專利名稱：遺傳沉默的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
總的來說本發(fā)明涉及誘導(dǎo)，促進(jìn)或者易化動(dòng)物細(xì)胞或包含所述動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞組表型改變地方法。表型表達(dá)的調(diào)節(jié)可通過遺傳操作方便地進(jìn)行，如通過減少轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白產(chǎn)物等方法。誘導(dǎo)，促進(jìn)或易化可表達(dá)的遺傳序列沉默的能力提供了一種在例如，醫(yī)藥，獸醫(yī)和動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)中調(diào)節(jié)表型的方法。本發(fā)明所包含的可表達(dá)的遺傳序列不僅包括正常存在于特定動(dòng)物細(xì)胞中的基因(即固有基因)還包括通過重組方法或由病原媒介物如病毒轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入的基因。
背景技術(shù)：
本說明書中的任何現(xiàn)有技術(shù)的引用不是，也不應(yīng)被視為是承認(rèn)或任何形式的暗示這一現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)成在澳大利亞或任何其它國(guó)家公知常識(shí)的一部分。
本說明書中有關(guān)出版物的詳細(xì)文獻(xiàn)資料按作者索引列于說明書的末尾。
日益成熟的重組DNA技術(shù)極大地促進(jìn)了醫(yī)藥和獸醫(yī)工業(yè)的研究和發(fā)展。重組DNA技術(shù)的一個(gè)重要的方面是通過調(diào)節(jié)遺傳物質(zhì)的表達(dá)改變基因型的方法的開發(fā)。許多所需的表型特征均可以通過選擇性的基因表達(dá)失活來獲得。基因失活，即基因表達(dá)失活，可以順式和反式形式出現(xiàn)。對(duì)于順式失活，僅靶基因失活而其它分布于基因組中的類似基因不受影響。而與此相反對(duì)于反式失活，一個(gè)或多個(gè)分布于基因組中與特定的靶序列具有同源性的基因也失活。在文章中經(jīng)常用到“基因沉默”這一術(shù)語(yǔ)。但一般這樣用時(shí)并不注重所述的基因沉默是以順式還是反式起作用。由于順式失活不如反式失活有用，因此這與基因沉默技術(shù)的商業(yè)利用相關(guān)。例如，用促進(jìn)順式失活的技術(shù)成功靶定內(nèi)源基因(如植物基因)或外源基因(如病原體的基因)的可能性較小。而且，在用標(biāo)記基因監(jiān)測(cè)基因失活的情況下，時(shí)常不能區(qū)分順式和反式失活事件。因此在文獻(xiàn)中有關(guān)基因失活的精確分子機(jī)制存在混亂(Garrick等，1998；Pal-Bahdra等，1997；Bahramian和Zarbl，1999)。
現(xiàn)有的文獻(xiàn)中對(duì)有關(guān)基因失活或基因沉默的機(jī)制相當(dāng)混亂。例如，術(shù)語(yǔ)“反義”用于描述將設(shè)計(jì)為表達(dá)反義RNAs的遺傳構(gòu)建體引入細(xì)胞以降低特定RNA表達(dá)的情況。這種策略在實(shí)驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用中被廣泛使用。反義RNA的功能機(jī)制一般認(rèn)為包括在內(nèi)源有義RNAs和抑制翻譯的反義RNA之間形成雙螺旋。但沒有明確的證據(jù)說明這一機(jī)制可以存在于所有高等真核生物系統(tǒng)中。
術(shù)語(yǔ)“基因沉默”常用于表示在真核生物細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)失活。盡管一般認(rèn)為上述情況是由轉(zhuǎn)錄失活造成的，但在記載有關(guān)這一情況的機(jī)制的文獻(xiàn)中存在相當(dāng)多的混亂。既然基因自身的表達(dá)失活即沒有其它基因的反式失活作用，不清楚這一特定的機(jī)制是否有什么實(shí)際的功用。
在植物中，術(shù)語(yǔ)“共抑制”用于確切描述轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地導(dǎo)入基因組并表達(dá)為有義RNA的情況。令人驚訝的是，這種轉(zhuǎn)基因序列的表達(dá)導(dǎo)致同源基因的失活，即一種基因表達(dá)的序列特異性的反式失活(Napoli等，1990；van der Krol等，1990)。出現(xiàn)這種情況的細(xì)胞的分子表型在植物系統(tǒng)中已有詳細(xì)描述基因轉(zhuǎn)錄為前體RNA但并不被翻譯。另一個(gè)描述共抑制的術(shù)語(yǔ)是轉(zhuǎn)錄后基因失活。人們認(rèn)為mRNA序列的消失是序列特異的RNA降解系統(tǒng)失活的結(jié)果(lindbo等，1993；Waterhouse等，1999)。在有關(guān)術(shù)語(yǔ)“共抑制”的動(dòng)物文獻(xiàn)中存在相當(dāng)?shù)幕靵y(Bingham，1997)。
在作出本發(fā)明的工作中，發(fā)明人應(yīng)用遺傳操作技術(shù)將基因沉默引入動(dòng)物細(xì)胞。所述的遺傳操作技術(shù)包括轉(zhuǎn)錄后失活作用的誘導(dǎo)。本發(fā)明人由此提供一種在動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行共抑制的方法。所述的在動(dòng)物細(xì)胞中共抑制的誘導(dǎo)允許在動(dòng)物多種表型范圍內(nèi)進(jìn)行操作。發(fā)明簡(jiǎn)述
在本說明書中，除非是上下文需要，用語(yǔ)“包含”或該用語(yǔ)的變形“包括”或“含”應(yīng)理解為指包含所闡述的元素或整體或元素或整體構(gòu)成的組，但不排除其他元素或整體或元素或整體所構(gòu)成的組。
核苷酸序列和氨基酸序列通過序列標(biāo)識(shí)號(hào)(SEQ ID NO)表示。所述的SEQ ID Nos數(shù)字相當(dāng)于序列標(biāo)識(shí)<400>1，<400>2等。在權(quán)利要求后附有序列表。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供含與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中內(nèi)源靶核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，其中，一旦將所述的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入所述的動(dòng)物細(xì)胞，含所述內(nèi)源核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
本發(fā)明的另一方面提供一種遺傳構(gòu)建體，其包含
(i)一種與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列；
(ii)與(i)中所定義的靶內(nèi)源核苷酸序列基本互補(bǔ)的單一核酸序列；
(iii)分隔上述(i)和(ii)中核苷酸序列的內(nèi)含子核苷酸序列；
其中，一旦當(dāng)將所述的構(gòu)建體引入所述動(dòng)物細(xì)胞，由包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的轉(zhuǎn)錄能力。
本發(fā)明的又一方面提供一種遺傳構(gòu)建體，其包括
(i)與在脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；
(ii)與(i)中所定義的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；
(iii)分隔上述(i)和(ii)中核苷酸序列的內(nèi)含子核苷酸序列；
其中，一旦將所述的構(gòu)建體引入所述的動(dòng)物細(xì)胞，由含有所述的內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力，且含有所述內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有下降和/或由含有所述核苷酸內(nèi)源靶序列的基因轉(zhuǎn)錄的總RNA水平基本上沒有下降。
本發(fā)明的另一方面提供經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于所述的細(xì)胞
(i)含有引入所述細(xì)胞或其親代細(xì)胞的靶內(nèi)源核苷酸序列的有意拷貝；
(ii)與未經(jīng)遺傳修飾的同一所述細(xì)胞相比基本上沒有由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因編碼的蛋白產(chǎn)物；和
(iii)相對(duì)于未經(jīng)遺傳修飾的同一所述細(xì)胞，穩(wěn)定狀態(tài)的總RNA水平基本上沒有下降。
本發(fā)明的另一方面提供一種改變脊椎動(dòng)物細(xì)胞表型的方法，其中所述的表型是由內(nèi)源基因的表達(dá)所賦予或者所促進(jìn)的，所述的方法包括將一種遺傳構(gòu)建體引入所述的細(xì)胞或所述細(xì)胞的親本細(xì)胞，其中所述的遺傳構(gòu)建體含有與包含上述內(nèi)源基因或其部分的核苷酸序列基本同一的核苷酸序列，且與未導(dǎo)入上述遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞相比轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
本發(fā)明的再一方面提供一種經(jīng)遺傳修飾含有與所述鼠科動(dòng)物細(xì)胞基因組中的靶內(nèi)源核酸序列基本同一的核苷酸序列的鼠科動(dòng)物，其中由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
本發(fā)明的又一方面涉及含有與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體在動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生中的應(yīng)用，其中由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
本發(fā)明的又一方面涉及脊椎動(dòng)物中的遺傳治療的方法，該方法包括向所述的動(dòng)物細(xì)胞中引入含有與所述動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的核苷酸序列，使得在引入了所述的核苷酸序列后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。


圖1是質(zhì)粒pEGFP-Nl的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例1。
圖2是質(zhì)粒pCMV.cass的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例11。
圖3是質(zhì)粒pCMV.BGI2.cass的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例11。
圖4是質(zhì)粒pCMV.GFP.BGI2.PFG的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例12。
圖5是質(zhì)粒pCMV.EGFP的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例12。
圖6是質(zhì)粒pCMVpur.BGI2.cass的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例12。
圖7是質(zhì)粒pCMVpur.GFP.BGI2.PFG的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例12。
