專利名稱：發(fā)酵萎縮芽孢桿菌制備Bacillamide C的培養(yǎng)基及其制備及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域的培養(yǎng)基及其制備，具體是一種發(fā)酵萎縮 芽孢桿菌制備Bacillamide C的培養(yǎng)基及其制備及應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
與陸地生物相比，海洋生物生活于高鹽、高壓、低溫、稀營(yíng)養(yǎng)等條件嚴(yán)苛的環(huán)境中。 為求生存，很多海洋生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨(dú)特的化學(xué)物質(zhì)。從海洋生物 中已發(fā)現(xiàn)多種活性物質(zhì)，包括抗腫瘤化合物、腫瘤促進(jìn)劑、抗炎癥/過敏化合物、抗菌、抗病 毒化合物、生物毒素、抗寄生蟲化合物、多不飽和脂肪酸等，其中相當(dāng)部分生物活性物質(zhì)是 陸地生物所沒有的。這些海洋生物活性物質(zhì)具有種類繁多、結(jié)構(gòu)特異復(fù)雜等特點(diǎn)。在眾多 海洋生物中，海綿是目前發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)最豐富的海洋生物之一，人們對(duì)海綿活性物質(zhì)寄予 極大的希望，但海綿體內(nèi)的活性物質(zhì)含量很低，捕撈海綿資源有限，藥源的供給不足使得海 綿藥物開發(fā)明顯滯后。為尋找穩(wěn)定可靠的藥源，進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，開展相關(guān)海綿共附生微生 物的研究是迫切而重要的工作。經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，于璐璐等(Lu-Lu Yu et al.，Helvetica Chimica Acta2009 ；92 607-611)從來自中國(guó)南海的貪婪倔海綿萎縮芽孢桿菌Bacillus atrophaeus C89菌液的乙酸乙酯萃取物中，分離到一種結(jié)構(gòu)較新的化合物Bacillamide C。 Bacillamides家族化合物及其衍生物已被證實(shí)對(duì)多環(huán)旋溝藻、藍(lán)藻和微藻有不同程度的抑 制作用。藻類引起的赤潮和水華對(duì)生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和人類健康的威脅日益嚴(yán)重，因而該家族作為 潛在的抑藻劑有很高的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺點(diǎn)，提供一種發(fā)酵萎縮芽孢桿菌制備 Bacillamide C的培養(yǎng)基及其制備及應(yīng)用方法，不僅能滿足搖瓶實(shí)驗(yàn)的需要，亦能滿足發(fā)酵 罐發(fā)酵大量制備Bacillamide C的要求。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種用于萎縮芽孢桿菌的培養(yǎng)基，其組分及含量為3.64g/L玉米淀 粉、6. Og/L胰蛋白胨、6. 29g/L碳酸鈣、4. Og/L大豆蛋白胨、0. 10g/L半胱氨酸和0. 02g/L色 氨酸，溶劑為人工海水。所述的人工海水的組份及含量為26. 518g/L的NaCl、2. 447g/L的MgCl2、3. 305g/ L 的 MgSO4U. 141g/L 的 CaCl2、0. 725g/L 的 KC1、0. 202g/L 的 NaHCO3 以及 0. 083g/L 的 NaBr， 溶劑為Millpore超純水，該人工海水的pH 7. 0-7. 2。本發(fā)明涉及上述用于萎縮芽孢桿菌培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟第一步、配制人工海水分別將NaCl、MgCl2、MgS04、CaCl2、KCl、NaHC03 以及 NaBr 溶 解于超純水中后進(jìn)一步混合。
第二步、在人工海水中加入玉米淀粉并加熱煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大 豆蛋白胨和碳酸鈣并攪拌溶解，然后進(jìn)行高溫殺菌得到培養(yǎng)基。所述的攪拌溶解過程中不斷補(bǔ)充純水補(bǔ)足玉米淀粉蒸煮過程中失去的水分。所述的高溫殺菌是指在121°C環(huán)境下滅菌20分鐘。本發(fā)明涉及上述培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，通過將半胱氨酸和色氨酸溶解于人工海水中 配成混合氨基酸溶液并采用過濾膜進(jìn)行過濾，然后將所述培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵萎縮芽孢桿菌進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加過濾后的混合氨基酸溶液，實(shí)現(xiàn)萎縮芽孢桿菌產(chǎn)量的優(yōu) 化。所述的混合氨基酸溶液中含有半胱氨酸0. 