Ell(c595a)突變體在促進腫瘤轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ELL(C595A)在促進腫瘤細胞迀移中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] ELL的基因產(chǎn)物首先被定義為MLL基因在急性髓性白血病（AML)(Thirman等人 1994)的易位部分。進一步的生化研究鑒定出ELL作為轉(zhuǎn)錄延伸因子，可以在體外實驗中增 加 RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄延伸活性，后來的體內(nèi)研究揭示出其相關(guān)聯(lián)地轉(zhuǎn)錄活性基因座 化1886油6坪等人2002,511；[131:丨€31(1等人1996)<^1^是兩個不同的延伸復(fù)合體的一部分，即 超級延伸復(fù)合體（SEC)和小延伸復(fù)合體（LEC) (Hu等人2013, Luo等人2012, Smith和 Shilatifard 2013)。作為正轉(zhuǎn)錄延伸因子(P-TEFb)中最活躍的形式之一，超級延伸復(fù)合體 (SEC)執(zhí)行幾項重要功能，例如HSP70誘導(dǎo)熱休克，發(fā)育基因響應(yīng)環(huán)境脅迫(Lin等人2010， Lin等人2011)，MLL-AFFl-transformed細胞中的Η0Χ基因失調(diào)(Lin等人2010)，以及HIV的轉(zhuǎn) 錄激活(He等人2010，Sobhian等人2010)。小延伸復(fù)合體(LEC)在snRNA基因轉(zhuǎn)錄的啟始和延 伸階段調(diào)節(jié)小核RNA(small nuclear RNA)的轉(zhuǎn)錄及功能(Hu等人2013，Smith等人2011) 0
[0003] ELL在哺乳動物的胚胎發(fā)育中是必需的，因為ELL靶向敲除的小鼠出現(xiàn)胚胎致死 (Mitani等人2000)。此外，ELL作為類固醇受體，低氧誘導(dǎo)因子l-a(HIF-la)，E2Fl和TFIIH復(fù) 合體的伴侶，以一種或正或負的方式來調(diào)節(jié)它們結(jié)合伴侶的活性(Pascual-Le Tallec等人 2005) (Liu等人2010a) (Mourgues等人2013，Zhang等人2014)。綜上，ELL有著非常多樣化的 功能;然而，其在生理條件下確切的作用機制仍然未知。
[0004] 原癌基因 c-Myc，最初通過在宿主細胞基因組中識別可比v_Myc(comparable V-Myc oncogene)被首次確認(Vennstrom等人1982)。隨后的研究表明，人類c-Myc在多發(fā)性骨 髓瘤中頻繁易位(Shou等人2000)，并在許多不同的人類癌癥中高表達或突變(Beroukhim等 人2010)，從而證實它是一個人類癌基因 （Dang 2012) κ-Myc基因編碼一種在調(diào)芐基因表達 方面有重要作用的多功能轉(zhuǎn)錄因子，其功能牽涉到諸多生物過程，這些過程有助于腫瘤發(fā) 生，腫瘤發(fā)展，以及腫瘤轉(zhuǎn)移(Dang 2012)。
[0005] c-Myc是一個可以調(diào)節(jié)多個生理過程的不穩(wěn)定蛋白。泛素-蛋白酶體途徑(UPS)是 c-Myc在細胞中降解的最突出的機制之一(Farrell and Sears 2014)。鑒于浩如煙海的底 物需要相應(yīng)的特異性靶向E3泛素連接酶，因此人類E3連接酶的估計數(shù)目大于600(Bernd Sen 和Wolberger 2014) J3連接酶可分為三大家族:最新發(fā)現(xiàn)的（RING)-FINGER家族，HECT家族 和RING-between-RING(RBR)家族（Berndsen和Wolberger2014) jlNG-FINGER E3連接酶可 以直接催化泛素從E2轉(zhuǎn)移到底物。與此相反，HECT和RBR E3連接酶催化的是兩步反應(yīng)，其中 泛素首先從E2轉(zhuǎn)移到E3的一個活性的半胱氨酸位點，然后再從從E3到底物。作為RING-FINGER結(jié)構(gòu)泛素連接復(fù)合體的組分之一(Farrell和Sears 2014)，F(xiàn)BW7(通過介導(dǎo)c-Myc降 解來抑制其活性)是研究得最充分的E3泛素連接酶;它識別第c-Myc第58位蘇氨酸(T58)的 磷酸化，該磷酸化通過通過糖原合酶激酶3(GSK3)介導(dǎo)(Welcker等人2004，Yada等人2004)。 另一個RING-FINGER E3連接酶Skp2,能夠識別在c-Myc氨基末端的一段保守序列元件 (MBII)和HLH-LZ基序(第367-439氨基酸），促進它的多泛素化和降解，并導(dǎo)致c-Myc轉(zhuǎn)錄活 性的增強（Kim等人2003，von der Lehr等人2003)。第三個RING-FINGER E3連接酶β-TRCP， 結(jié)合在c-Myc的氨基末端，并使用UbcH5泛素結(jié)合酶(E2)以形成c-Myc上的異型泛素鏈;從而 增強c-Myc的穩(wěn)定性(Popov等人2010)。唯一被報道過的c-Myc的HECT E3連接酶HectH9,泛 素化c-Myc形成一個63位賴氨酸的多聚泛素鏈(Adhikary等人2005)，其并不引起的c-Myc降 解，但卻是c-Myc反式激活多個革E1基因所必需的(Adhikary等人2005)。因此，c-Myc的穩(wěn)定性 和泛素化之間存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)性，正如同c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性之間的關(guān)系一樣。
