一種低溫木糖苷酶hj14gh43及其耐鹽突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種低溫木糖苷酶HJ14GH43及其耐鹽突變體，木糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，編碼木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因hJ14GH43的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；耐鹽突變體氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明木糖苷酶HJ14GH43的最適pH為7.0，最適溫度為25℃；本發(fā)明在木糖苷酶HJ14GH43的基礎上進性定點突變，將其322位的纈氨酸突變?yōu)樘於彼幔@得突變體V322D，突變體V322D在NaCl中的活性和穩(wěn)定性都得到了提高。本發(fā)明的HJ14GH43及其耐鹽突變體V322D可應用于食品行業(yè)及水產(chǎn)飼料中。
【專利說明】
一種低溫木糖苷酶HJ14GH43及其耐鹽突變體
技術領域
[0001] 本發(fā)明公開一種低溫木糖苷酶及其耐鹽突變體，屬于基因工程及蛋白質改造技術 領域。
【背景技術】
[0002] 木聚糖是半纖維素中最豐富的一種多糖，完全水解木聚糖需要多種酶的協(xié)同作 用，包括內(nèi)切木聚糖酶（endo-1，4-0-D-xylanase，EC3.2. 1 .8)和木糖苷酶（β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37)等（Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3_23.)〇內(nèi) 切木聚糖酶可隨機地切割木聚糖的主鏈骨架，生成低聚木糖，而木糖苷酶可將低聚木糖水 解為木糖(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3-23·)。木聚糖酶在飼料、食品、 釀酒、紡織及造紙等領域都具有應用價值(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29: 3-23.)〇
[0003] 耐鹽酶在高濃度NaCl下仍然具有催化活性和穩(wěn)定性，可應用于高鹽食品和海產(chǎn)品 加工及其它高鹽環(huán)境生物技術領域，在高鹽環(huán)境下加工食品還可以防止微生物的污染、節(jié) 省滅菌等所消耗的能源(Margesin et al .Extremophiles,2001,5:73-83.);低溫酶在低溫 環(huán)境中具有較高的酶活，可用于低溫到中溫的生境或加工過程，如水產(chǎn)生境常常為10-25 °C，將中溫或者高溫加工的過程轉為低溫加工過程還可起到降低能耗的作用（Beg et al .Appl Microbiol Biotechnol，2001,56:326-338 ·)。近年來，低溫內(nèi)切木聚糖酶和耐鹽 內(nèi)切木聚糖酶已有報導，但低溫木糖苷酶和耐鹽木糖苷酶都無報導。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種低溫木糖苷酶HJ14GH43及其耐鹽突變體V322D。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種具有低溫活性的木糖苷酶 HJ14GH43，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發(fā)明低溫木糖苷酶HJ14GH43可得自芽孢桿 菌（Bacillus sp.)〇
[0006] 本發(fā)明還提供一種編碼木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因 hJ14GH43,其核苷酸序 列如SEQ ID No.2所示。
[0007] 本發(fā)明通過基因組測序的方法克隆了木糖苷酶基因 hJ14GH43。本發(fā)明還提供一種 包含有木糖苷酶基因 W14GH43的重組載體。優(yōu)選為pEasy-El-hJ14GH43。將本發(fā)明的木糖苷 酶基因插入到表達載體中，使其核苷酸序列與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最 優(yōu)選的實施方案，將本發(fā)明的木糖苷酶基因和表達載體pEasy-El通過T-A方式相連接，得到 重組大腸桿菌表達質粒pEasy-E 1 -h J14GH43。
[0008] 本發(fā)明還提供一種包含有木糖苷酶基因 hJ14GH43的重組菌，所述重組菌為大腸桿 菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌中的一種。重組菌株BL21 (DE3) /hjl 4GH43。
[0009] 本發(fā)明制備木糖苷酶HJ14GH43的方法按以下步驟進行：
[0010] 1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
[0011] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木糖苷酶表達；
[0012] 3)回收并純化所表達的木糖苷酶HJ14GH43。
[0013] 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) /hJ14GH43。