10g/L以及色氨酸0. 02g/L。采用本發(fā)明方法成功的對(duì)萎縮芽孢桿菌產(chǎn)Bacillamide C的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu) 化。在搖瓶水平上，將菌種分別接種到基本培養(yǎng)基和最優(yōu)培養(yǎng)基中，比較兩種培養(yǎng)基中菌種 的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)Bacillamide C的情況。在最優(yōu)培養(yǎng)基中發(fā)酵96h的Bacillamide C的產(chǎn)量達(dá)到22. 797mg/L，是在未優(yōu) 化的基本培養(yǎng)基中產(chǎn)量(2.746mg/L)的8. 3倍。這表明，在搖瓶水平上，單菌產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物 的能力明顯提高。之后使用最優(yōu)培養(yǎng)基的成分配比在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大培養(yǎng)初試。由 于部分物理?xiàng)l件的改變，最大菌濃度進(jìn)一步增至2. 385X 109/ml，是搖瓶發(fā)酵最大菌濃度 (1.78 XlOVml)的1.34倍。菌體生長(zhǎng)期的縮短使得5L罐上發(fā)酵的總時(shí)長(zhǎng)為72h，較之搖瓶 發(fā)酵所需的96h縮短了 24h，但5L罐上發(fā)酵72h的Bacillamide C產(chǎn)量為34. 80mg/L,是搖 瓶發(fā)酵96h Bacillamide C產(chǎn)量(22. 797mg/L)的1. 53倍，是培養(yǎng)基優(yōu)化前2. 746mg/L的 12. 7倍。本發(fā)明所得到的培養(yǎng)基成分不僅能滿足搖瓶實(shí)驗(yàn)的需要，亦能滿足發(fā)酵罐發(fā)酵的 要求。


圖1萎縮芽孢桿菌發(fā)酵Bacillamide C產(chǎn)量在基本培養(yǎng)基和最優(yōu)培養(yǎng)基中的對(duì)比 圖。圖2萎縮芽孢桿菌采用最優(yōu)培養(yǎng)基在5L發(fā)酵罐上培養(yǎng)的發(fā)酵動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)圖。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。以下實(shí)施例中涉及的Bacillamide C的具體為萎縮芽孢桿菌Bacillus atrophaeus菌株(學(xué)名)，其保藏信息/公開獲得渠道為該菌株16S rRNA序列與多株萎 縮芽孢桿菌的16S rRNA序列完全一致，萎縮芽孢桿菌在早稻田(北京)生物科技發(fā)展有限 公司銷售。 1、四種基本培養(yǎng)基的配制。1)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基10g胰蛋白胨，5g牛肉膏溶解于IL人工海水；2) LB培養(yǎng)基10胰蛋白胨，5g酵母膏溶解于IL人工海水；3)M2216培養(yǎng)基5g胰蛋白胨，Ig牛肉膏溶解于IL人工海水；
4
4)自制培養(yǎng)基5g玉米淀粉用IL人工海水煮沸糊化，加入5g胰蛋白胨和5g大豆 蛋白胨，攪拌溶解，以適量的純水補(bǔ)足玉米淀粉蒸煮過程中失去的水分至1L。加入5g碳酸 鈣。以上四種培養(yǎng)基皆于121°C滅菌20min。分別以上述四種培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，菌種接種量為1 % (ν/ν)，在250mL三角瓶中裝 液量IOOmL,在28°C、150rpm的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)96h，pH自然。采用HPLC法測(cè)定Bacillamide C含量，以上四種培養(yǎng)基中Bacillamide C含量分 別為-.2. 414mg/L, 1. 860mg/L, 1. 306mg/L和2. 746mg/L。由此得到比較好的基本培養(yǎng)基配方 (配方1)為5g/L玉米淀粉，5g/L大豆蛋白胨，5g/L胰蛋白胨，5g/L碳酸鈣，人工海水配制， PH自然。以配方1進(jìn)行發(fā)酵，Bacillamide C產(chǎn)量為2. 746mg/L。2、培養(yǎng)基中氨基酸前體的添加。在配方1的基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定半胱氨 酸、丙氨酸和色氨酸單獨(dú)添加時(shí)的最佳時(shí)間和濃度。對(duì)每種氨基酸，分別于發(fā)酵起始、遲滯 期末、對(duì)數(shù)期中期、穩(wěn)定期起始、穩(wěn)定期開始后20h、穩(wěn)定期開始后40h單獨(dú)添加到IOOml發(fā) 酵液中，添加濃度為100mg/L發(fā)酵液，測(cè)定Bacillamide C產(chǎn)量的變化。