的耐熱酶，其最適作用pH為中性，適用于60-70°C 的高溫度條件下催化乳糖水解與低聚半乳糖合成，克服了現(xiàn)有技術(shù)中需要在酸性、較低溫 度下反應(yīng)的限制。
[0040] 此外，針對目前本研究領(lǐng)域存在的主要研究方法缺陷問題，本發(fā)明以嗜熱脂肪芽 孢桿菌來源β-半乳糖苷酶BgaB為功能改造對象，采用定點突變體與化學(xué)修飾結(jié)合的方法， 實現(xiàn)了轉(zhuǎn)糖苷活性的高效改造。并在提高轉(zhuǎn)糖苷活性的同時，抑制了水解催化活性的反向 水解作用，有效提高了低聚半乳糖的合成量。
[0041] 本發(fā)明基于催化氨基酸位點的構(gòu)建方法適用于所有采用保持型(Retaining)催化 機制β-半乳糖苷酶進行轉(zhuǎn)糖苷活性改造。 【【附圖說明】】
[0042]圖1為乳糖和半乳糖分子與β_半乳糖苷酶BgaB活性口袋結(jié)合模型；
[0043]其中，A、酶-乳糖結(jié)合模式;B、酶-半乳糖結(jié)合模式；
[0044] 圖2為野生性及突變酶SDS-PAGE分析；
[0045] 其中，Μ為marker，泳道1為野生型，泳道2為未經(jīng)過氧化的E303C/F341S突變體 [0046] 圖3為KI氧化處理對野生型和E303C/F341S突變體的酶活影響；
[0047] 其中，A. KI濃度對野生型和突變體酶活的影響；B.時間對野生型和最優(yōu)氧化處理 突變體酶活的影響
[0048] 圖4為β-半乳糖苷酶催化乳糖合成G0S過程中的反應(yīng)產(chǎn)物變化；
[0049] 其中，Α、野生型酶，Β、突變體0X-E303C/F341S;
[0050] 圖5為野生型酶及0X-E303C/F341S突變體催化乳糖反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜；
[0051 ] 其中，Α、野生型酶;B、0x-E303C/F341S突變體。 【【具體實施方式】】
[0052] 在本發(fā)明中如無特別聲明，用于解釋濃度的"％"均表示重量百分比。
[0053] 實施例1
[0054] 1 ·構(gòu)建E303C/F341S雙點突變體
[0055] 通過分子模擬及半乳糖、與底物對接預(yù)測了參與嗜熱脂肪芽孢桿菌來源耐熱β-半 乳糖苷酶BgaB底物結(jié)合氨基酸位點，并通過點突變驗證并研究了底物結(jié)合位點對酶催化活 性的調(diào)控功能。其中Glul48和Glu303為催化位點（如圖1所示）。而在參與底物結(jié)合的非催化 位點中，Phe341位點的突變可以改變酶對水解產(chǎn)物半乳糖的親和能力，調(diào)控反應(yīng)產(chǎn)物半乳 糖對酶活的抑制作用。已有的研究表明，催化氨基酸位點及非親核作用的功能位點對酶的 轉(zhuǎn)糖苷活性具有調(diào)節(jié)作用。為改善和開發(fā)該酶的轉(zhuǎn)糖苷催化功能，選擇Glu303和Phe341氨 基酸位點作為改造目標位點，通過對兩個功能位點研究雙點累積突變對酶的轉(zhuǎn)糖苷活性調(diào) 控作用
[0056]對此，以含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β_半乳糖苷酶單點突變基因 BgaB'的 質(zhì)粒pKK223-3-bgaB-F341S為模板（該模板中，F(xiàn)341點位由原苯丙氨酸Phe突變?yōu)榻z氨酸 Ser )，米用快速全質(zhì)粒擴增突變法（QuickChange? site-directed mutagenesis protoco 1)針對Glu303位點構(gòu)建(Cy s)雙點突變體，引物設(shè)計如下：
[0058] PCR 反應(yīng)條件為 94°C 預(yù)變性 2min;95°C 變性 30s;58°C ~64°C30s;68°C7min，16 個循 環(huán)后，最后68°C延伸15min;
[0059] PCR反應(yīng)體系如下：
[0062] 2.突變體的表達與純化