[0014] 本發(fā)明木糖苷酶HJ14GH43的最適pH為7.0;最適溫度為25 °C，在0 °C、10 °C和40 °C分 別具有14.5%、46.2%和12.8%的酶活;該酶在30% (w/v)的NaCl中仍具有62.0%的活性； 但是該酶在5.0-30.0%(?八）的似(：1中穩(wěn)定性很差，經(jīng)5.0-30.0%(￥八）的似(：1處理111后， 只有大約30 %的活性。
[0015]本發(fā)明還提供一種具有低溫活性的木糖苷酶HJ14GH43在水產(chǎn)飼料及其食品工業(yè) 中的應用。
[0016] 為了提高所述木糖苷酶HJ14GH43在NaCl中的穩(wěn)定性，本發(fā)明通過蛋白質改造技 術，將木糖苷酶HJ14GH43的第322位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)樘於彼?，獲得了該木糖苷酶的 突變體V322D。V322D的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，V322D的基因序列v322d如SEQID No. 4所示。
[0017] 本發(fā)明提供了包含上述木糖苷酶突變體基因 v322d的重組載體，優(yōu)選為pEasy-El-v322d。以表達質粒pEasy-El-hJ14GH43為模板，通過PCR技術，將hJ14GH43第965位核苷酸T 突變?yōu)锳，得到pEasy-El-hJ14GH43的突變重組質粒pEasy-El-v322d。
[0018] 本發(fā)明還提供了包含上述木糖苷酶突變體基因 v322d的重組菌株，優(yōu)選所述菌株 為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株BL21(DE3)/v322d。
[0019] 本發(fā)明制備木糖苷酶突變體V322D的方法按以下步驟進行：
[0020] 1)用上述的突變重組質粒轉化宿主細胞，得重組菌株；
[0021] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導突變重組木糖苷酶表達；
[0022] 3)回收并純化所表達的木糖苷酶突變體V322D。
[0023] 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3)/v322d。
[0024] 本發(fā)明木糖苷酶突變體V322D的最適pH為7.0;最適溫度為25°C，在0°C、10°C和40 °(：分別具有19.1 %、48.8%和43.1 %的酶活;與HJ14GH43相比，突變體V322D在NaCl中的活 性和穩(wěn)定性都得到了提高。在20.0-30.0% (w/v)的NaCl中，V322D比HJ14GH43的活性提高約 15% ;經(jīng)5.0-30.0% (w/v)的NaCl處理lh后，V322D比HJ14GH43的活性最小提高49%，最大提 尚 113 % 〇
[0025] 本發(fā)明還提供一種木糖苷酶突變體V322D在水產(chǎn)飼料及其食品工業(yè)中的應用。 [0026] 本發(fā)明的HJ14GH43及其耐鹽突變體V322D可應用于食品行業(yè)及水產(chǎn)飼料中。突變 體V322D比HJ14GH43更適合應用于高鹽食品和海產(chǎn)品加工及其它高鹽環(huán)境生物技術領域。
【附圖說明】
[0027]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0028]圖1:在大腸桿菌中表達的重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D的SDS-PAGE分 析，其中，Μ:蛋白質Marker; W:純化的重組HJ14GH43; V:純化的突變體V322D;
[0029]圖2:純化的重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D水解木二糖（X2)、木三糖 (X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)及木六糖(X6)的產(chǎn)物分析，其中，XI:木糖;CK:底物和失活的 酶(煮沸1 Omin); S:反應組；
[0030]圖3:重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D的pH活性；
[0031]圖4:重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D的pH穩(wěn)定性；
[0032]圖5:重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D的熱活性；
[0033]圖6:重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D的熱穩(wěn)定性；
[0034] 圖7:重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D在NaCl中的活性；
[0035] 圖8:重組木糖苷酶HJ14GH43及其突變體V322D在NaCl中穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0036]下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0037] 1、菌株及載體:芽孢桿菌(Bacillus sp.)分離于云南省楚雄彝族自治州黑井鎮(zhèn)鹽 礦土土樣，保藏于云南省微生物研究所菌種保藏中心，保藏號為YMF 3.00191;大腸桿菌 Escherichia coli BL21(DE3)和表達載體pEasy-El購自北京全式金生物技術有限公司。