圖8是推定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的Southern印跡分析的例子，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在這個(gè)例子中是已由構(gòu)建體pCMV.EGFP轉(zhuǎn)化的豬腎細(xì)胞(PK)。由PK-1細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系分離的基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI消化，然后被32P-dCTP標(biāo)記的EGFP DNA片段探測(cè)。泳道A是分子量標(biāo)記，其中每一片段的大小用千堿基對(duì)(kb)表示；泳道B是親本細(xì)胞系PK-1。泳道C是A4，表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因PK-1細(xì)胞系；泳道D是C9，非表達(dá)的轉(zhuǎn)基因PK-1細(xì)胞系。
圖9是在普通光下和設(shè)計(jì)為檢測(cè)GFP的熒光條件下觀察到的由pCMV.EGFP轉(zhuǎn)化的PK-1細(xì)胞系的顯微圖。A在普通光下的PK EGFP2.11細(xì)胞；B在熒光條件下的PK EGFP 2.11 細(xì)胞；C普通光下的PK EGFP 2.18細(xì)胞；D熒光條件下的PK EGFP 2.18細(xì)胞。
圖10是質(zhì)粒pCMV.BEV2.BGI 2.2VEB的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例13。
圖11是質(zhì)粒pCMV.BEV.EGFP.VEB的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例13。
圖12是CRIB-1細(xì)胞和CRIB-1轉(zhuǎn)化系[CRIB-1BGI2#19(tol)]在用BEV轉(zhuǎn)染前和同一滴度的BEV轉(zhuǎn)染后48hr的顯微圖。ABEV轉(zhuǎn)染前的CRIB-1細(xì)胞；BBEV轉(zhuǎn)染后48hr的CRIB-1細(xì)胞；CBEV轉(zhuǎn)染前的CRIB-1 BGI2#19(tol)細(xì)胞；DBEV轉(zhuǎn)染后48hr的CRIB-1 BGI2#19(tol)。詳細(xì)情況參見實(shí)施例13。
圖13是質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2.RYT的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例14。
圖14是質(zhì)粒pCMV.TYR的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例14。
圖15是質(zhì)粒pCMV.TYR.TYR的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例14。
圖16是用pCMV.TYR.BGI2.RYT轉(zhuǎn)化的B16細(xì)胞和B16細(xì)胞的著色水平。細(xì)胞系是，從左至右B16，B16 2.1.6，B162.1.11，B16 3.1.4，B163.1.15，B164.12.2和B164.12.3。詳細(xì)情況參見實(shí)施例14。
圖17是質(zhì)粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例16。
圖18是質(zhì)粒pCMV.MTK.BGI2.KTM的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例17。
圖19是質(zhì)粒HER2.BGI2.2REH的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例18。
圖20是用pCMV.HER2.BGI2.2REH轉(zhuǎn)化的MDA-MB-468細(xì)胞和MDA-MB468細(xì)胞的染色HER-2的免疫熒光顯微圖。AMDA-MB-468細(xì)胞；B僅由二抗染色的MDA-MB-468細(xì)胞；C對(duì)HER-2著色的MDA-MB-468 1.4細(xì)胞；D對(duì)HER-2著色的MDA-MB-468 1.10細(xì)胞。詳細(xì)情況參見實(shí)施例18。
圖21是在(A)MDA-MB-468細(xì)胞；(B)MDA-MB-468 1.4細(xì)胞；(C)MDA-MB-468 1.10細(xì)胞中HER-2表達(dá)的FACS分析。詳細(xì)情況參見實(shí)施例18。
圖22是質(zhì)粒pCMV.BRN2.BGI2.2NRB的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例19。
圖23是質(zhì)粒pCMV.YBl.BGI2.1BY的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例20。
圖24是質(zhì)粒pCMV.YBl.p53.BGI2.35p.1BY的示意圖。詳細(xì)情況參見實(shí)施例20。
圖25是在用YB-1-相關(guān)基因構(gòu)建體和寡核苷酸轉(zhuǎn)染后活細(xì)胞計(jì)數(shù)的矩形圖。錐蟲藍(lán)染色后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)一式四份樣品進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。柱高表示兩次獨(dú)立轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均細(xì)胞計(jì)數(shù)，垂線標(biāo)志表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。(A)用基因構(gòu)建體(i)對(duì)照pCMV.EGFP；(ii)pCMV.YB1.BGI2.1BY；(iii)pCMV.Ybl.p53.BGI2.35p.1BY轉(zhuǎn)染72hr后的活B10.2細(xì)胞計(jì)數(shù)。所用的所有材料和方法如實(shí)施例20所述。(B)用基因構(gòu)建體(i)對(duì)照pCMV.EGFP；(ii)pCMV.YBl.BGI 2.1 BY；(iii)pCMV.YBl.p53.BGI2.35p.1BY轉(zhuǎn)染后72hr活Pam 212細(xì)胞計(jì)數(shù)。所用的所有材料和方法如實(shí)施例20所述。(C)用寡核苷酸(i)對(duì)照僅Lipofectin(商標(biāo))；(ii)對(duì)照非特異的寡核苷酸；(iii)假(decoy)Y-框寡核苷酸轉(zhuǎn)染后18hr活B10.2細(xì)胞計(jì)數(shù)。所用的所有材料和方法如實(shí)施例20所述。(D)用寡核苷酸(i)對(duì)照僅Lipofectin(商標(biāo))；(ii)對(duì)照非特異的寡核苷酸；(iii)假(decoy)Y-框寡核苷酸轉(zhuǎn)染后18hr活Pam 212細(xì)胞計(jì)數(shù)。所用的所有材料和方法如實(shí)施例20所述。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述
本發(fā)明部分取決于應(yīng)用與脊椎動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)源核苷酸序列相關(guān)的有義核酸序列下調(diào)含有所述內(nèi)源核苷酸序列的基因的表達(dá)。所述的內(nèi)源核苷酸序列可以包含全部或部分基因，且可以是或不是所述細(xì)胞所固有的。非固有基因包括通過例如病毒感染或重組DNA技術(shù)導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的基因。固有基因可以包括被視為天然存在于所述動(dòng)物細(xì)胞中的基因。所述的靶內(nèi)源基因的下調(diào)包括向特定的細(xì)胞或其親代細(xì)胞中引入有義核苷酸序列。
據(jù)此，本發(fā)明的一方面提供含有與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，其中當(dāng)向所述的動(dòng)物細(xì)胞中引入所述的遺傳構(gòu)建體后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
提及“改變了的......能力”優(yōu)選包括相對(duì)于未經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞翻譯水平下降，如約10％到約100％，更優(yōu)選約20％到約90％。在一尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的相應(yīng)于靶內(nèi)源序列的基因基本上不翻譯成蛋白產(chǎn)物。適宜地，改變了的翻譯能力可由任何表型改變所確定，其中所述的表型在未經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞中由上述內(nèi)源基因的表達(dá)所促進(jìn)。
優(yōu)選地，所述脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚或爬行動(dòng)物。優(yōu)選地，所述脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是人，靈長(zhǎng)類，家畜動(dòng)物(如綿羊，母牛，山羊，豬，驢，馬)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如大鼠，小鼠，兔，豚鼠，倉(cāng)鼠)，陪伴動(dòng)物(如狗，貓)或捕獲的野生動(dòng)物。特別優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來自人和鼠科動(dòng)物。
所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中的核苷酸序列是指“基因組”核苷酸序列，優(yōu)選相應(yīng)于編碼為所述動(dòng)物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞組和/或含有所述細(xì)胞的動(dòng)物帶來特定表型的產(chǎn)物的基因。如上所述，上述內(nèi)源基因可以是動(dòng)物細(xì)胞所固有的，也可以是來自外源，如病毒，胞內(nèi)寄生蟲或通過重組或其他物理方法導(dǎo)入的。因此所用到的“基因組”或“基因組的”不僅包括染色體遺傳物質(zhì)還包括染色體外如來自非整合的病毒的遺傳物質(zhì)。所用到的“基本上同一的”核苷酸序列也包含在術(shù)語(yǔ)基本同源和基本相似中。
此處所用到的“基因”應(yīng)以其最廣泛的內(nèi)涵來理解，其包括(i)由轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(即，內(nèi)含子，5’-和3’-非翻譯序列)組成的標(biāo)準(zhǔn)的基因組基因；(ii)相應(yīng)于編碼區(qū)(即外顯子)的mRNA或cDNA，可選擇地包含與其相連接的5’-和3’-非翻譯序列；或(iii)在體外擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段或其他重組核酸分子，包含全部或部分編碼區(qū)和/或與其相連的5’-和3’-非翻譯序列。
所述的在動(dòng)物細(xì)胞基因組中的基因也指靶基因或靶序列，且可以如上所述天然存在于基因組中或可以通過重組技術(shù)或其他方式，如病毒感染引入。所用術(shù)語(yǔ)“基因”并不解釋為將所述靶序列限定為任何特定的結(jié)構(gòu)，大小或組分。
所述的靶序列或基因是任何能表達(dá)以形成mRNA和/或蛋白產(chǎn)物的核苷酸序列。所用術(shù)語(yǔ)“表達(dá)為”以及相關(guān)術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括轉(zhuǎn)錄和/或翻譯步驟之一或全部。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的在遺傳構(gòu)建體中的核苷酸序列進(jìn)一步包含與靶內(nèi)源核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
因此，本發(fā)明的另一方面提供一種遺傳構(gòu)建體，其包括
(i)與在脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列；
(ii)與(i)中所定義的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上互補(bǔ)的單一核苷酸序列；
(iii)將(i)和(ii)中所述的核苷酸序列分隔開的內(nèi)含子核苷酸序列；
