一種豬溶菌酶來源的飼用抗菌十二肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬溶菌酶來源的飼用抗菌十二肽及其制備方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明的制備方法包括了粗提液的制備，凝膠過濾色譜柱Superdux Peptide 10/300GL的分離，和反相柱Phenomenex luna C18分離純化。經(jīng)LC?MS鑒定，該抗菌十二肽的氨基酸序列為：G?V?S?L?A?N?W?V?C?L?A?K，此抗菌肽屬于堿性肽，對革蘭氏陰性菌具有明顯抗性，是對豬溶菌酶的抗菌譜的良好補充和拓展。經(jīng)與抗菌肽數(shù)據(jù)庫(The Antimicrobial Peptide Database)等數(shù)據(jù)庫比對，此種抗菌肽并未見報道。本發(fā)明制備工藝具有簡單、高效的特點，產(chǎn)物純度經(jīng)質(zhì)譜鑒定可達95％以上。
【專利說明】
一種豬溶菌酶來源的飼用抗菌十二肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種豬溶菌酶來源的飼用抗菌十二肽及其制備方法，屬于生物工程領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾十年來，抗生素通過抑制病原微生物增殖，減少其代謝毒素對動物的毒害作用 而在防治動物的疾病、促進動物的生長、提高畜禽產(chǎn)品的產(chǎn)量等方面起到了積極的作用。但 是長期的使用抗生素，尤其是飼養(yǎng)過程中使用抗病藥物、促生長添加劑等，會造成藥物的殘 留超標，產(chǎn)地的環(huán)境污染，導(dǎo)致肌肉的品質(zhì)和加工產(chǎn)品的質(zhì)量下降。除此之外，禽畜長期使 用抗生素作飼料添加劑，可使某些菌群變?yōu)槟退幘?，從而帶來預(yù)防與治療人畜某些疾病 的困難。
[0003] 歐盟監(jiān)管委員會決定，自2006年1月起在動物養(yǎng)殖業(yè)中禁用抗生素生長促進劑。從 2013年12月開始，美國FDA發(fā)布了《獸醫(yī)飼料指令》，要求有執(zhí)照的獸醫(yī)監(jiān)督抗生素的使用， 計劃從2014年起，用3年時間禁止在牲畜飼料中使用預(yù)防性抗生素，最大限度地減少食用牲 畜帶給消費者抗生素耐藥性問題。韓國也計劃在2018年7月全面禁止飼用抗生素的使用。
[0004] 隨著細菌對抗生素耐藥性和抗生素的殘留問題日益嚴重，研究和開發(fā)綠色飼料添 加劑產(chǎn)品已經(jīng)成為世界性的研究課題，大量研究表明，中草藥提取物、微生物制劑、酶制劑、 益生元、抗菌肽、酸化劑等新型飼料添加劑能有效減少或者替代飼用抗生素的使用。其中， 溶菌酶來自動物體內(nèi)，因為其同源性和高效性而備受人們親睞。
[0005] 豬溶菌酶是豬體內(nèi)抵抗外源微生物侵染的一道重要屏障，是其非特異性免疫的重 要組成部分。鑒于豬在畜牧業(yè)中的重要地位，豬溶菌酶的規(guī)?；a(chǎn)問題已經(jīng)提上日程。然 而，與其他C-型溶菌酶的作用類似，豬溶菌酶的抗菌譜主要集中在革蘭氏陽性菌，對革蘭氏 陰性菌基本沒有抑菌作用，這也限制了它的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明利用蛋白酶將豬溶菌酶水解成不同的片段，利用超濾 和色譜等技術(shù)，制備得到了對革蘭氏陰性菌具有明顯抗性的活性肽并得到了抗菌肽的氨基 酸序列。本發(fā)明的制備工藝簡單、分離效果好、操作條件溫和，獲得的抗菌肽純度高、具有較 高的抗菌活性，可作為生物防治使用，是對豬溶菌酶抗菌譜的有效補充和完善。
[0007] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列為:G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K(如SEQ ID N0.1 所示），命名為SSL-LP。
[0008] 所述抗菌肽是利用蛋白酶將豬溶菌酶水解，然后經(jīng)分離純化得到的。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種所述抗菌肽的制備方法，是將豬溶菌酶進行胰蛋 白酶水解得到粗提液，然后經(jīng)凝膠過濾色譜Superdux Peptide 10/300GL和反相柱 CisPhenomenex luna分離純化得到抗菌十二肽SSL-LP。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述豬溶菌酶由重組大腸桿菌發(fā)酵而來，發(fā)酵產(chǎn)品 經(jīng)胰蛋白酶，于35~38°C水解12~16h，酶解結(jié)束后煮沸滅酶，酶解液超濾濃縮，得到粗提 液。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌，是以大腸桿菌BL21(DE3)為宿 主，表達編碼基因（NCBI-ID:1174173)，以pET-28a( + )為表達載體，在25°C、200r/min條件 下，利用O.lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)8h，離心發(fā)酵液獲得菌體。對其進行超聲破碎獲得重組蛋白 包涵體，然后對包涵體進行復(fù)性，冷凍干燥后最終獲得了具有生物活性的豬溶菌酶。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，胰蛋白酶相對發(fā)酵產(chǎn)物的添加量為15-30mg/g。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述超濾濃縮是采用截留分子量3000Da的超濾裝置 濃縮8~10倍。