[0063]將全質(zhì)粒擴增得到的雙點突變PCR片段經(jīng)膠回收及雙酶切后，與pKK223-3載體的 雙酶切產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞（由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌 種庫（Culture Collection ofFood Microorganisms,Jiangnan University CCFM)〇其中， 全質(zhì)粒擴展產(chǎn)物可直接用于轉(zhuǎn)化表達，此處進行基因構(gòu)建是為了防止載體發(fā)生突變干擾正 常表達。
[0064] 野生型及突變體酶C-端均融合有6XHis標簽用于純化。挑選野生型與突變體重組 菌單克隆接種于5mL含有100yg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過夜。按 1 %接種量將飽和種子液接種于200mL添加有氨芐青霉素（100yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)。當0D6QQ達到0.6~1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度達ImM)。20°C過夜誘導(dǎo)表達 后，將發(fā)酵液于3000rpm下離心20min，去上清、收集菌體。用5~10倍體積lOOmM磷酸緩沖液 (pH7.0)重懸，加入蛋白酶抑制劑（1 X Cocktai 1)后，超聲波破壁。破壁工作條件為:工作1 s， 停9s，循環(huán)30min。將破胞液55°C熱處理30min去除不耐熱的雜蛋白后，12000rpm離心20min 收集上清，即得粗酶液。
[0065]其中，LB液體培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，余量為 水。
[0066] LB抗性培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中加入氨卞青霉素至終濃度為100yg/mL，用于重組菌 的培養(yǎng)和篩選。
[0067] 將雙點突變體酶的粗酶液進行鎳親和柱(Ni-Chelating Column，購自Qingen公 司）純化：向4mL鎳親和柱加入5倍柱體積去離子水至柱頂端自然洗脫后用2~3倍體積的 Binding buffer(含咪唑濃度20mM)自然洗脫;再將經(jīng)0.22μηι濾膜過濾的粗酶液上柱，慢流 使樣品與柱充分結(jié)合，待樣品流干后分別用6倍柱體積的Washing buffer (分別含咪唑濃度 20mM、80mM、100mM)連續(xù)梯度洗脫洗脫雜蛋白質(zhì)，最后用4倍Elutionbuffer(含250mM咪唑） 洗脫目的蛋白，收集洗脫液。然后用50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)透析除去咪唑，再用聚乙二醇 包埋濃縮得到純化的突變體酶E303C/F341S。
[0068] 采用Basic 041BR蛋白質(zhì)電泳儀SDS-PAGE，經(jīng)Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng)，顯示野 生型及雙點突變體酶均得到大小為70kDa單一的蛋白條帶(如圖2所示）。表明雙點累積突變 體酶的分子量與野生型酶一致。
[0069] 3.比酶活測定
[0070] 按中性乳糖酶的酶活檢測方法Gist-Bracades法測定野生型耐熱β-半乳糖苷酶、 單點突變體酶E303C和雙點突變體酶E303C/F341S的酶活。
[0071]以oNPG(鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)為底物，一個中性乳糖酶單位定義為:在溫 度70°C、pH6.5條件下，每分鐘水解產(chǎn)生Ιμπιο?的oNP(鄰硝基苯酚)所需的酶量為一個中性乳 糖酶活性單位(NLU或U)。
[0072] 分別取0. lmL酶液和0.9mL磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)加入10mL離心管中，混合，調(diào)溫 至70°C。加5. OmL 0.25%的oNPG，混勻，同時開始計時。反應(yīng)10min后迅速取出置于冰水浴中 并加入2.OmL 5%Na2C03終止反應(yīng)。室溫下用分光光度計(420nm，UV-2100可見分光光度計， 購自尤尼柯上海儀器有限公司）以空白值為參比測定樣品吸光度。