其中當(dāng)將所述的構(gòu)建體引入所述動(dòng)物細(xì)胞后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的轉(zhuǎn)錄能力。
優(yōu)選地，所述的同一和互補(bǔ)序列由內(nèi)含子序列相分隔。合適的內(nèi)含子序列的例子包括但不限于來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子，如人β-珠蛋白內(nèi)含子2的全部或部分。
蛋白產(chǎn)物喪失可方便地通過表型特性的改變(如喪失)或基因型特性的變化觀察到。
靶基因可以編碼結(jié)構(gòu)蛋白或調(diào)節(jié)蛋白?！罢{(diào)節(jié)蛋白”包括轉(zhuǎn)錄因子，熱激蛋白或DNA/RNA復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和/或翻譯中所涉及的蛋白。所述的靶基因可以存在于已整合到動(dòng)物基因中的病毒基因組中或作為染色體外元件存在。例如靶基因可以是在HIV基因組中的基因。在這種情況下，所述的遺傳構(gòu)建體對(duì)滅活哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的HIV基因的翻譯是有用的。
當(dāng)靶基因是病毒基因時(shí)，特別優(yōu)選該病毒基因編碼對(duì)所述病毒的復(fù)制和繁殖至關(guān)重要的功能，例如尤其是但不限于DNA聚合酶或RNA聚合酶基因或病毒外殼蛋白基因等。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中所述的靶基因包含尤其是來自單鏈(+)RNA病毒如牛腸道病毒(BEV)，新培斯甲病毒(Sinbis alphavirus)或慢病毒，如但不限于免疫缺陷病毒(如HIV-1)的RNA聚合酶基因，或者，來自雙鏈DNA病毒如牛皰疹病毒或單純皰疹病毒I(HSVI)的DNA聚合酶基因。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)后滅活優(yōu)選通過涉及反式喪失的機(jī)制達(dá)到。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體一般但并不僅僅包括合成基因?！昂铣苫颉卑环N核苷酸序列，當(dāng)該核苷酸序列在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)其下調(diào)所述動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)源的同源基因或存在于其中的整合的病毒基因的表達(dá)。
本發(fā)明的合成基因可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)由天然存在的基因衍生而來，僅需要的條件是合成基因在核苷酸水平上至少與其表達(dá)將被修飾的靶基因的一部分基本同一或類似。“基本上同一”是指合成基因的結(jié)構(gòu)基因序列與靶基因中連續(xù)的30個(gè)或更多的核苷酸至少約80-90％同一，優(yōu)選與靶基因中連續(xù)的30個(gè)或更多的核苷酸至少約90-95％同一，更優(yōu)選與靶基因中連續(xù)的30個(gè)或更多的核苷酸至少約95-99％同一，或與靶基因中連續(xù)的30個(gè)或更多的核苷酸絕對(duì)同一?；蛘?，所述基因能夠與靶基因序列在低嚴(yán)謹(jǐn)，優(yōu)選中度嚴(yán)謹(jǐn)或更優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交。
此處所涉及的低嚴(yán)謹(jǐn)條件包括和涵蓋用于雜交的從至少約0到至少約15％v/v甲酰胺及從至少約1M到至少約2M的鹽，并在至少約1M到至少約2M鹽條件下洗膜。一般來說，低嚴(yán)謹(jǐn)條件從約25-30℃到約42℃。所述的溫度可以改變，高溫可以用于替換甲酰胺和/或給出替代嚴(yán)謹(jǐn)條件。替代的嚴(yán)謹(jǐn)條件可以在需要時(shí)使用，如中等嚴(yán)謹(jǐn)條件，其包括用于雜交的從至少約16％v/v到至少約30％v/v甲酰胺及從至少約0.5M到至少約0.9M的鹽，并在至少約0.5M到至少約0.9M鹽條件下洗膜；或度嚴(yán)謹(jǐn)條件，其包括用于雜交的從至少約31％v/v到至少約50％v/v甲酰胺及從至少約0.01M到至少約0.15M的鹽，并在至少約0.01M到至少約0.15M鹽條件下洗膜。一般洗膜在Tm＝69.3+0.41(G+C)％條件下進(jìn)行(Marmur和Doty，1962)。但是雙螺旋DNA的Tm隨每增加1％的錯(cuò)配堿基數(shù)而下降1℃(Bonner and Laskey，1974)。在這些雜交條件下甲酰胺是可選擇的。因此特定的優(yōu)選嚴(yán)謹(jǐn)水平定義如下低嚴(yán)謹(jǐn)條件是6×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS在25-42℃下；中度嚴(yán)謹(jǐn)條件是2×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS在20℃到65℃的范圍內(nèi)；高度嚴(yán)謹(jǐn)條件是0.1×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS在至少65℃下進(jìn)行。
一般而言，本發(fā)明的合成基因可以經(jīng)誘變產(chǎn)生單或多個(gè)核苷酸替代，缺失和/或添加但并不影響其修飾靶基因表達(dá)的能力。本發(fā)明的合成基因的核苷酸插入衍生物包括5’和3’末端的融合及單個(gè)或多個(gè)核苷酸的序列內(nèi)插入。盡管適當(dāng)篩選所得產(chǎn)物隨機(jī)插入也是可能的，但插入的核苷酸變異體是那些在核苷酸序列內(nèi)的預(yù)定位置引入了一個(gè)或多個(gè)核苷酸的序列。缺失變異體以從所述序列中去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸為特征。替代核苷酸變異體是指在序列中至少去除一個(gè)核苷酸并用不同的核苷酸插入到該位置。這樣的替代可以是“沉默”的，因?yàn)樗龅奶娲]有改變?cè)撐恢玫拿艽a子所定義的氨基酸。另外，替代也可以設(shè)計(jì)為將一個(gè)氨基酸用與之行為相似或有相似電荷，極性，或疏水性的氨基酸替代。
據(jù)此，本發(fā)明延及上述合成基因的同系物，類似物和衍生物。
為此，在上文中所定義的基因或核苷酸序列的“同系物”應(yīng)指分離的核酸分子，盡管該核酸分子內(nèi)部存在一個(gè)或多個(gè)核苷酸的替代，插入，缺失或重排但其與本發(fā)明的核酸分子或其互補(bǔ)的序列基本上相同。
在上文中所定義的基因或核苷酸序列的“類似物”應(yīng)指分離的核酸分子，盡管該核酸分子內(nèi)部存在通常情況下不存在于該分離的核酸分子中的非核苷酸組分，例如碳水化合物，放射性化學(xué)物質(zhì)(包括放射性核苷酸)，報(bào)告分子例如但不限于DIG，堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶等但其與本發(fā)明的核酸分子或其互補(bǔ)的序列基本上相同。
在上文中所定義的基因或核苷酸序列的“衍生物”應(yīng)指任何與所述序列或其一部分具有顯著的序列相似性的分離的核酸分子。
因此，所述合成基因的結(jié)構(gòu)基因組分可以包含與存在于動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)源靶基因，外源靶基因或病毒靶基因中30個(gè)連續(xù)的核苷酸具有至少80％的同一性或同源性的核苷酸序列或其同源物，類似物，衍生物或它們的互補(bǔ)序列。
本發(fā)明所述的遺傳構(gòu)建體一般但并不僅僅包含可操作地與啟動(dòng)子序列相連接的核苷酸序列，如合成基因的形式。所述遺傳構(gòu)建體中的其它組分包括但不限于調(diào)節(jié)區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始或修飾位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)編碼報(bào)告分子的基因?？梢园谒鲞z傳構(gòu)建體中的其他組分還可以包括病毒組分如病毒DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。非病毒組分包括RNA-依賴的RNA聚合酶。所述的合成基因的結(jié)構(gòu)部分可以包含或不包含翻譯起始位點(diǎn)或5’-和3’-非翻譯區(qū)域，及可以編碼或不編碼由相應(yīng)的內(nèi)源哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)生的全長(zhǎng)的蛋白。
本發(fā)明的另一方面提供一種包含基本上與哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中的核苷酸序列同源的并可操作地與啟動(dòng)子相連接的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，該遺傳構(gòu)建體可選擇地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列和/或編碼報(bào)告分子的基因序列，其中當(dāng)上述的遺傳構(gòu)建體引入動(dòng)物細(xì)胞后，與所述遺傳構(gòu)建體上的核苷酸序列同源的內(nèi)源核苷酸序列的表達(dá)通過包含轉(zhuǎn)錄后調(diào)制的過程被抑制，減弱或下調(diào)。
此處所用到的“啟動(dòng)子”應(yīng)視為指其最廣泛的含義，其包括典型基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如在真核細(xì)胞中精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA框，帶有或不帶有CCAAT框和附加調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列，增強(qiáng)子和沉默子)。
啟動(dòng)子通常但不是必須位于其所調(diào)節(jié)的本發(fā)明合成基因中結(jié)構(gòu)基因組分的上游或5’端。而且包括啟動(dòng)子在內(nèi)的調(diào)節(jié)元件通常位于距所述結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2kb的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”也用于描述導(dǎo)致，激活或增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離的核酸分子表達(dá)的合成或融合分子或其衍生物。也可能需要另一個(gè)或相同的啟動(dòng)子在植物，動(dòng)物，昆蟲，真菌，酵母或細(xì)菌細(xì)胞中行使功能。優(yōu)選的啟動(dòng)子可以包含一個(gè)或多個(gè)特異調(diào)控元件的附加拷貝以進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，其反過來調(diào)節(jié)和/或改變所述基因的時(shí)空表達(dá)。例如，可使所述結(jié)構(gòu)基因表達(dá)具有可誘導(dǎo)性的調(diào)節(jié)元件可置于驅(qū)動(dòng)核酸分子表達(dá)的異源啟動(dòng)子序列的附近。
將結(jié)構(gòu)基因置于啟動(dòng)子的調(diào)控下是指安排所述分子的位置使其表達(dá)受啟動(dòng)子序列的控制。
啟動(dòng)子一般置于其所控制的基因的5’(上游)。在異源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組合的結(jié)構(gòu)中，一般優(yōu)選啟動(dòng)子到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離與在天然狀態(tài)下該啟動(dòng)子與其所調(diào)節(jié)的基因，即取得該啟動(dòng)子的基因的距離相似。本領(lǐng)域中已知在不損害所述啟動(dòng)子功能的前提下上述距離的一些變化也是可以適應(yīng)的。類似地，優(yōu)選地依照其天然狀態(tài)下，即取得該調(diào)節(jié)元件的基因中的設(shè)置確定相對(duì)于異源基因的調(diào)節(jié)序列元件的位置。同樣，本領(lǐng)域中已知這樣的距離可以有變化。
所述的啟動(dòng)子可以組成型地調(diào)節(jié)所述結(jié)構(gòu)基因組分的表達(dá)，或根據(jù)發(fā)生表達(dá)的有關(guān)細(xì)胞，組織或器官的不同或出現(xiàn)上述表達(dá)的發(fā)育階段的不同，或?qū)Υ碳さ姆磻?yīng)如生理壓力，調(diào)節(jié)蛋白，激素，病原體或金屬離子等的不同而有所不同。