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述分離純化是：（1)將粗提液用磷酸鹽緩沖液透析 后，用Superdux Peptide 10/300GL凝膠色譜分離，收集對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎 克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性峰V(指色譜圖上出現(xiàn)的第5個峰，下同），用截留分子量 為3000Da的超濾膜超濾濃縮，取分子量較小的部分透析后冷凍干燥；（2)將上一步得到的冷 凍干燥的樣品用5 %的乙腈(含0.1 % TFA，下同）溶解，并經(jīng)5 %的乙腈(含0.1 % TFA)平衡的 CisPhenomenex luna柱，用濃度為5-50 %的線性梯度遞增的乙腈洗脫，收集對大腸桿菌、銅 綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性洗脫峰Π (指色譜圖上出現(xiàn)的第3個 峰），并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后，得到產(chǎn)品抗菌十二肽。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述磷酸鹽緩沖液為20mmol/L ΡΗ7.0。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述Superdux Peptide 10/300GL凝膠色譜分離得 到6個洗脫峰。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，產(chǎn)品使用LC-MS進行鑒定；用Mill-Q水溶解后經(jīng)LC-MS分離與鑒定；其中流動相為A(乙腈:水：甲酸= 30:970:1(V:V:V))和B(乙腈：水：甲酸= 700:300:1 (V:V:V));洗脫程序如下：0-10min，100%A，0%B;20min，70%A，30%B;30min， 0%A，100%B ;35min，100%A，0%B;flow rate，lmL/min;柱溫30°C。質(zhì)譜條件：毛細管電壓 3.88kV。圓錐體電壓20V，離子源溫度120°C，去溶溫度300°C，流速lmL/min，分流比50:1。結(jié) 果用軟件MassLynx 4.1分析。
[0018] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述抗菌肽的應(yīng)用，是作為飼料添加劑。
[0019] 所述應(yīng)用，是將抗菌肽與豬溶菌酶或其他溶菌酶聯(lián)合使用。
[0020] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種抑制革蘭氏陰性菌的方法，是使用所述的抗菌 肽。
[0021] 所述革蘭氏陰性菌，為大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等。
[0022]本發(fā)明的有益效果：
[0023] (1)本發(fā)明的抗菌肽SSL-LP屬于堿性肽，與抗菌肽數(shù)據(jù)庫（The Antimicrobial Peptide Database)等數(shù)據(jù)庫比對，此種抗菌肽是首次被報道。
[0024] (2)本發(fā)明的抗菌肽SSL-LP，對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革 蘭氏陰性菌均有明顯抑制作用，是對豬溶菌酶抗菌譜的良好補充和拓展。
[0025] (3)本發(fā)明獲得的抗菌肽可作為飼料添加劑與豬溶菌酶或其他溶菌酶聯(lián)合使用， 有望在將來替代抗生素和解決食品安全問題中發(fā)揮重要作用。
[0026] (4)本發(fā)明制備工藝具有簡單、快速、高效的特點，所涉及的各種緩沖液配方均可 以在實驗手冊中查到，制備得到的產(chǎn)品純度高，經(jīng)質(zhì)譜鑒定其純度可達95%以上。
【附圖說明】
[0027]圖1:十二肽的質(zhì)譜鑒定圖。
【具體實施方式】
[0028]實施例1:抗菌十二肽的制備
[0029] 1 .溶菌酶產(chǎn)品經(jīng)重組大腸桿菌BL21(DE3)發(fā)酵而來，編碼基因（NCBI-ID: 1174173)，通過BamHI和HindIΠ 雙酶切之后與載體pET-28a( + )連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達。在25°C、200r/min條件下，利用0.1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8h，離心發(fā)酵液獲 得菌體。對其進行超聲破碎獲得重組蛋白包涵體，然后對包涵體進行復(fù)性，冷凍干燥后最終 獲得具有生物活性的豬溶菌酶。發(fā)酵產(chǎn)品經(jīng)胰蛋白酶（15-30mg/g，胰蛋白酶/發(fā)酵產(chǎn)品））， 于35~38 °C水解12~16h，酶解結(jié)束后煮沸10分鐘滅酶，酶解液超濾(截留分子量3000Da)濃 縮8~10倍，得到粗提液。
[0030] 2.經(jīng)凝膠過濾色譜Superdux Peptide 10/300GL的分離:將粗提液用緩沖液Π (磷 酸鹽緩沖液，20mmol/L ρΗ7·0)進行透析，經(jīng)Superdux Peptide 10/300GL凝膠色譜分離得 到6個洗脫峰，收集對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性 峰，并將收集的活性峰V，經(jīng)截留分子量為3000Da的超濾杯濃縮，并經(jīng)Mi 11-Q水充分透析后 冷凍干燥。
[0031] 3.反相C18柱的分離:將上一步冷凍干燥的樣品用5 %的乙腈(含0.1 % TFA，下同）溶 解，并經(jīng)5%的乙腈平衡的C18柱，用濃度為5-50%的線性梯度遞增的乙腈洗脫，收集活性洗 脫峰II，并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后，最終得到產(chǎn)品。純度達95%以上。