[0038] 2、酶類及其它生化試劑:DNA聚合酶、dNTP及Fast Mutagenesis System購自北京 全式金生物技術有限 & 3，pNP(p-nitrophenol)、pNPX(p-nitrophenyl-0_d-xylopyranoside) 4-]1；[1：1'(^1161171-€[-1^-&抑13；[110;1^11抑1108丨(16、樺木木聚糖、山毛棒木聚糖、 羧甲基纖維素納和葡聚糖購自Sigma公司，阿拉伯木聚糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五 糖及木六糖購自Megazyme公司，Genomic DNA Clean&Concentration試劑盒購自Zymo Research公司，Tureseq DNA Sample Preparation Kit購自 Illumima公司，其它都為國產(chǎn) 試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0039] 3、培養(yǎng)基：
[0040] LB培養(yǎng)基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸饋水至 1000ml，pH自 然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0041] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。
[0042] 實施例1:木糖苷酶基因 hJ14GH43的克隆
[0043] 提取芽孢桿菌基因組DNA:將液體培養(yǎng)2d的菌液離心取菌體，加入lmL溶菌酶，37°C 處理60min，再加入裂解液，裂解液組成為：50mM Tris，20mM EDTA，500mM NaCl，2%(w/v) SDS，pH8.0，70°C水浴裂解60min，每隔lOmin混勾一次，在4°C下lOOOOrpm離心5min。取上清 于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下 lOOOOrpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置 于-20°C備用。
[0044] 用超聲打斷儀Biorupter將5yg的芽孢桿菌基因組打斷為400-600bp的片段，用 Genomic DNA Clean&Concentration試劑盒對打斷的DNA片段進行純化，純化后用Tureseq DNA Sample Preparation Kit進行DNA片段的末端補平、3'端加 A堿基和加接頭、及DNA片段 的PCR擴增(操作按試劑盒說明書進行）。用MiSeq基因組測序儀(Illumima公司）對上述制備 好的文庫進行基因組測序。
[0045] 基因組測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)讀碼框預測和本地BLAST比對，得到木糖苷酶基因 hJ14GH43，該基因序列如SEQIDN0.2所示。
[0046] 實施例2:重組木糖苷酶HJ14GH43的制備
[0047] 以5'ATGAAGATTACCAATCCAGTGCT 3'和5'TTATTCGTCTGTTTCCTCATAGC 3'為引物對， 芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應參數(shù)為：94°C變性5min;然后94°C變性 30sec，52°C退火30sec，72°C延伸lmin 30sec，30個循環(huán)后72°C保溫lOmiruPCR結果得到木 糖苷酶基因 hJ14GH43，并在該基因3 '端引入突出的A堿基。將木糖苷酶基因 hJ14GH43和表達 載體pEasy-El通過T-A方式相連接，獲得含有hJ14GH43重組表達質粒pEasy-El-hJ14GH43。 將pEasy-El-hJ14GH43轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)/ hJ14GH43〇
[0048] 取含有重組質粒pEasy-El-hJ14GH43的重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)/hJ14GH43， 以〇. 1%的接種量接種于LB(含100yg ml^Amp)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩16h。然后將此活化 的菌液以1 %接種量接種到新鮮的LB(含100yg mdmp)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3h (0D6QQ達到0.6-1.0)后，加入終濃度0.111^的1?16進行誘導，于20°(：繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約2011。 12000rpm離心5min，收集菌體。用適量的pH7 . OTris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下 超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液經(jīng)13,000rpm離心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0-500mM的咪唑分別親和和純化目的蛋白。SDS-PAGE結果（圖1)表明，重組木 糖苷酶HJ14GH43在大腸桿菌中得到了表達，經(jīng)純化后，產(chǎn)物為單一條帶。