優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子可以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中核酸分子的表達(dá)，至少是在靶基因在其中表達(dá)的期間，更優(yōu)選還在所述細(xì)胞中所述靶基因可檢測(cè)的表達(dá)將將開始之前。所述的啟動(dòng)子可以是組成型的，誘導(dǎo)型的或發(fā)育調(diào)節(jié)型的。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”或“可操作地在......控制下”或類似的表達(dá)應(yīng)視為是指在細(xì)胞中所述結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)在與其空間上相連的啟動(dòng)子的控制之下。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括多個(gè)核苷酸序列，每個(gè)核苷酸序列均可任選地與一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子相連，每個(gè)核苷酸序列均指向動(dòng)物細(xì)胞中的靶基因。
多核苷酸序列(multiple nucleotide sequence)可以包括兩個(gè)或多個(gè)同一核苷酸序列的串聯(lián)重復(fù)的串聯(lián)體，或者兩個(gè)或多個(gè)非同一核苷酸序列的串聯(lián)陣列或串聯(lián)體，唯一的要求就是所包含的每一個(gè)核苷酸序列需與靶基因序列或其互補(bǔ)序列基本上同一。在這一方面，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可知在其包含由基因組靶基因衍生的外顯子序列串聯(lián)陣列或串聯(lián)體的情況下，cDNA分子也可以視為本發(fā)明上下文中的多結(jié)構(gòu)基因序列。因此，cDNA分子和外顯子序列和/或內(nèi)含子序列和/或5’-非翻譯和/或3’-非翻譯序列的任何串聯(lián)陣列、串聯(lián)重復(fù)或串聯(lián)體顯然包含于本發(fā)明的這一實(shí)施方案中。
優(yōu)選地，所述的多核苷酸序列包含至少2-8個(gè)單個(gè)的結(jié)構(gòu)基因序列，更優(yōu)選至少約2-6個(gè)單個(gè)的結(jié)構(gòu)基因序列，更優(yōu)選至少約2-4個(gè)單個(gè)的結(jié)構(gòu)基因序列。
可以包含在本發(fā)明的合成基因中的結(jié)構(gòu)基因序列的理想數(shù)目根據(jù)每一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的長(zhǎng)度，它們的方向和彼此之間的同一性程度可以有相當(dāng)?shù)淖兓＠?，本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知回文核苷酸序列在體內(nèi)固有的不穩(wěn)定性和構(gòu)建包含倒轉(zhuǎn)重復(fù)核苷酸序列的長(zhǎng)合成基因的困難，因?yàn)樯鲜鲂蛄杏行纬砂l(fā)夾環(huán)的傾向并且在體內(nèi)可發(fā)生重組。
盡管存在上述的困難但可以包含在本發(fā)明的合成基因中的結(jié)構(gòu)基因序列的理想數(shù)目仍可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)，在無需過量實(shí)驗(yàn)的情況下通過標(biāo)準(zhǔn)方法而確定，如用重組酶缺陷的細(xì)胞系構(gòu)建本發(fā)明的合成基因，減少重復(fù)序列的數(shù)目以排除或使重組事件最小化，維持多結(jié)構(gòu)基因序列的長(zhǎng)度到可接受的程度，優(yōu)選不多于5-10kb，更優(yōu)選不多于2-5kb，更優(yōu)選不多于0.5-2.0kb的長(zhǎng)度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，包括含有義核苷酸序列的合成基因的遺傳構(gòu)建體的作用是在基本上不降低靶基因轉(zhuǎn)錄水平的情況下減少轉(zhuǎn)錄本翻譯成蛋白產(chǎn)物?；蛘呋蛄硗?，所述的包含合成基因的遺傳構(gòu)建體基本上不導(dǎo)致總的RNA穩(wěn)定水平的下降。
因此本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案提供一種遺傳構(gòu)建體，其包含
(i)與脊椎動(dòng)物基因組中的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；
(ii)與(i)中所定義的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；
(iii)分隔(i)和(ii)中所述核苷酸序列的內(nèi)含子序列；
其中，當(dāng)將所述的構(gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力，并且含有所述內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有降低和/或由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因所轉(zhuǎn)錄的總RNA水平基本上沒有下降。
優(yōu)選地，所述的動(dòng)物細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如但并不限于人或鼠科動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步延及經(jīng)過遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，所述細(xì)胞的特征在于
(i)包含導(dǎo)入所述細(xì)胞或其親本細(xì)胞的靶內(nèi)源核苷酸序列的有義拷貝；和
(ii)與未經(jīng)遺傳修飾的相同細(xì)胞相比，基本上沒有由包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因編碼的蛋白產(chǎn)物。
這一實(shí)施方案中的脊椎動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚類或爬行動(dòng)物。更優(yōu)選地，所述的動(dòng)物細(xì)胞來源于哺乳動(dòng)物如人，靈長(zhǎng)類，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。特別優(yōu)選所述的動(dòng)物細(xì)胞來源于人和鼠科動(dòng)物。
所述的包含上述靶內(nèi)源核苷酸序列有義拷貝的核苷酸序列可以進(jìn)一步包含互補(bǔ)于所述靶序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述的同一且互補(bǔ)的序列由內(nèi)含子序列，如來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子(例如人β-珠蛋白內(nèi)含子2)所分隔。
而且在一個(gè)實(shí)施方案中，導(dǎo)入含有所述靶序列有義拷貝的核苷酸序列的結(jié)果沒有使穩(wěn)定狀態(tài)的總RNA的水平降低。
由此，本發(fā)明提供經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，該細(xì)胞的特征在于
(i)包含導(dǎo)入所述細(xì)胞或其親本細(xì)胞的靶內(nèi)源核苷酸序列的有義拷貝；
(ii)與未經(jīng)遺傳修飾的相同細(xì)胞相比，基本上沒有由包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因編碼的蛋白產(chǎn)物；和
(iii)與未經(jīng)遺傳修飾的相同細(xì)胞相比，穩(wěn)定狀態(tài)的總RNA的水平基本上沒有降低。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因的包括遺傳修飾的表現(xiàn)以轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的基因序列為特征的經(jīng)修飾表型的動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)胞系。
據(jù)此，本發(fā)明的另一方面涉及分離形式的或在體外培養(yǎng)條件下維持的動(dòng)物細(xì)胞或含有所述細(xì)胞的動(dòng)物，其中所述的細(xì)胞或動(dòng)物宿主與經(jīng)遺傳操作前的細(xì)胞或動(dòng)物相比表現(xiàn)至少一種改變了的表型，所述的遺傳操作包含向所述的動(dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)入含與所述動(dòng)物細(xì)胞基因組中的靶核苷酸序列基本同源的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體，并且其中所述的靶核苷酸序列的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平被調(diào)節(jié)。
優(yōu)選地，所述的遺傳構(gòu)建體上的核苷酸序列可操作地與啟動(dòng)子相連接。
可選擇地，所述的遺傳構(gòu)建體可以包含兩個(gè)或更多的核苷酸序列，每一核苷酸序列可操作地與一個(gè)或更多的啟動(dòng)子相連接，且每一核苷酸序列與內(nèi)源哺乳動(dòng)物核苷酸序列具有同源性。
本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物，其包含具有如下特征的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞，這些細(xì)胞中內(nèi)源基因基本上轉(zhuǎn)錄了但并不翻譯進(jìn)而導(dǎo)致與經(jīng)遺傳操作前的動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞相比出現(xiàn)了經(jīng)修飾的表型。
本發(fā)明的又一方面提供一種經(jīng)遺傳修飾的含有與鼠科動(dòng)物細(xì)胞基因組中的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列的鼠科動(dòng)物，其中由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
優(yōu)選的鼠科動(dòng)物是小鼠且在作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型以檢驗(yàn)治療方法或篩選治療試劑中尤其有用。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物進(jìn)一步包括與靶內(nèi)源序列互補(bǔ)的序列。一般所述的同一和互補(bǔ)序列可由如上所述的內(nèi)含子序列所分隔。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及改變脊椎動(dòng)物細(xì)胞表型的方法，其中所述的表型是由內(nèi)源基因的表達(dá)所賦予或促進(jìn)的，該方法包括向所述的細(xì)胞或其親本細(xì)胞中導(dǎo)入遺傳構(gòu)建體，其中所述的遺傳構(gòu)建體包括與含有所述內(nèi)源基因或其部分序列的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列，與未經(jīng)導(dǎo)入所述遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
此處所涉及同源性包括基本上的同源性，尤其是實(shí)質(zhì)性的核苷酸相似性，更優(yōu)選核苷酸同一性。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“相似性”包括相比較的序列間在核苷酸水平上的精確同一。當(dāng)在核苷酸水平上存在非同一，“相似性”包括序列間的不同，其產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)，功能，生化和/或構(gòu)象水平上相關(guān)的不同氨基酸。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的核苷酸序列對(duì)比是在同一性水平而非相似性水平上進(jìn)行的。