[0006] 作為經(jīng)典原癌基因之一，c-Myc在約70%的人類腫瘤中存在過量表達;然而，這些 腫瘤中只有20%表現(xiàn)出的c-Myc基因擴增或易位，這足以解釋c-Myc在蛋白水平的高表達 (Farrell和Sears 2014)。因此，在人類腫瘤中觀察到的c-Myc蛋白的過表達可能與相應(yīng)的 E3泛素連接酶的下調(diào)有關(guān)。事實上，腫瘤中已經(jīng)報道了 c-Myc的一些E3連接酶的異常表達 和/或突變。值得注意的是，在人類癌癥中FBW7的點突變可以導(dǎo)致其失活，并且可能不表達 (Farrell和ears 2014)。最近有研究表明，F(xiàn)BW7通過調(diào)節(jié)c-Myc的穩(wěn)定性來影響白血病起始 細胞活性，F(xiàn)BW7對c-Myc的泛素化的調(diào)節(jié)會控制慢性髓細胞性白血病發(fā)生和發(fā)展(King等熱 2013，Reavie等人2013)。與此相反，c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性的正調(diào)控基因 Skp2和HectH9顯示出致 癌性，他們的過表達在許多人類腫瘤中所驗證(Farre 11和Sears 2014)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明一個目的是提供ELL(C595A)蛋白的新用途。
[0008] 本發(fā)明提供了 ELL(C595A)蛋白在如下1)-6)至少一種中的應(yīng)用。
[0009] 1)制備促進腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品；
[0010] 2)制備促進腫瘤細胞迀移產(chǎn)品；
[0011] 3)制備提尚腫瘤細胞侵襲能力廣品；
[0012] 4)制備提尚與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達廣品；
[0013] 5)制備用于篩選治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的模型；
[0014] 6)制備促進腫瘤轉(zhuǎn)移的模型；
[0015]所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列為將ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨酸 突變?yōu)楸彼岬玫降男蛄小?br>[0016] 所述ELL蛋白氨基酸序列為序列表中序列2。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因為S100A、MARCKSL1、BCAM、BAG4、IP0^P/ 或CPSF7。
[0018] 上述應(yīng)用中，所述腫瘤為結(jié)腸癌;所述腫瘤細胞為結(jié)腸癌細胞;所述結(jié)腸癌細胞具 體為HCT116細胞；
[0019]所述產(chǎn)品為試劑盒或藥物。
[0020] 所述模型為動物模型，所述動物具體為小鼠。
[0021] 本發(fā)明另一個目的是提供如下1)-6)中任一種產(chǎn)品。
[0022]本發(fā)明提供了 1)_6)中任一種產(chǎn)品，其包括ELL(C595A)蛋白；
[0023] 1)制備促進腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品；
[0024] 2)制備促進腫瘤細胞迀移產(chǎn)品；
[0025] 3)制備提尚腫瘤細胞侵襲能力廣品；
[0026] 4)制備提尚與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達廣品；
[0027] 5)制備用于篩選治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的模型；
[0028] 6)制備促進腫瘤轉(zhuǎn)移的模型；
[0029]所述ELL(C595A)蛋白的氨基酸序列為將ELL蛋白的氨基酸序列第595位半胱氨酸 突變?yōu)楸彼岬玫降男蛄小?br>[0030] 所述ELL蛋白氨基酸序列為序列表中序列2。