[0073] 空白值：將0 . lmL酶液、0.9mL磷酸鹽緩沖液（pH = 6.5)和2 . OmL Na2C03混合后加 5 · OmL底物溶液，于420nm處測定吸光度。
[0074]按以下公式計算酶活：
[0076]其中：
[0077] E420-420nm處的吸光度值;Ew-0. lmL所用酶液含酶的重量(g) ;8-反應(yīng)總體積； 10一反應(yīng)時間(min);4.45-在實驗條件下Ιμπιο? oNP/mL的吸光度值。
[0078]其中，采用BCA法測定野生型耐熱β-半乳糖苷酶、單突變體酶E303C和雙突變體酶 E303C/F341S的蛋白質(zhì)含量。BCA蛋白定量試劑盒購自北京莊盟生物基因科技有限公司。具 體測定步驟如下：
[0079] (1)試劑A:含1%BCA二鈉鹽、2%無水碳酸鈉、0.16%酒石酸鈉、0.4%氫氧化鈉、 0.95 %碳酸氫鈉，將上述液體混合后調(diào)pH至11.25。
[0080] (2)試劑B :4%硫酸銅。
[0081] (3)BCA工作液:試劑A 100mL+試劑B 2L，混合。
[0082] (4)蛋白質(zhì)標準液：準確稱取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為 1.5mg/mL的蛋白質(zhì)標準液。標準曲線及樣品反應(yīng)組成體系如表1所示 [0083]表1 BCA法測定蛋白質(zhì)含量
[0084] Table5 The Determination of protein content by BCA method
[0086] (5)樣品的濃度計算
[0087] 將上述各管混勻后于37°C保溫30分鐘，用562nm波長比色測定吸光度值。以蛋白質(zhì) 含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。用測定管光吸收值在標準曲線上查找相 應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，再計算出待測樣品中蛋白質(zhì)濃度(g/L)。
[0088] 野生型β-半乳糖苷酶、單突變體酶E303C和雙突變體酶E303C/F341S的比酶活測定 結(jié)果如表2所示。
[0089] 表2野生型及突變體酶的比酶活比較
[0090] Table6 The comparison of specific activity between Wild type and mutant enzyme
[0092] 結(jié)果表明，E303C突變體酶活相對野生型酶大幅度下降，僅為野生型酶活的0.6%， 而F341S該位點突變?yōu)榻z氨酸（Ser)雖也降低了水解催化活性，但比酶活仍保有野生型的 75%，表明F341位點參與了水解底物的調(diào)控。
[0093]通過兩個單點突變體的對比試驗結(jié)果進一步確認了 E303位點作為催化氨基酸對 維持酶的催化功能具有重要作用;而雙點突變體E303C/F341S幾乎失去水解活性，這一研究 發(fā)現(xiàn)表明F341位點和E303位點具有協(xié)同作用，結(jié)合針對F341位點底物抑制作用的研究結(jié)果 報道，雙點突變極可能對底物半乳糖基的識別和釋放起到調(diào)控的作用。
[0094] 6.突變體酶巰基側(cè)鏈的氧化
[0095]通過分子對接對參與底物結(jié)合的氨基酸位點進行預(yù)測分析(如圖1所示），結(jié)果表 明參與底物結(jié)合的氨基酸位點中不含半胱氨酸。因此，可以通過對E303C/F341S雙點突變體 進行氧化，并與野生型酶氧化體作進行對比分析，以研究底物結(jié)合氨基酸位點的巰基氧化 對酶催化活性的影響，
[0096] 為了獲得最佳氧化條件，選擇濃度范圍為0-0.3M KI溶液對E303C/F341S雙點突變 體及野生型酶進行氧化處理（反應(yīng)體系為l〇〇yL，含0.25M磷酸鹽緩沖溶液(ρΗ6.5)，10μΜ Br，ΚΙ濃度為0-0.3Μ，余量為水。分別向反應(yīng)體系中加入野生型和突變體酶3μΜ，反應(yīng)溫度為 25°C)，得到經(jīng)氧化的野生型和經(jīng)氧化的E303C/F341S雙點突變體0X-E303C/F341S。