而后在最佳添加時(shí) 間的基礎(chǔ)上，對(duì)每種氨基酸分別用20mg/L發(fā)酵液、60mg/L發(fā)酵液、100mg/L發(fā)酵液、140mg/L 發(fā)酵液、180mg/L發(fā)酵液作為添加濃度添加到IOOml發(fā)酵液中，測(cè)定Bacillamide C產(chǎn)量的 變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明半胱氨酸和色氨酸于穩(wěn)定期開始后40h添加最佳，最佳添加濃度 均為100mg/L發(fā)酵液，Bacillamide C產(chǎn)量分別達(dá)到7. 472mg/L和6. 360mg/L ；丙氨酸于穩(wěn) 定期起始添加最佳，最佳添加濃度為100mg/L發(fā)酵液，Bacillamide C產(chǎn)量達(dá)到7. 315mg/L。 從而得到最佳培養(yǎng)基的(配方2)組分為5g/L玉米淀粉，5g/L大豆蛋白胨，5g/L胰蛋白胨， 5g/L碳酸鈣，0. lg/L半胱氨酸(穩(wěn)定期開始后40h添加)，0. lg/L色氨酸(穩(wěn)定期開始后 40h添加)，0. lg/L丙氨酸(穩(wěn)定期起始添加)，人工海水配制，pH自然。3、應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法確定最優(yōu)培養(yǎng)基。在配方2的基礎(chǔ)上，首先應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)挑選出對(duì)Bacillamide C產(chǎn) 量影響較大的因素玉米淀粉、丙氨酸、碳酸鈣、半胱氨酸。它們的添加量水平如表1所示表IPlackett-Burman實(shí)驗(yàn)中各因素的高低值
權(quán)利要求
一種用于萎縮芽孢桿菌的培養(yǎng)基，其特征在于，其組分及含量為3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸鈣、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶劑為人工海水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于萎縮芽孢桿菌的培養(yǎng)基，其特征是，所述的人工海水 的組份及含量為=26. 518g/L 的 NaCl,2. 447g/L 的 MgCl2,3. 305g/L 的 MgSO4U. 141g/L 的 CaCl2、0. 725g/L 的 KC1、0. 202g/L 的 NaHCO3 以及 0. 083g/L 的 NaBr，溶劑為 Millpore 超純 水，該人工海水的pH 7. 0-7. 2。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、配制人工海水分別將NaCl、MgCl2、MgSO4, CaCl2, KC1、NaHCO3以及NaBr溶解于超純水中后進(jìn)一步混合；第二步、在人工海水中加入玉米淀粉并加熱煮沸糊化，然后依次加入胰蛋白胨、大豆蛋 白胨和碳酸鈣并攪拌溶解，然后進(jìn)行高溫殺菌得到培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征是，所述的攪拌溶解過程中不斷 補(bǔ)充純水補(bǔ)足玉米淀粉蒸煮過程中失去的水分。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征是，所述的高溫殺菌是指在121°C 環(huán)境下滅菌20分鐘。
6.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，其特征在于，通過將半胱氨 酸和色氨酸溶解于人工海水中配成混合氨基酸溶液并采用過濾膜進(jìn)行過濾，然后將所述培 養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵萎縮芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加過濾后的混合氨基酸溶 液，實(shí)現(xiàn)萎縮芽孢桿菌產(chǎn)量的優(yōu)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，其特征是，所述的混合氨基酸溶液中含 有半胱氨酸0. 10g/L以及色氨酸0. 02g/L。
全文摘要
一種細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)酵萎縮芽孢桿菌制備Bacillamide C的培養(yǎng)基及其制備及應(yīng)用方法，該培養(yǎng)基的組分及含量為3.64g/L玉米淀粉、6.0g/L胰蛋白胨、6.29g/L碳酸鈣、4.0g/L大豆蛋白胨、0.10g/L半胱氨酸和0.02g/L色氨酸，溶劑為人工海水。本發(fā)明不僅能滿足搖瓶實(shí)驗(yàn)的需要，亦能滿足發(fā)酵罐發(fā)酵大量制備Bacillamide C的要求。
文檔編號(hào)C12R1/07GK101948891SQ201010278110
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者張風(fēng)麗, 李志勇, 金靚婕 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)