用于表示兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸之間序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“參比序列”，“對(duì)比窗”，“序列相似性”，“序列同一性”，“序列相似性百分?jǐn)?shù)”，“序列同一性百分?jǐn)?shù)”“基本相似”和“基本同一性”?！皡⒈刃蛄小笔情L(zhǎng)至少12個(gè)但常是15到18個(gè)經(jīng)常是至少25個(gè)或更多，如30個(gè)單體單元(包括端點(diǎn))的核苷酸。由于兩個(gè)多核苷酸每一個(gè)可以含有(1)在兩個(gè)多核苷酸序列間相似的序列(即全部多核苷酸序列的一部分)和(2)在兩多核苷酸之間有差異的序列，兩個(gè)(或更多)多核苷酸之間的序列比較可通過比較“對(duì)比窗”中的兩個(gè)多核苷酸序列進(jìn)行以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似?！皩?duì)比窗”是指與參比序列相比的典型為12個(gè)連續(xù)殘基的概念片段。為進(jìn)行理想的對(duì)比，與參比序列(其不包含添加或缺失)相比所述的對(duì)比窗可以包含約20％或更少的添加或缺失(即gap)。為對(duì)齊對(duì)比窗進(jìn)行的最佳對(duì)比可以通過計(jì)算機(jī)程序化的算法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，見the WisconsinGenetics Software Package Release 7.0，Genetics ComputerGroup，575 Science Drive Madison，WI，USA)或目測(cè)進(jìn)行，所述的最佳對(duì)比(即產(chǎn)生對(duì)比窗內(nèi)最高百分同源性)可有所選擇的任何方法產(chǎn)生。參見例如Altschul等(1997)所公開的BLAST系列的程序。有關(guān)序列分析的詳細(xì)討論可參見Ausubel等(1998)中的Unit 19.3。
所用的術(shù)語(yǔ)“序列相似性”和“序列同一性”指在通過對(duì)比窗比較中基于核苷酸對(duì)核苷酸的序列同一或功能或結(jié)構(gòu)相似性程度。因此“百分序列同一性”例如是通過下述方式計(jì)算出來的由對(duì)比窗比較兩個(gè)理想對(duì)比的序列，確定在兩序列中均出現(xiàn)同一的核酸堿基(如A，T，C，G，I)的位置的數(shù)目以獲得匹配位置的數(shù)目，用對(duì)比窗中總的位置數(shù)(即窗的大小)除匹配的位置數(shù)，所得結(jié)果乘以100以獲得序列同一性百分?jǐn)?shù)。為本發(fā)明的目的，“序列同一性”可以理解為是由計(jì)算機(jī)程序DNASIS(Version 2.5 for windows；購(gòu)自Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA)用該軟件所附帶的參考手冊(cè)中的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值計(jì)算出的“匹配百分?jǐn)?shù)”。類似的注解也使用于序列相似性。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體在產(chǎn)生動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用，在上述的動(dòng)物細(xì)胞中由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
優(yōu)選地，所述脊椎動(dòng)物細(xì)胞如上述定義，最優(yōu)選的是人和鼠科動(dòng)物。
所述的構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括與所述的靶內(nèi)源核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，且與所述靶內(nèi)源核酸序列同一或互補(bǔ)的核苷酸序列可由上述的內(nèi)含子序列所分隔。
在一個(gè)實(shí)施方案中，含有內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有下降和/或穩(wěn)定狀態(tài)的總RNA的水平基本上沒有下降。
本發(fā)明的再一方面涉及在脊椎動(dòng)物中進(jìn)行遺傳治療的方法，所述的方法包括向所述動(dòng)物細(xì)胞中引入含有與所述動(dòng)物細(xì)胞基因組中的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列，以使得在引入所述的核苷酸序列后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
此處所涉及的“遺傳治療”包括基因治療。包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的遺傳治療進(jìn)一步包括體細(xì)胞基因治療，其是通過分離細(xì)胞，經(jīng)遺傳修飾后再放回個(gè)體中進(jìn)行的。
優(yōu)選地，所述的動(dòng)物是人。
本發(fā)明通過下述非限定性的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。
實(shí)施例1
組織培養(yǎng)操作
為產(chǎn)生表達(dá)GFP的細(xì)胞系，用設(shè)計(jì)為表達(dá)GFP的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化PK-1細(xì)胞(來自豬腎上皮細(xì)胞)，所述構(gòu)建體即pEGFP-N1(ClontechCatalogue No.6085-1；參見圖1)。
PK-1細(xì)胞用添加10％v/v胎牛血清(FBS；TRACE Biosciences或Life Technologies)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM；Life Technologies)培養(yǎng)生長(zhǎng)成為粘附單層細(xì)胞。細(xì)胞一直在37℃下空氣中含5％v/v CO2的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。依實(shí)驗(yàn)要求細(xì)胞可在多種組織培養(yǎng)容器中生長(zhǎng)。所用的容器96-孔組織培養(yǎng)板(容器包括96個(gè)相分離的組織培養(yǎng)孔，每孔直徑約為0.7cm；Costar)；48-孔組織培養(yǎng)板(容器包括48個(gè)相分離的組織培養(yǎng)孔，每孔直徑約為1.2cm；Costar)；6-孔組織培養(yǎng)板(容器包括6個(gè)相分離的組織培養(yǎng)孔，每孔直徑約為3.8cm；Nunc)；或大的T25和T75培養(yǎng)瓶(Nunc)。對(duì)于用pEGFP-N1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，DMEM，10％(v/v)FBS培養(yǎng)基進(jìn)一步添加了遺傳霉素(Life Technologies)；對(duì)于初步篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使用1.5mg/l遺傳霉素。對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)可使用1.0mg/l的遺傳霉素。
所有的情況下均每隔48-72hr(小時(shí))更換培養(yǎng)基。這是通過下述方式進(jìn)行的去除已用過的培養(yǎng)基，通過添加磷酸鹽緩沖液(1×PBS；Sigma)并輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)容器以洗滌組織培養(yǎng)容器中的單層細(xì)胞，去除所述的1×PBS緩沖液，添加新鮮的培養(yǎng)基。在這些操作中所用的1×PBS的體積為針對(duì)96-孔，48-孔，6-孔，T25和T75培養(yǎng)瓶分別為100μl，400μl，1ml，2ml和5ml。組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基的體積典型地，對(duì)96-孔組織培養(yǎng)板為200μl，對(duì)48-孔組織培養(yǎng)板為0.4ml，對(duì)6-孔組織培養(yǎng)板為4ml，對(duì)T25和T75培養(yǎng)瓶分別為11ml和40ml。
在這些實(shí)驗(yàn)過程中，經(jīng)常需要更換培養(yǎng)容器。為此，用1×PBS洗單細(xì)胞層兩次，然后用胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)在37℃下處理5min。在這些條件下細(xì)胞失去粘著性，能夠通過研磨(trituration)重懸，并轉(zhuǎn)移到可阻止胰蛋白酶-EDTA作用的DMEM，10％v/v FBS中。洗滌用1×PBS的體積和用于上述操作的胰蛋白酶-EDTA針對(duì)96-孔，48-孔，6-孔，T25和T75培養(yǎng)瓶典型地分別為100μl，400μl，1ml，2ml和5ml。
另外，有時(shí)需要給重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)，特別是當(dāng)生物克隆轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系時(shí)。為此，細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的DMEM，10％v/v FBS中，將典型的100μl的小份轉(zhuǎn)移到血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Hawksley)，并通過顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。冷凍細(xì)胞的方法
在這些實(shí)驗(yàn)中，時(shí)常需要貯存PK-1細(xì)胞系以備后面使用。為此，用1×PBS洗單層細(xì)胞兩次，然后用胰蛋白酶-EDTA在37℃下處理5min。所述的PK-1通過研磨重懸并轉(zhuǎn)移到由DMEM，20％v/v FBS和10％v/v二甲基亞砜(Sigma)組成的貯存培養(yǎng)基中。所述的PK-1細(xì)胞的濃度通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定并進(jìn)一步稀釋到105細(xì)胞ml。將小份的PK-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5ml的cryotubes(Nunc)中。所述的PK-1細(xì)胞管置于含2-丙醇(BDH)的Cryo 1℃冷凍容器中(Nalgene)并緩慢冷卻至-70℃。將上述PK-1細(xì)胞管于-70℃貯存。可通過在冰上使所述細(xì)胞升溫到0℃使貯存的PK-1細(xì)胞復(fù)蘇。將所述的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含DMEM和20％v/v FBS的T25培養(yǎng)瓶中，并在37℃條件下含有5％v/vCO2的空氣中培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分列表
(a)Dulbecco’s修飾的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)
兩個(gè)所使用的DMEM可商購(gòu)配方，均由Life Technologies獲得。第一個(gè)是液體配方(Cat.no.11995)，第二個(gè)是粉末配方，其依照制造商提供的方法配置(Cat.no.23700)。兩配方均在這些實(shí)驗(yàn)中使用，除了微小的修改外可將它們視為等同物。所述的液體配方(11995)是
D-葡萄糖 4,500mg/l
酚紅 15mg/l
丙酮酸鈉 110mg/l
L-精氨酸.HCl 84mg/l
L-胱氨酸.2HCl 63mg/l
L-谷氨酰胺584mg/l
甘氨酸30mg/l
L-組氨酸HCl.H2O 42mg/l
L-異亮氨酸105mg/l
L-亮氨酸 105mg/l
L-賴氨酸.HCl 146mg/l
L-甲硫氨酸30mg/l
L-苯丙氨酸66mg/l
L-絲氨酸 42mg/l
L-蘇氨酸 95mg/l
L-色氨酸 16mg/l