[0032] 采用LC-MS對上述最終得到的產(chǎn)品進行鑒定。LC-MS的鑒定方法如下：
[0033]將上述步驟得到的具有抑菌活性的冷凍干燥樣品，用Mill-Q水溶解后經(jīng)LC-MS鑒 定，流動相為A(乙腈:水：甲酸=30:970:1 (V:V:V))和B(乙腈:水：甲酸= 700:300:1 (V:V: V));
[0034] 洗脫程序為 0-10min，100%A，0%B;20min，70%A，30%B;30min，0%A，100%B; 35min，100%A，0%B;flow rate，lmL/min;柱溫3CTC。
[0035] 質(zhì)譜條件:毛細管電壓，3.88kV;圓錐體電壓，20V;離子源溫度，120°C ;去溶溫度， 300°C ;流速，lmL/min;分流比，50:1。結(jié)果用軟件MassLynx 4.1分析。
[0036] LC-MS鑒定結(jié)果顯示，此抗菌肽的抗菌肽的分子量為1260.51Da，其氨基酸序列為 G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K。經(jīng)與抗菌肽數(shù)據(jù)庫（TheAntimicrobial Peptide Database)等 數(shù)據(jù)庫比對，此種抗菌肽并未見報道。
[0037] 實施例2:抗菌十二肽的抗菌性能檢測
[0038] 抗菌十二肽的抑菌活性測定參照文獻的方法進行。測試菌經(jīng)過二級活化之后，以 1 %的接種量接種至含30mL TSB培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)至OD600為0.6，取0.2mL菌液與0.4mL TSB培養(yǎng)基混合后加入0.2mL含有抗菌十二肽(豬溶菌酶作對照）的PBS(0.05mol/L，pH 7.0) 緩沖液混勻，使抗菌肽(或?qū)φ眨┑慕K濃度為2.5 X 10-7mol/L?；旌象w系于37°C、200r/min條 件下培養(yǎng)2h后，稀釋涂布至TSB平板上，待長出菌落后進行計數(shù)。計算抑菌系數(shù)log Νο/Λ，其 中No是指空白組的菌落數(shù)，即只加 PBS溶液;見是實驗組(或?qū)φ战M)的菌落數(shù)。
[0039]表1本發(fā)明的十二肽的抑菌效果
[0041] 此抗菌肽對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌和肺炎克雷伯氏菌等革蘭氏陰性菌具有明 顯的抗菌活性。
[0042] 實施例3:抗菌十二肽的應(yīng)用
[0043 ]將此抗菌肽與豬溶菌酶編碼基因進行融合表達，獲得了對革蘭氏陰性菌和陽性菌 均有明顯殺菌作用的產(chǎn)品，較好的彌補了豬溶菌酶抗菌譜較窄的缺陷，為其進一步應(yīng)用奠 定了基礎(chǔ)。
[0044]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是利用蛋白酶將豬溶菌酶水 解，然后經(jīng)分離純化得到的。3. -種權(quán)利要求1所述的抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述方法是將豬溶菌酶進行 胰蛋白酶水解得到粗提液，然后經(jīng)凝膠過濾色譜Superdux Peptide 10/300GL和反相柱 CisPhenomenex Iuna分離純化得到抗菌十二肽。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述豬溶菌酶由重組大腸桿菌發(fā)酵而來， 發(fā)酵上清液經(jīng)胰蛋白酶，于35~38 °C水解12~16h，酶解結(jié)束后煮沸滅酶，酶解液超濾濃縮， 得到粗提液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離純化是：（1)將粗提液用磷酸鹽緩 沖液透析后，用Superdux Peptide 10/300GL凝膠色譜分離，收集對大腸桿菌、銅綠假單細 胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性峰V，用截留分子量為3000Da的超濾膜超濾濃 縮，取分子量較小的部分透析后冷凍干燥；（2)將上一步得到的冷凍干燥的樣品用含0.1% TFA的5%乙腈溶解，并經(jīng)5%的乙腈平衡的C18Phenomenex Iuna柱，用濃度為5-50%的線性 梯度遞增的乙腈洗脫，收集對大腸桿菌、銅綠假單細胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用 的活性洗脫峰Π ，并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后，得到產(chǎn)品抗菌十二肽。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，胰蛋白酶相對發(fā)酵產(chǎn)物的添加量為15-30mg/g〇7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述超濾濃縮是采用截留分子量3000Da的 超濾裝置濃縮8~10倍。8. -種權(quán)利要求1所述的抗菌肽的應(yīng)用，是作為飼料添加劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，是將抗菌肽與豬溶菌酶或其他溶菌酶聯(lián)合使用。10. -種抑制革蘭氏陰性菌的方法，其特征在于，所述方法是使用權(quán)利要求1的抗菌肽。
【文檔編號】A23K20/195GK105950587SQ201610369095
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】陸健, 蔡國林, 朱德偉
【申請人】江南大學(xué)