[0031] 上述產(chǎn)品中，所述與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因為S100A、MARCKSL1、BCAM、BAG4、IP0^P/ 或CPSF7。
[0032] 上述產(chǎn)品中，所述腫瘤為結(jié)腸癌;所述腫瘤細胞為結(jié)腸癌細胞;所述結(jié)腸癌細胞具 體為HCT116細胞。
[0033] 上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品為試劑盒；
[0034] 所述模型為動物模型，所述動物具體為小鼠。
[0035]本發(fā)明第三個目的是提供一種蛋白質(zhì)。
[0036] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，其為如下1)或2):
[0037] 1)所示的蛋白的氨基酸序列為將序列表中序列2第595位半胱氨酸突變?yōu)楸彼?得到的序列；
[0038] 2)將1)所示的蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0039]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ELL突變體ELL(C595A)，失去E3泛素連接酶功能， 不能有效降解c-Myc蛋白，該突變體也不能抑制腫瘤細胞增殖和腫瘤形成。但是它可以誘導(dǎo) 腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，包括S100A4、MARCKSK1和BAG4等的上調(diào)表達，提高腫瘤細胞侵襲能力， 促進腫瘤細胞在小鼠體內(nèi)的迀徙和轉(zhuǎn)移。將該突變體轉(zhuǎn)染低惡性腫瘤細胞后，再將該轉(zhuǎn)染 后細胞，皮下注射裸鼠后，可制備腫瘤轉(zhuǎn)移的小鼠模型。該模型可應(yīng)用于篩選治療腫瘤轉(zhuǎn)移 藥物，以及用于研究原位腫瘤發(fā)展為轉(zhuǎn)移腫瘤機制的工具。
【附圖說明】
[0040] 圖1為ELL(C595A)突變體促進腫瘤轉(zhuǎn)移。
[00411圖2為ELL(C595A)突變體促進腫瘤轉(zhuǎn)移重復(fù)實驗。
[0042]圖3為ELL(C595A)過表達增強HCT116腫瘤細胞的迀移能力。
[0043] 圖4為ELL(C595A)過表達提高腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（S100A4，MARCKSL1，BAG4)的表 達。
【具體實施方式】
[0044] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 下述實施例中細胞及培養(yǎng)：
[0047] HEK293，HEK293T，HCT116 和 C0S7 細胞來自 ATCC。
[0048] HEK293，HEK293T和C0S7細胞使用添加 10%胎牛血清（？85;取(：1〇116公司）的 Dulbecco's modified Eagle's medium培養(yǎng)基（DMEM;HyClone公司）培養(yǎng);HCT116細胞使用 添加10%胎牛血清(FBS;Hyclone公司)McCoy的5A培養(yǎng)基(HyClone公司）培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為 37°C j^CC^VigoFeci^Vigorous Biotech)用于細胞轉(zhuǎn)染。
[0049] 下述實施例中抗體和試劑：
[0050] 使用的抗體如下：anti-ELL antibody(A0668，ABclonal ;51044-1_AP， Proteintech;HPA046076，Sigma-Aldrich)，anti-c-Myc antibody(9E10，Santa Cruz； A0309，ABclonal;D84C12，Cell Signal ing)，anti_Flag antibody(F1804，Sigma);anti_ HA antibody(Covance)，anti_His antibody(HI5,Santa Cruz)，anti_GAPDH antibody (SC_47724，Santa Cruz)，anti-a-tubulin antibody(EPR1333，Epitomics);使用的試劑如 下：chloroquine diphosphate(BioVison)，AICAR(Cayman)，MG132(Calbiochem)， cycloheximide(Sigma-Aldrich)〇
[0051 ] 下述實施例中免疫共沉淀和Western blot分析：
[0052] Anti-c-Myc antibody，anti_HA antibody和anti-Flag antibody-conjugated agarose beads貝勾自 Sigma-Aldrich〇Protein A/G Sepharose beads貝勾自GE Company。 Glutathione S_transferase(GST)-Bind Resir^[l|Novogen0