L-酪氨酸.2Na.2H2O104mg/l
L-纈氨酸 94mg/l
CaCl2200mg/l
Fe(NO3)3.9H2O 0.1mg/l
KCl 400mg/l
MgSO497.67mg/l
NaCl 6,400mg/l
NaHCO3 3,700mg/l
NaH2PO4.H2O 125mg/l
D-泛酸鈣 4mg/l
氯化膽堿 4mg/l
葉酸 4mg/l
i-肌醇7.2mg/l
尼克酰胺 4mg/l
核黃素0.4mg/l
硫胺素HCl 4mg/l
維生素B6 HCl 4mg/l
當(dāng)重新配置時(shí)，除下述修改外，粉末配方(23700)與上述一致，所述修改之處在于含4,750mg HEPES，而不含丙酮酸鈉和NaHCO3，NaCl的用量為4,750mg/l，而不是6,400mg/l。
(b)OPTI-MEMI(注冊(cè)商標(biāo))降低血清培養(yǎng)基
這是一種可商購(gòu)的MEM修飾培養(yǎng)基(Life Technologies Cat.No.31985)，設(shè)計(jì)該培養(yǎng)基是使得細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這種無血清培養(yǎng)基常在應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染子如GenePORTER2(商標(biāo))或LIPOFECTAMINE(商標(biāo))獲得高轉(zhuǎn)染頻率的時(shí)候使用。
(c)磷酸鹽緩沖液(PBS)
磷酸鹽緩沖液是由可商購(gòu)的粉末混合物(Sigma，Cat.No.P-3813)依制造商提供的方法制備的。1×PBS溶液(pH7.4)由下述組分組成
Na2HPO4 10mM
KH2PO4 1.8mM
NaCl 138mM
KCl2.7mM
(d)胰蛋白酶-EDTA
胰蛋白酶-EDTA通常用于分散粘著性細(xì)胞使其傳代。在這些實(shí)驗(yàn)中使用了一種可商購(gòu)的制劑(Life Technologies，Cat.No.15400)。這種10×貯液由下述組分組成
胰蛋白酶 5g/l
EDTA.4Na2g/l
NaCl8.5g/l
用9倍體積的1×PBS稀釋上述貯液以制備工作用溶液。
實(shí)施例2
穩(wěn)定的EGFP-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的產(chǎn)生
轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。每孔接種于2ml DMEM，10％v/vFBS中的1×103 PK-1細(xì)胞，培養(yǎng)至單層細(xì)胞鋪滿達(dá)60-90％，典型地需24到48hr。轉(zhuǎn)化一個(gè)板(6孔)需將12μg質(zhì)粒pEGFP-Nl和108μlGenePORTER2(商標(biāo))(基因治療系統(tǒng))在OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基中稀釋至終體積6ml，再于室溫下培養(yǎng)45min。
去除每孔中的組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基后，用1ml 1×PBS如上所述對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行清洗。對(duì)于每個(gè)孔，所述的單層細(xì)胞用1ml質(zhì)粒DNA/GenePORTER結(jié)合物覆蓋并于37℃，5％v/v CO2條件下培養(yǎng)4.5hr。
向每孔中加入添加了20％v/v FBS的1ml OPTI-MEMI(注冊(cè)商標(biāo))，將所述容器繼續(xù)培養(yǎng)24hr，用1×PBS洗細(xì)胞并用2ml含10％v/v FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基更換用過的培養(yǎng)基。在這一階段可利用熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)GFP表達(dá)。
轉(zhuǎn)染后48hr去除培養(yǎng)基，如上所述用PBS洗細(xì)胞，并向每孔中加入含10％v/v FBS并添加了1.5mg/l遺傳霉素的4ml新鮮DMEM；培養(yǎng)基中添加遺傳霉素是為了挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。所述的DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遺傳霉素培養(yǎng)基每48-72hr更換一次。篩選了21天后，推定的轉(zhuǎn)化克隆清晰可見。在這一階段，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到更大的培養(yǎng)容器中以便于擴(kuò)增、培養(yǎng)和生物克隆。
為移出已轉(zhuǎn)化的克隆，如上述實(shí)施例1中所描述的將細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA處理后轉(zhuǎn)移到11ml DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遺傳霉素中用T25培養(yǎng)瓶于37℃ 5％v/v CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)這些單層細(xì)胞達(dá)90％鋪滿時(shí)，將其用胰蛋白酶-EDTA重懸，然后轉(zhuǎn)移到40ml DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遺傳霉素中。將盛有細(xì)胞的容器在37℃ 5％v/v CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)單層細(xì)胞鋪滿時(shí)每48-72hr如上所述通過用胰蛋白酶處理細(xì)胞使其傳代，并將1/10的細(xì)胞于40ml新鮮DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遺傳霉素中稀釋。同時(shí)將一些細(xì)胞冷凍以作長(zhǎng)期保存。這些培養(yǎng)物包含轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的混合物。
實(shí)施例3
轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的稀釋克隆
用稀釋策略將轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行生物克隆，由此以單細(xì)胞建立克隆。為支持單克隆的生長(zhǎng)，使用了“條件培養(yǎng)基”。條件培養(yǎng)基是通過用40ml含10％v/v FBS的DMEM覆蓋于T75培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)的達(dá)20-30％鋪滿的單層PK-1細(xì)胞而制備的。所述容器在37℃，5％v/v CO2下培養(yǎng)24hr，此后所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無菌的50ml管(Falcon)并500xg離心。將所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基通過0.45μm過濾器倒入一個(gè)新的無菌管中用作“條件培養(yǎng)基”。
含有轉(zhuǎn)化的達(dá)20-30％鋪滿的PK-1細(xì)胞混合克隆的T75培養(yǎng)瓶用1×PBS洗細(xì)胞，再用胰蛋白酶如上所述進(jìn)行處理，再用10ml DMEM，10％v/v FBS稀釋。所述細(xì)胞濃度用顯微鏡通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定，然后將細(xì)胞用條件培養(yǎng)基稀釋至10細(xì)胞每ml。在96-孔組織培養(yǎng)容器中每孔接種200μl用條件培養(yǎng)基稀釋后的細(xì)胞，將所述細(xì)胞在37℃ 5％v/v CO2下培養(yǎng)48hr。用顯微鏡觀察上述的孔，由單細(xì)胞產(chǎn)生的含單一克隆的那些定義為克隆細(xì)胞系。去除最初的條件培養(yǎng)基，加入200μl新鮮的條件培養(yǎng)基，并將所述細(xì)胞在37℃5％v/v CO2下培養(yǎng)48hr。此后，用200μl DMEM，10％v/v FBS和1.5mg/l遺傳霉素替換條件培養(yǎng)基，所述細(xì)胞繼續(xù)在37℃5％ v/v CO2下培養(yǎng)。使克隆擴(kuò)增，每48hr更換培養(yǎng)基。
當(dāng)每孔中的單層細(xì)胞達(dá)90％鋪滿時(shí)，所述的細(xì)胞用100μl 1×PBS洗滌，并通過20μl 1×PBS/1x胰蛋白酶-EDTA如上所述進(jìn)行處理分散細(xì)胞。一個(gè)孔中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含500μl DMEM，10％v/v FBS和1.5μg/ml遺傳霉素的48-孔培養(yǎng)容器的一個(gè)孔中。如上文所述每48-72hr更換一次培養(yǎng)基。
48-孔培養(yǎng)容器的一個(gè)孔中的細(xì)胞達(dá)90％鋪滿時(shí)，如上所述用胰蛋白酶-EDTA處理將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6-孔組織培養(yǎng)容器中。相互分離的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到4ml DMEM，10％ v/v FBS，1.5μg/ml遺傳霉素中并轉(zhuǎn)移到6-孔組織培養(yǎng)容器的一個(gè)孔中。細(xì)胞在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)使克隆擴(kuò)增。每48hr更換培養(yǎng)基。
當(dāng)6-孔培養(yǎng)容器中的單層細(xì)胞達(dá)90％鋪滿時(shí)，如上所述用胰蛋白酶-EDTA處理將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶中。當(dāng)這些單層細(xì)胞達(dá)90％鋪滿時(shí)，如上所述將其轉(zhuǎn)移到T75培養(yǎng)瓶中。當(dāng)在T75培養(yǎng)瓶中建立了單獨(dú)的細(xì)胞系后它們或可通過1/10稀釋每隔48-72hr傳代培養(yǎng)，或冷凍保存。
實(shí)施例4
用于連綴轉(zhuǎn)錄分析的核的制備
為分析已轉(zhuǎn)化的克隆細(xì)胞系中單基因轉(zhuǎn)錄的狀態(tài)，進(jìn)行了核連綴分析。用T75培養(yǎng)瓶向40ml DMEM，10％ v/v FBS中接種4×106轉(zhuǎn)化的PK-1細(xì)胞以建立單層細(xì)胞，培養(yǎng)所述細(xì)胞使其達(dá)到90％鋪滿。用5ml 1×PBS洗細(xì)胞，再用2ml胰蛋白酶-EDTA處理使細(xì)胞分離后轉(zhuǎn)移到含10％ v/v FBS的2ml DMEM中。
將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10ml加蓋的管中，加入3ml用冰冷卻的1×PBS將管中內(nèi)容倒轉(zhuǎn)混合。已轉(zhuǎn)化的PK-1細(xì)胞通過4℃下500xg離心收集棄上清，用3ml冰冷的1×PBS重懸并輕旋混合。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定總的細(xì)胞數(shù)；最多2×108細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
已轉(zhuǎn)化的PK-1細(xì)胞通過4℃下500xg離心收集，重懸于4ml蔗糖緩沖液1(0.3M蔗糖，3mM氯化鈣，2mM醋酸鎂，0.1mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM二硫蘇糖醇(DTT)，0.5％ v/vIgepal CA-630(Sigma))中。所述細(xì)胞在4℃下溫育5min使其裂解，然后用相差顯微鏡檢查小份的樣品。此種情況下可以觀察到裂解物。組織勻漿轉(zhuǎn)移到含4ml冰冷的蔗糖緩沖液2(1.8M蔗糖，5mM醋酸鎂，0.1mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM DTT)的50ml管中。