[0097] KI濃度及處理時間對野生型及0X-E303C/F341S突變體酶活性影響如圖3所示。 [0098] 結(jié)果表明，實驗表明，0_0.3M KI的氧化處理，對于野生型酶活沒有顯著影響；而 0X-E303C/F341S突變體比酶活性隨KI濃度的增大而增加，當KI濃度達到0.2M時比酶活最 高，為3.78U/mg;對比野生型酶(WT)，活性沒有明顯變化。因此，選擇以0.2M KI作為最優(yōu)氧 化處理濃度。
[0099] 此外，由圖3B可知，0X-E303C/F341S的水解活性在氧化處理過程中，均低于野生型 酶。且在氧化處理第8天時，達到最大值3.98U/mg。而在相同處理條件下，野生型(WT)酶活隨 處理時間的延長酶活變化不顯著。以上試驗結(jié)果表明，KI對巰基的氧化作用可以提高突變 體酶的催化效率，但經(jīng)氧化處理的雙點突變體水解能力保持在低于野生型酶的水平，有利 于其催化轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的合成。
[0100] 7.突變體的轉(zhuǎn)糖苷催化活性比較
[0101] 通過與前述相同的方法測定野生型酶及0X-E303C/F341S以乳糖(500mM)為底物催 化反應(yīng)過程中（含92mU酶），底物與反應(yīng)產(chǎn)物的50h反應(yīng)時間內(nèi)的變化規(guī)律，結(jié)果如圖4所示。
[0102] 野生型酶的催化反應(yīng)過程中，在反應(yīng)前期（10h)出現(xiàn)了轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物峰（G0S)，為 0.75%。隨著時間的延長，乳糖的水解量增大，水解產(chǎn)物半乳糖(Gal)和葡萄糖(Glu)含量逐 漸增大，而轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的量有所減少。至20h后體系中G0S降低到0 %，產(chǎn)物水解率達到 100%。這可能是β-半乳糖苷酶對產(chǎn)物具有水解作用導(dǎo)致的。這一結(jié)果表明，在設(shè)定的反應(yīng) 條件下，野生型酶無法有效合成G0S。
[0103] 與野生型酶相比，0X-E303C/F341S突變體反應(yīng)過程中，轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物含量在反應(yīng)20h 后達到最大，為8.2%。且經(jīng)過50h的反應(yīng)時間后，產(chǎn)物仍保留達6.5%，突變體酶的產(chǎn)物水解 率僅為21 %。因此，在試驗條件下，0X-E303C/F341S將野生型酶在20h的G0S合成量由0%提 高到8.2%，顯著高于現(xiàn)有技術(shù)。且突變體酶不僅轉(zhuǎn)糖苷能力顯著高于野生型酶，同時其對 產(chǎn)物的水解能力也顯著低于野生型酶，而且適用于中性高溫反應(yīng)環(huán)境。
[0104] 8.突變體的轉(zhuǎn)糖苷催化產(chǎn)物分析
[0105] 通過液相色譜法分析轉(zhuǎn)糖苷催化產(chǎn)物組成，液相色譜分析體檢如下：
[0106] (1 )HPLC條件：色譜柱溫度維持在(45±0 · 5) °C/30°C ;;流動相流量1 ·OmL/min，進 樣體積20yL;
[0107] (2)蒸發(fā)光散射檢測器:溫度45°C，N2壓力3 ·0 X 105Pa;
[0108] (3)流動相乙腈 / 水= 77/23(V/V)
[0109] 相同反應(yīng)時間（50h)及加酶量(含92mU酶)條件下，野生型酶及0x-E303C/F341S以 乳糖(500mM)為底物，反應(yīng)產(chǎn)物的液相色譜分析結(jié)果如圖5所示。
[0110]結(jié)果顯示，野生型酶的反應(yīng)產(chǎn)物中，由于乳糖全部被水解為半乳糖和葡萄糖，二者 在液相中很難被完全分離，顯示為一個峰(如圖5A);雙點突變體酶0X-E303C/F341S在20h催 化反應(yīng)體系中，形成了新的產(chǎn)物峰，分子量大于單糖和雙糖，盡管其具體聚合度通過液相暫 不能確定(如圖5B)，但可以表明其應(yīng)為大于二糖的低聚糖，同時由于其水解能力顯著低于 野生型酶，反應(yīng)體系中殘留了一部分乳糖。