[0049] 實施例3:木糖苷酶HJ14GH43定點突變以及突變體V322D的制備方法
[0050] 通過對木糖苷酶HJ14GH43的高級結構進行分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸V322位于一段無規(guī)則 卷曲中，將322位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)樘於彼?，有可能增加酶的親水能力，從而使酶的 耐鹽性增強。
[0051 ]以表達質粒pEasy-El-hJ14GH43為模板，利用北京全式金生物技術有限公司的 Fast Mutagenesis System進行點突變，將hJ14GH43第965位核苷酸T突變?yōu)锳，得到了 pEasy-El-hJ14GH43的突變重組質粒pEasy-El-v322d。突變引物為5' AGATCGAAGAAAAGG^ITTTGCACCAAC 3 ' 和5'ICCTTTTCTTCGATCTTTGGCGCTTC 3 '（下劃線為突變 點hPCR反應參數(shù)為：94°C變性5min;然后94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸3min 30sec，30個循環(huán)后72°C保溫10min 1CR產(chǎn)物經(jīng)DMT酶消化后轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得 重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/v322d。
[0052] 取重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)/v322d，以0.1%的接種量接種于LB(含100yg mL一 Imp)培養(yǎng)液中，37 °C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以1 %接種量接種到新鮮的LB (含 100yg ml^Amp)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3h(0D6Q()達到0.6-1.0)后，加入終濃度0.111^的 IPTG進行誘導，于20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h<a2000rpm離心5min，收集菌體。用適量的 pH7. OTris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮的粗酶液 經(jīng)13，000rpm離心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0-500mM的咪唑分別親和 和純化目的蛋白。SDS-PAGE結果（圖1)表明，突變體V322D在大腸桿菌中得到了表達，經(jīng)純化 后，產(chǎn)物為單一條帶。
[0053]實施例4:純化的木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D的性質測定 [0054] 1、純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D的活性分析
[0055] 純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D的活性測定方法采用pNP法：將 pNPX溶于緩沖液中，使其終濃度為2mM;反應體系含50yL適量酶液，450yL的2mM底物;底物在 反應溫度下預熱5min后，加入酶液再反應適當時間，然后加2mL 1M Na2C03終止反應，冷卻至 室溫后在405nm波長下測定釋放出的pNP;l個酶活單位(U)定義為每分鐘分解底物產(chǎn)生1μ mol pNP所需的酶量。對底物p-nitrophenyl-a-L-arabinofuranoside的測定也采用pNP法。 結果表明：在ΡΗ7.0及25°C下，HJ14GH43以及突變體V322D對ρΝΡΧ的比活分別為2.37 ±0.08U mg-1和2 · 66±0 ·08U mg-1，對底物。-]1；[1：1'(^1161171-€[-1^-&抑13；[110;1^11抑1108丨(16的比活分別為 0.030±0.001U mg-1 和0.012±0.001U mg-、
[0056] 對底物樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖、阿拉伯木聚糖、羧甲基纖維素納、普魯蘭多糖 和葡聚糖的活性測定方法采用3,5 -二硝基水楊酸(DNS)法:將底物溶于緩沖液中，使其 終濃度為〇. 5 % (w/v);反應體系含100yL適量酶液，900yL底物;底物在反應溫度下預熱5min 后，加入酶液后再反應適當時間，然后加1.5mL DNS終止反應，沸水煮5min，冷卻至室溫后在 540nm波長下測定0D值;1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生Ιμπιο? 還原糖（以木糖計)所需的酶量。結果表明：在ΡΗ7.0及25 °C下，HJ14GH43以及突變體V322D對 底物樺木木聚糖、山毛櫸木聚糖、阿拉伯木聚糖、羧甲基纖維素納、普魯蘭多糖和葡聚糖 皆無活性。