為獲得有效的連綴轉(zhuǎn)錄分析，需從細(xì)胞碎片中將核純化出來。純化核的一種方法是通過蔗糖襯墊進(jìn)行超離心。在細(xì)胞組織勻漿中的最終蔗糖濃度應(yīng)足以在組織勻漿和蔗糖墊間的界面阻擋大量碎片。因此添加到初始細(xì)胞組織勻漿中的蔗糖緩沖液2的量在一些情況下是變化的。
為制備蔗糖墊，4.4ml冰冷的蔗糖緩沖液2轉(zhuǎn)移到同質(zhì)異晶聚合物SW41管(Beckman)中。將核制品小心地鋪在所述的蔗糖墊上于4℃下30,000xg(13,300rpm用SW41轉(zhuǎn)子)離心45min。棄上清，輕輕渦旋5秒使成團(tuán)的核散開。每5×107核在200μl冰冷的甘油貯存緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 8.3)，40％v/v甘油，5mM氯化鎂，0.1mM EDTA)中研磨、重懸。100μl此種懸浮液(約2.5×107核)等分至預(yù)冷的微離心管中并添加1μL(40U)RNasin(Promega)。通常此種抽提物直接用于連綴轉(zhuǎn)錄分析，但也可以在-70℃的液氮中保存以備使用。
實(shí)施例5
核連綴轉(zhuǎn)錄分析
所有的NTP均購(gòu)自Roche。添加100μl 1mM ATP，1mM CTP，1mM GTP，5mM DTT和5μl(50μCi)[α32P]-UTP(GeneWorks)到100μl分離的核中，所述核的制備如上所述。所述的反應(yīng)混合物在30℃下振蕩溫育30min，添加400μl 4M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉(pH7.0)，100mM 2-巰基乙醇和0.5％ v/v N-月桂酰肌氨酸(溶液D)終止反應(yīng)。為在體外純化合成的RNA，60μl 2M醋酸鈉(pH 4.0)和600μl水飽和酚添加到反應(yīng)混合物中渦旋混合；添加120μl 氯仿/異戊醇(49∶1)渦旋混合，然后離心分相。
將水相移出至新管中，添加20μg tRNA作為載體。加入650μl異丙醇在-20℃下溫育10min沉淀RNA。在4℃下12,000rpm離心20min收集RNA，所得的顆粒狀物用冷的70％ v/v乙醇漂洗。將顆粒狀物溶解于30μl TE pH 7.3(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)，通過渦旋混合重懸上述顆粒狀物。向混合物中添加400μl溶液D，渦旋混合。通過添加430μl異丙醇沉淀RNA，在-20℃下放置10min，再在4℃下10,000g離心20min。棄上清，用70％ v/v乙醇漂洗RNA粒狀物。上述顆粒狀物用200μl 10mM Tris(pH 7.3)，1mM EDTA重懸，通過手提蓋革計(jì)數(shù)器估計(jì)摻入。
為制備用于雜交的放射性RNA，通過添加20μl 3M醋酸鈉pH5.2,500μl乙醇沉淀樣品，在4℃下12,000xg離心20收集樣品。棄上清，用1.5ml雜交緩沖液(MRC#；HS 114F，MolecularResearch Centre Inc.)重懸。
實(shí)施例6
斑點(diǎn)印跡濾膜的制備
制備斑點(diǎn)印跡濾膜以檢測(cè)如上述制備的32P-標(biāo)記的新生mRNA轉(zhuǎn)錄本。為分析每-PK-1細(xì)胞系制備一種Hybond NX濾膜(Amersham)。所制備的每種濾膜包含四種經(jīng)連續(xù)1/5稀釋的質(zhì)粒。所述的質(zhì)粒是pBluescript(注冊(cè)商標(biāo))II SK+(Stratagene)，pGEM.Actin(昆士蘭大學(xué)微生物和寄生蟲學(xué)系)，pCMV.Galt，和pBluescript.EGFP。
質(zhì)粒pCMV.Galt是通過用豬α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)結(jié)構(gòu)基因序列替換pEGFP-N1(Clontech)的EGFP開放閱讀框而構(gòu)建的。用PinAI和Not I消化質(zhì)粒pEGFP-N1，用PfuI聚合酶形成鈍端，然后再連接以產(chǎn)生質(zhì)粒pCMV.cass。從pCDNA3.GalT(Bresagen)上切除含GalT結(jié)構(gòu)基因的EcoRI片段并將其連接到pCMV.cass的EcoRI位點(diǎn)。
質(zhì)粒pBluescript.EGFP是通過切除pEGFP-N1的EGFP開放閱讀框并將該片段連接到質(zhì)粒pBluescript(注冊(cè)商標(biāo))II SK+上而構(gòu)建的。用NotI和XhoI消化質(zhì)粒pEGFP-N1，再將NotI-EGFP-Xho片段連接到pBluescript II SK+的NotI和XHoI位點(diǎn)。
對(duì)每一構(gòu)建體，將10微克質(zhì)粒在200μl反應(yīng)體積中用EcoRI消化。所述的混合物用苯酚/氯仿/異戊醇抽提后再用氯仿/異戊醇抽提，再用乙醇沉淀。所述的質(zhì)粒DNA顆粒狀物懸浮于500μl 6×SSC(0.9M氯化鈉，90mM檸檬酸鈉；pH7.0)中，然后用6×SSC稀釋至濃度為1μg/50μl，200ng/50μl，40ng/50μl和8ng/50μl。將上述質(zhì)粒加熱至100℃ 10min然后在冰上冷卻。
將8×11.5cm的一張Hybond NX濾膜在6×SSC中浸泡30min。然后將所述的濾膜置于96-孔(3mm)斑點(diǎn)印跡裝置(LifeTechnologies)中真空固定。每槽中加入500μl 6×SSC，抽真空。保持真空狀態(tài)下，將每種質(zhì)粒DNA濃度的50μl質(zhì)粒以4×4矩陣加于濾膜上。在所述濾膜上復(fù)制6次。
在保持真空狀態(tài)下每槽加入250μl 6×SSC。解除真空狀態(tài)。將所述的濾膜在(DNA面朝上)用變性溶液(1.5M氯化鈉，0.5M氫氧化鈉)濕透的印跡紙上放置10min。然后將所述的濾膜轉(zhuǎn)移到用中和溶液濕透的印跡紙上在1M氯化鈉，0.5M Tris-HCl(pH7.0)中浸5min。
將所述濾膜置于GS Gene Linker(Bio Rad)用150m焦耳的能量使質(zhì)粒DNA交聯(lián)到濾膜上。用無菌水漂洗濾膜。為檢查印跡操作是否成功將所述濾膜，用在300mM含0.4％ v/v亞甲基藍(lán)的醋酸鈉(pH5.2)染色5min。將所述的濾膜用無菌水漂洗兩次后，用40％ v/v乙醇脫色。再用無菌水漂洗濾膜以去除乙醇，然后將濾膜切成6個(gè)四-質(zhì)粒/濃度矩陣塊。
實(shí)施例7
核轉(zhuǎn)錄本的濾膜雜交
斑點(diǎn)印跡或Southern印跡濾膜轉(zhuǎn)移到10ml MacCartney瓶中，每瓶加入2ml預(yù)雜交液(Molecular Research Centre Inc.#；WP117)。將濾膜置于培養(yǎng)箱中在42℃下輕輕旋轉(zhuǎn)溫育過夜(Hybaid)。
去除所述的預(yù)雜交緩沖液，添加1.5ml含如實(shí)施例5和6中所述的32P-標(biāo)記的新生RNA的雜交緩沖液(MRC #HS 114F，MolecularResearch Centre Inc.)，將此探針和濾膜在42℃下雜交48hr。
雜交后，去除放射性標(biāo)記的雜交緩沖液，用洗滌溶液(MRC#WP117)清洗濾膜?？偣哺鼡Q5次清洗溶液洗濾膜，每次使用2ml。上述清洗在雜交箱中進(jìn)行；頭三次在30℃下進(jìn)行，后兩次在50℃下進(jìn)行。
為進(jìn)一步提高嚴(yán)謹(jǐn)度降低背景，用RNase A處理濾膜。將濾膜置于5ml 10μg/ml RNase A(Sigma)，10mM Tris(pH7.5)，50mM NaCl中在37℃下溫育5min。
將濾膜卷于塑料套中暴露于X-光片下。
實(shí)施例8
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的共抑制EGFP
檢測(cè)了6個(gè)PK-1細(xì)胞系。這6個(gè)細(xì)胞系由一個(gè)未轉(zhuǎn)化的對(duì)照細(xì)胞系(野生型)和五個(gè)用pCMV.EGFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系(參見實(shí)施例1)組成。通過顯微鏡在UV光下觀察，這5個(gè)細(xì)胞系中的兩個(gè)是EGFP表達(dá)陽(yáng)性。所有來自A4g系的單層細(xì)胞都是EGFP表達(dá)陽(yáng)性，而來自A7g系的單層細(xì)胞只有約0.1％是EGFP陽(yáng)性。觀察到所余的C3，C8，和C10系是EGFP表達(dá)陰性的。
如上述實(shí)施例4到7所述進(jìn)行核連綴轉(zhuǎn)錄分析。在標(biāo)記產(chǎn)物的膜雜交分析四種質(zhì)粒的四種濃度結(jié)果可達(dá)到兩個(gè)目的。所述的四種濃度具體地表示檢測(cè)靶mRNA所需的靶質(zhì)粒最低濃度。所述的四種質(zhì)粒作為所述實(shí)驗(yàn)的特定靶和對(duì)照。所述質(zhì)粒所起的功能如下。
pBluescript II SK+
這一質(zhì)粒用于檢測(cè)合成的核RNA與所用的所有靶構(gòu)建體所共同的質(zhì)粒骨架的非特異性雜交。
pBluescript.EGFP
這一質(zhì)粒是32P-標(biāo)記的核EGFP RNA的靶。與該質(zhì)粒雜交指示有效的EGFP RNA轉(zhuǎn)錄。這在A4g，A7g，C3和C8系中很明顯，但在C10系中不明顯。
pCMV.GalT
GalT(α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)是一種豬內(nèi)源基因。這一質(zhì)粒由此作為豬內(nèi)源基因的陽(yáng)性對(duì)照。
pGem.Actin
β-肌動(dòng)蛋白是一種普遍存在的真核基因和共有mRNA種。這一質(zhì)粒含有雞β-肌動(dòng)蛋白cDNA序列，作為附加的陽(yáng)性對(duì)照。
根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以得出如下結(jié)論
(1)沒有出現(xiàn)與這些構(gòu)建體質(zhì)粒骨架的非特異性雜交。與所預(yù)期的一致由于這一基因的mRNA并不充足，所有的細(xì)胞系均未出現(xiàn)與GalT陽(yáng)性對(duì)照的雜交。
(2)與所預(yù)期的一致，由于這一基因的mRNA豐富，所有的細(xì)胞系均出現(xiàn)與β-肌動(dòng)蛋白基因陽(yáng)性對(duì)照的雜交。
(3)A4g和A7g系的新生RNA與EGFP雜交與所預(yù)期的一致，這是基于觀察到在這些細(xì)胞系中EGFP表達(dá)的結(jié)果。
(4)沉默的C3和C8系的新生RNA與EGFP雜交表明在這些細(xì)胞系的正常生長(zhǎng)條件下EGFP轉(zhuǎn)錄本的共抑制。
(5)C10系的共抑制活性沒有在這一實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出來。
表1總結(jié)了32P-標(biāo)記的核RNA與上述質(zhì)粒雜交的預(yù)期結(jié)果和所觀察到的結(jié)果。表1也表明了觀察到與特異核RNA雜交的靶質(zhì)粒DNA的最小濃度。
表1
EGFP Express-EGFP表達(dá)
Exp＝PTGS的預(yù)期結(jié)果
Obs＝所觀察到的結(jié)果
Hyb’n＝雜交
實(shí)施例9
基因的共抑制
本發(fā)明人證明了在所培養(yǎng)的豬腎細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因，增強(qiáng)的綠熒光蛋白(EGFP)的共抑制。本發(fā)明人進(jìn)一步證明了在不同細(xì)胞類型中更廣泛的內(nèi)源基因和主體如病毒，癌和移植抗原的共抑制。特定的靶包括
(a)牛腸道病毒(BEV)。在被BEV攻擊前冷凍的BEV-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系復(fù)蘇并可傳代幾周/月。有效地共抑制的細(xì)胞不會(huì)立即被病毒殺死。這一耐病毒的表型提供了一種有用的示范。
(b)酪氨酸酶，一種皮膚黑色素(黑色)形成所必需的基因的產(chǎn)物。酪氨酸酶基因的沉默易于從所培養(yǎng)的小鼠黑素細(xì)胞中檢測(cè)到，并在隨后的黑色小鼠株中檢測(cè)到。
(c)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)。盡管GalT本身對(duì)于細(xì)胞存活并非至關(guān)重要，GalT基因的沉默伴隨細(xì)胞死亡。本發(fā)明人推測(cè)細(xì)胞死亡是由于GalT是某DNA家族的成員之一，該家族成員共有某種反應(yīng)相似功能(糖基轉(zhuǎn)移)的相似的DNA序列。這些基因中的一些可能對(duì)于細(xì)胞存活至關(guān)重要。本發(fā)明人用GalT基因的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)而非全基因轉(zhuǎn)化豬細(xì)胞以靶向GalT降解所獨(dú)有的節(jié)段，由此僅GalT沉默了。