[0111] 以上結(jié)果表明，0X-E303C/F341S相對野生型酶其水解活性低，轉(zhuǎn)糖苷活性提高，且 降低了催化過程中對產(chǎn)物的降解能力。
[0112] 綜上所述，本發(fā)明的雙點突變體相對野生型酶降低了水解活性低，提高了轉(zhuǎn)糖基 活性，并同時降低了其對合成產(chǎn)物的降解能力。此外，本發(fā)明的酶適用于pH為中性、60_70°C 的高溫度條件下，能夠催化乳糖水解與低聚半乳糖合成，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)糖苷活性的高效改造。并 在提高轉(zhuǎn)糖苷活性的同時，抑制了水解催化活性的反向水解作用，有效提高了低聚半乳糖 的合成量。
[0113] 經(jīng)過以上的研究過程，本發(fā)明以耐熱β-半乳糖苷酶BgaB突變體酶F341S為基因改 造對象，通過其E303位點的定點突變，獲得了兼具高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷 酶BgaB雙點突變體。
[0114] 本發(fā)明的有益效果還體現(xiàn)于對研究方法的改進。正如對比現(xiàn)有技術(shù)的CN 201410148999所示，目前本研究領(lǐng)域以半理性分子設(shè)計的基因工程方法為主。這種方法的 主要缺陷為，突變體的成功獲得需要依靠生物信息學(xué)及預(yù)測算法的準確性，同時還需要配 合高靈敏度較高的高通量篩選方法，操作繁雜且成功率相對較低。這種方法應(yīng)用于轉(zhuǎn)糖苷 活性的改造時，由于篩選的單向性，不能有效的兼顧水解活性對轉(zhuǎn)糖催化效率的影響作用， 導(dǎo)致篩選所得轉(zhuǎn)糖苷活性提高突變體存在水解活性同時提高的現(xiàn)象。針對目前的研究現(xiàn) 況，本發(fā)明將定點突變與化學(xué)修飾相結(jié)合的基因改造方法，首次成功應(yīng)用于半乳糖苷酶 的雙向催化功能改造，開發(fā)了 一種不依賴高通量活性篩選的高效定向功能改造方法。
【主權(quán)項】
1. 一種兼具高轉(zhuǎn)糖苷活性、低水解活性的β-半乳糖苷酶雙點突變體，其特征在于該突 變體是對β-半乳糖苷酶BgaB的Ε303和F341兩個位點進行定點突變，其中，Ε303點位由原谷 氨酸Glu突變?yōu)榘腚装彼酑ys，F(xiàn)341點位由原苯丙氨酸Phe突變?yōu)榻z氨酸Ser，然后將雙點突 變體經(jīng)KI氧化處理所得。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的β_半乳糖苷酶雙點突變體，其特征在于所述β_半乳糖苷酶是 嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱半乳糖苷酶BgaB。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的β_半乳糖苷酶雙點突變體，其特征在于所述KI的濃度為0.2M 或以上。4. 一種兼具高轉(zhuǎn)糖苷活性、低水解活性的半乳糖苷酶雙點突變體的制備方法，其特 征在于該制備方法的步驟如下： Α、雙點突變體酶的構(gòu)建 以含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的突變體耐熱β-半乳糖苷酶基因 BgaB'質(zhì)粒ρΚΚ223-3-bgaB-F341S為模板，以快速全質(zhì)粒擴增突變法對位點E303構(gòu)建半胱氨酸Cys替換單點突變 體，得到相對于原始基因發(fā)生了雙點突變的酶基因 E303C/F341S; B、 雙點突變體酶的表達與純化 將全質(zhì)粒擴增得到的雙點突變PCR片段經(jīng)膠回收及雙酶切后，與PKK223-3載體的雙酶 切產(chǎn)物進行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞;挑取重組菌單克隆接種于5mL含有 l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB抗性培養(yǎng)基中，37 °C下?lián)u床振蕩培養(yǎng)過夜，按以體積比計1 %接種 量將種子液接種于含有l(wèi)OOyg/mL氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)；當OD6qo達 