[0057]對底物木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖的活性測定方法采用薄層層析法 (TLC)，反應體系含45yL 0.5% (w/v)的底物，5yL適當稀釋酶液（約0.06U酶液），在ρΗ7.0及 20°C下，反應150min后終止反應并分析水解產(chǎn)物(使用青島海洋化工有限公司的高效薄層 層析硅膠板G型）。
[0058]薄層層析步驟如下所示：
[0059] (1)配制展開劑（冰醋酸20mL，雙蒸水20mL，正丁醇40mL，混勻），取適量倒入展開 槽，靜置30min左右；
[0060] (2)將硅膠板放在110 °C烘箱中活化30min，冷卻后劃線，點樣(每次0.5yL，吹干，共 點3次）；
[0061] (3)將點樣的一端硅膠板朝下放入展開槽中，點樣點不要沒入展開劑；
[0062] (4)待展開劑到距硅膠板上沿1.5cm時，取出硅膠板，吹干，再展開一次；
[0063] (5)第二次展開結束后，硅膠板直接浸入適量顯色劑（lg二苯胺溶于50mL丙酮中， 溶解后加入lmL苯胺及5mL 85%的磷酸，混勾，現(xiàn)用現(xiàn)配）；
[0064] (6)幾秒鐘后，立即取出硅膠板并放置于90°C烘箱中10_15min，使斑點顯色。
[0065]結果表明：HJ14GH43以及突變體V322D能水解木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木 六糖，水解產(chǎn)物幾乎都為木糖(圖2)。
[0066] 2、純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D的pH活性和pH穩(wěn)定性測定：
[0067] pH活性和pH穩(wěn)定性測定采用pNP法。酶的最適pH測定:將木糖苷酶HJ14GH43以及突 變體V322D在20°C下和pH5.0 -10.0的緩沖液中進行酶促反應。酶的pH穩(wěn)定性測定:將酶液置 于PH5.0-10.0的緩沖液中，在20°C下處理lh，然后在pH7.0及20°C下進行酶促反應，以未處 理的酶液作為對照。緩沖液為：Me I lvaine buff er(pH5.0-8.0)和0.1M glycine-NaOH (pH9.0-10.0)。以pNPX為底物，反應lOmin，測定純化的HJ14GH43以及突變體V322D的酶學性 質。結果表明：HJ14GH43以及突變體V322D的最適都為7.0，但在pH6.5時，V322D的酶活比 HJ14GH43高約20%，在pH7.5時，HJ14GH43的酶活比V322D高約 12% (圖3);HJ14GH43以及突 變體V322D在pH7.0-8.0的緩沖液較穩(wěn)定，經(jīng)pH7.0-8.0緩沖液在20 °C下處理lh，兩個酶的酶 活剩余達70%以上，但在？!16.0和？!18.0條件下，￥3220比耵146!143更穩(wěn)定，其酶活比 HJ14GH43分別提高25%和18%(圖4)。
[0068] 3、純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D的熱活性及熱穩(wěn)定性測定：
[0069]熱活性及熱穩(wěn)定性測定采用pNP法。酶的熱活性測定:在pH7.0的緩沖液中，于0-40 °C下進行酶促反應。酶的熱穩(wěn)定性測定:將同樣酶量的酶液分別置于20°C、25°C和30°C，處 理0-60min后，在pH7.0及20°C下進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以pNPX為底物， 反應lOmin，測定純化的HJ14GH43以及突變體V322D的酶學性質。結果表明：HJ14GH43的最適 溫度為25°(：，在0°(：、10°(：和40°(：分別具有14.5%、46.2%和12.8%的酶活（圖5) ;突變體 V322D的最適溫度也為25 °C，在0 °C、10 °C和40 °C分別具有19.1 %、48.8 %和43.1 %的酶活 (圖5);HJ14GH43以及突變體V322D在20°C下穩(wěn)定，在30°C時半衰期小于lOmin(圖6)。
[0070] 4、純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D的動力學參數(shù)測定：
[007? ] 動力學參數(shù)測定采用pNP法。酶的動力學參數(shù)一級反應時間測定：在pH7 · 0及20°C 下，以ImM pNPX為底物，依次在酶促反應的1 -30min內(nèi)終止反應并測定酶活性，計算出酶活 性與反應時間的比值，若在一定時間內(nèi)該比值保持穩(wěn)定，則此時間為一級反應時間。用 0.05-2 · 5mM pNPX為底物，在pH7.0、20°C和一級反應時間下，根據(jù)Lineweaver-Burk方法測 定Km、V max和kcat。經(jīng)測定，在20°C及ρΗ7·0條件下，HJ14GH43對pNPX的Km、V max和kcat分別為 1 · 43mM、3 · 30ymol min-Vg-1和3 · 50s-1，V322D 對 pNPX的Km、VmajPkcat分別為 1 · 99mM、4 · 30μ mol min-Vg-1和4.55s-1。
[0072] 5、不同金屬離子及化學試劑對純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D活 力的影響：
[0073 ]在酶促反應體系中加入1. OmM的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。在 20°C及pH7.0條件下，以pNPX為底物，通過pNP法測定酶活性。結果(表1)表明，1. OmM的SDS、 HgCl2及AgN03可完全抑制HJ14GH43以及突變體V322D;ZnS〇4對HJ14GH43以及V322D的抑制較 強；CuS〇4對V322D的抑制較強，但是對HJ14GH43的抑制很弱；其余金屬離子和化學試劑對 HJ14GH43以及V322D的影響很小或幾乎無影響。
[0074] 表1.金屬離子及化學試劑對純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D活力 的影響

[0077] 6、純化的重組木糖苷酶HJ14GH43以及突變體V322D在NaCl中的活性及穩(wěn)定性：
[0078]酶在NaCl中的活性及穩(wěn)定性測定采用pNP法。酶在NaCl中的活性測定:在酶促反應 體系中加入5.0-30.0 % (w/v)NaCl，于pH7.0及20°C下進行酶促反應。以pNPX為底物，反應 lOmin，測定純化的HJ14GH43以及突變體V322D的酶學性質。結果表明：在反應體系中加入 5.0- 30.0% (w/v)的NaCl，HJ14GH43以及V322D都仍然具有60 %以上的酶活；但在20.0-30.0%(w/v)的NaCl中，V322D比HJ14GH43的活性提高約 15% (圖7)。
[0079] 酶在NaCl中的穩(wěn)定性測定:將純化的酶液置于5.0-30.0% (w/v)NaCl水溶液中，在 20°C下處理60min，然后在pH7.0及20°C下進行酶促反應，以未加 NaCl但在20°C下保溫60min 的酶液作為對照。以pNPX為底物，反應lOmin，測定純化的HJ14GH43以及突變體V322D的酶學 性質。結果（圖8)表明：HJ14GH43在5.0-30.0% (w/v)的NaCl中穩(wěn)定性很差，該酶經(jīng)5.0-30% (w/v)的NaCl處理60min后，只有大約30%的活性;而V322D在NaCl中穩(wěn)定，甚至其酶活有所 提高，該突變體經(jīng)5.0-30.0% (w/v)的NaCl處理lh后，酶活最低為77.0%，最高為146.9%。 與HJ14GH43相比，V322D在5.0-30%(￥八）的恥(：1中的穩(wěn)定性大幅提高，耵146!143和￥3220經(jīng) 5.0- 30%(?八）的恥(：1處理111后，￥3220比耵146!143的活性最小提高49%，最大提高113%。 [0080]本技術領域技術人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術語(包括技術術 語和科學術語)具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員的一般理解相同的意義。還應該 理解的是，諸如通用字典中定義的那些術語應該被理解為具有與現(xiàn)有技術的上下文中的意 義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。
[0081]最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參 照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解:依然可以對本 發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均 應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。
【主權項】
1. 一種具有低溫活性的木糖苷酶HJ14GH43,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. I 所示。2. -種編碼權利要求1所述的木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因 hJ14GH43,其特征在 于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3. 根據(jù)權利要求2所述的包含有木糖苷酶基因 hJ14GH43的重組載體。4. 根據(jù)權利要求2所述的包含有木糖苷酶基因 hJ14GH43的重組菌，其特征在于，所述重 組菌為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌中的一種。5. 根據(jù)權利要求1所述具有低溫活性的木糖苷酶HJ14GH43在水產(chǎn)飼料及其食品工業(yè)中 的應用。6. -種耐鹽的木糖苷酶突變體V322D，其特征在于，所述的木糖苷酶突變體V322D的氨 基酸序列為SEQ ID No.1的木糖苷酶的第322位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)樘於彼幔浒被?序列如SEQ ID No.3所示。7. -種編碼權利要求6所述的木糖苷酶突變體V322D的基因 v322d，其特征在于，其核苷 酸序列如SEQ ID No.4所示。8. 根據(jù)權利要求7所述的包含有木糖苷酶突變體基因 v322d的重組載體。9. 根據(jù)權利要求7所述的包含有木糖苷酶突變體基因 v322d的重組菌，其特征在于，所 述重組菌為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌中的一種。10. 根據(jù)權利要求6所述木糖苷酶突變體V322D在水產(chǎn)飼料及其食品工業(yè)中的應用。
【文檔編號】C12N9/24GK105950586SQ201610557658
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月15日
【發(fā)明人】周峻沛, 黃遵錫, 張蕊, 劉鈺, 唐湘華, 李俊俊, 吳倩, 慕躍林
【申請人】云南師范大學