到0.6~1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為ImM，20 °C過夜誘導(dǎo)表達后，對發(fā)酵液進行離心， 去上清、收集菌體，再以5~10倍體積100mM磷酸緩沖液重懸，加入蛋白酶抑制劑后進行超聲 波破壁，得到破胞液;將破胞液進行熱處理去除不耐熱的雜蛋白后，離心收集上清液，得到 粗酶液;將上述粗酶液經(jīng)〇.22μπι濾膜過濾，再用鎳親和柱純化分離后收集洗脫液，然后用 50mM pH 7.0磷酸緩沖液透析去除咪唑，再用聚乙二醇包埋濃縮制得純化的突變體酶； C、 突變體酶的氧化 將步驟B得到的突變體酶進行氧化反應(yīng);氧化反應(yīng)體系如下：100yL 0.25M pH6.5磷酸 鹽緩沖溶液、〇. 2M或以上KI溶液、ΙΟμΜ Br、3μΜ突變體酶，在溫度25 °C條件下處理30h，得到 所述高轉(zhuǎn)糖苷活性、低水解活性的半乳糖苷酶雙點突變體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟Α中，引物如下： E303C/F341S上游引物： 5 ' -GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3 ' E303C/F341S下游引物： 5 '-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3， PCR 反應(yīng)條件為：94°C 預(yù)變性 2min; 95 °C 變性 30s; 58 °C ~64°C 30s; 68 °C 7min，16 個循環(huán) 后，最后68°C延伸15min; PCR反應(yīng)體系如下： dNTPs (2 rr.M) 5(iL lOxKOD plus Bui'. 5(xL KOD plus Ij^L MgS04 2tiL PrimcrU 1,5μ!_. PrimcrD 1 Template 1 μ,Ι., D.W. 33μΙ. 總體積 50μL 06. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟B中超聲波破壁的工作條件為：功 率400W循環(huán)工作，每個循環(huán)包括工作Is和停止9s，總破壁時間為30min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟B的熱處理條件為破胞液在55°C下 熱處理30min。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟B中，用鎳親和柱純化分離后收集 洗脫液的過程如下：向4mL鎳親和柱加入5倍柱體積去離子水至柱頂端自然洗脫后用2~3倍 體積的含20mM咪唑的Binding buff er自然洗脫;再將經(jīng)0.22μηι濾膜過濾的粗酶液上柱，慢 流使樣品與柱充分結(jié)合，待樣品流干后分別用6倍柱體積的Washing buffer連續(xù)梯度洗脫 洗脫雜蛋白質(zhì)，最后用4倍Elution buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫液； 所述Washing buffer分別含咪唑20mM、80mM、lOOmM;所述Elution buffer含250mM咪 唑。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟C中ΚΙ溶液濃度為0.2-0.3M。10. 權(quán)利要求1-3中任一項權(quán)利要求所述的高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半乳糖苷酶 雙點突變體或根據(jù)權(quán)利要求4-9中任一項制備方法得到的高轉(zhuǎn)糖苷活性低水解活性的β-半 乳糖苷酶雙點突變體在生產(chǎn)低聚半乳糖中的用途。
【文檔編號】C12N9/38GK105950588SQ201610579268
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】董藝凝, 陳衛(wèi), 陳海琴, 張灝
【申請人】滁州學(xué)院