(d)胸苷激酶(TK)將胸苷轉(zhuǎn)變?yōu)樾剀諉瘟姿?TMP)。藥物5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)篩選已失去TK的細(xì)胞。在含有功能的TK的細(xì)胞中，所述的酶將該藥物類似物轉(zhuǎn)換其相應(yīng)的5’-單磷酸，一旦其整合到DNA中將具有致命性。用含有TK基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化NIH/3T3細(xì)胞。有效地共抑制的細(xì)胞可以耐受添加到培養(yǎng)基中的BrdU并繼續(xù)復(fù)制。
(e)細(xì)胞致癌基因如HER-2或Brn-2，與正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞相關(guān)。
(f)在人和/或小鼠造血(″血液形成″)細(xì)胞系上的細(xì)胞表面抗原。這些細(xì)胞是白細(xì)胞的前體，負(fù)責(zé)免疫；其特征在于對(duì)其免疫功能至關(guān)重要的特定表面抗原。這一系統(tǒng)特有的好處在于細(xì)胞懸浮(而非彼此粘附或附著于培養(yǎng)容器上)生長(zhǎng)所以容易通過顯微鏡檢測(cè)并通過熒光激活細(xì)胞分選儀定量。另外，可以得到大量的鑒定特定抗原的試劑。
(g)酪氨酸酶，在小鼠黑素細(xì)胞中對(duì)黑色素的產(chǎn)生至關(guān)重要的產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)基因小鼠中內(nèi)源酪氨酸酶的失活可以通過在正常情況下產(chǎn)生黑色素的動(dòng)物種的毛色變化容易地檢測(cè)出來。這一表型提供了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有用示范。
(h)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)催化將半乳糖殘基添加到細(xì)胞表面蛋白上。在轉(zhuǎn)基因小鼠中可以通過分析轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織是否失去了半乳糖殘基而容易地檢測(cè)出來，并為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供了有用的示范。
(i)YB-1(Y-框DNA/RNA-結(jié)合因子1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其主要結(jié)合于p53基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并由此抑制其表達(dá)。在以正常水平表達(dá)正常的p53蛋白的癌細(xì)胞(所有人癌癥的50％)中p53的表達(dá)受控于YB-1，因此YB-1的沉默導(dǎo)致p53蛋白水平的提高和此后的細(xì)胞程序性死亡。
實(shí)施例10
一般技術(shù)
1.組織培養(yǎng)操作
(a)粘著性細(xì)胞系
粘著性單層細(xì)胞的生長(zhǎng)，維持和計(jì)數(shù)如實(shí)施例1中所述。生長(zhǎng)培養(yǎng)基或由添加了10％ v/v FBS的DMEM組成，或由添加了10％ v/v FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(Life Technologies)組成。細(xì)胞一直在37℃并含5％ v/v CO2的空氣中生長(zhǎng)。
在這些實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常需要單層細(xì)胞的傳代。為此，用1×PBS洗單細(xì)胞層兩次，然后用胰蛋白酶-EDTA在37℃下處理5min。用于上述操作的胰蛋白酶-EDTA針對(duì)96-孔，48-孔，6-孔，T25和T75培養(yǎng)瓶典型地分別為20μl，100μl，500μl，1ml和2ml。用等體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基終止胰蛋白酶-EDTA的作用。所述細(xì)胞通過研磨懸浮。1/5體積的細(xì)胞選液轉(zhuǎn)移到新的含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的容器中。組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的體積典型地為，對(duì)96-孔組織培養(yǎng)板，192μl，對(duì)48-孔組織培養(yǎng)板960μl，對(duì)6-孔組織培養(yǎng)板3.8ml，對(duì)T25和T75培養(yǎng)瓶分別為9.6ml和39.2ml。
細(xì)胞懸液的計(jì)數(shù)如上述的實(shí)施例1中所述。
(b)非粘著性細(xì)胞
非粘著性細(xì)胞在與粘著性細(xì)胞類似的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
與粘著單層細(xì)胞一樣，需要經(jīng)常更換組織培養(yǎng)容器。對(duì)于T25和T75培養(yǎng)瓶，將所述的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml無菌塑料管(Falcon)在4℃下以500xg離心5min。棄上清將細(xì)胞的顆粒狀物懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。將上述細(xì)胞懸液置于新的組織培養(yǎng)容器中。對(duì)96-孔，48-孔，和6-孔容器，將所述容器在4℃下以500xg離心5min。將細(xì)胞顆粒狀物上的上清液吸出棄去，將細(xì)胞懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然后將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的組織培養(yǎng)容器。組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的體積典型地為，對(duì)96-孔組織培養(yǎng)板，200μl，對(duì)48-孔組織培養(yǎng)板400μl，對(duì)6-孔組織培養(yǎng)板4ml，對(duì)T25和T75培養(yǎng)瓶分別為11ml和40ml。
以下述方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸液的傳代。將所細(xì)胞在4℃下以500xg離心5min，然后懸浮于5ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。0.5ml(T25)或1.0ml(T75)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的新的容器中。對(duì)96-孔，48-孔，和6-孔板中的細(xì)胞，1/5體積的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有4/5生長(zhǎng)培養(yǎng)基的相應(yīng)孔中。
細(xì)胞計(jì)數(shù)如上述對(duì)粘著性細(xì)胞的描述。
2.冷凍細(xì)胞的方法
如實(shí)施例1的方法中所述儲(chǔ)存以備后用的細(xì)胞被冷凍。將粘著性細(xì)胞用1×PBS洗單細(xì)胞層兩次，然后用胰蛋白酶-EDTA(LifeTechnologies)在37℃下處理5min。非粘著性細(xì)胞在4℃下以500xg離心5min所述細(xì)胞通過研磨懸浮并轉(zhuǎn)移到由添加了20％v/v FBS和10％v/v二甲亞砜(Sigma)的DMEM RPMI 1640貯存培養(yǎng)基中。
3.細(xì)胞系的克隆
用帶有靶向特定感興趣的基因的表達(dá)構(gòu)建體的特定質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染粘著和非粘著類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用添加了遺傳霉素或嘌呤霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(或是DMEM，10％v/v FBS或RPMI 1640，10％ v/v FBS)經(jīng)過2-3的時(shí)間選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化克隆?？寺为?dú)的克隆以建立新轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
(a)粘著性細(xì)胞
與實(shí)施例3中所述的稀釋克隆的方法相反，在下述使用粘著性細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，如下所述由分散的集落克隆單獨(dú)的細(xì)胞系。首先從6-孔組織培養(yǎng)容器的各個(gè)孔中去除培養(yǎng)基，然后將所述的細(xì)胞集落用2ml 1×PBS洗兩遍。接下來，用無菌的塑料吸頭將單集落從塑料培養(yǎng)容器中分離出來，轉(zhuǎn)移到含200μl添加了遺傳霉素或嘌呤霉素的條件培養(yǎng)基的96-孔板(參見實(shí)施例1)。所述的容器在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)約72hr。對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行生長(zhǎng)克隆的顯微鏡檢并更換新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。當(dāng)每一穩(wěn)定的單層細(xì)胞達(dá)約90％鋪滿時(shí)，即如上所述進(jìn)行如上所述的連續(xù)步驟直至穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化系貯藏于T25培養(yǎng)瓶。此時(shí)，每一穩(wěn)定的細(xì)胞系小份進(jìn)行冷凍以備長(zhǎng)期保存。
(b)非-粘著性細(xì)胞
非-粘著性細(xì)胞如實(shí)施例3所述用稀釋克隆法克隆。
4.細(xì)胞核分離方法
(a)粘著性細(xì)胞
向含30ml含10％ v/v FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM或RPMI 1640)的100mm培養(yǎng)皿(Costar)或T75培養(yǎng)瓶中接種4×106細(xì)胞并在37℃5％ v/v CO2條件下培養(yǎng)至單層細(xì)胞達(dá)約90％鋪滿(過夜)。所述的含單層細(xì)胞的培養(yǎng)皿在進(jìn)行操作前置于冰床上冷卻。
倒出培養(yǎng)基向培養(yǎng)皿中添加8ml 1×PBS(冰冷的)，輕搖培養(yǎng)皿清洗所述的組織單層細(xì)胞。倒出所述的PBS重復(fù)清洗。
所述的組織單層細(xì)胞用4ml冰冷的蔗糖緩沖液A
覆蓋在冰上孵育2min裂解細(xì)胞。
用細(xì)胞刮刀將粘著性細(xì)胞打散并用相差顯微鏡觀察小份的細(xì)胞。如果細(xì)胞沒有裂解則將其轉(zhuǎn)移到冰冷的杜恩斯(dounce)勻漿器(Braun)用S型槌以5-10沖程使之破裂。有時(shí)還需要更多沖程。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鏡檢以證明核與胞質(zhì)碎片相分離。然后向培養(yǎng)皿中添加冰冷的蔗糖緩沖液B[1.7M蔗糖；5.0mM醋酸鎂；0.1mM EDTA；1.0mM DTT.10mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM PMSF](4ml)然后用細(xì)胞刮刀輕絞緩沖液。細(xì)胞組織勻漿中的蔗糖終濃度應(yīng)足以阻止大部分碎片在組織勻漿和蔗糖墊之間的界面。據(jù)此調(diào)節(jié)添加到細(xì)胞組織勻漿中的蔗糖緩沖液2的量。
(b)非粘著性細(xì)胞
將4×106的細(xì)胞接種于含包括10％ v/v FBS的30ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM或RPMI 1640)的T75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％v/v CO2條件下培養(yǎng)過夜。
T75培養(yǎng)瓶中的內(nèi)容轉(zhuǎn)移到50ml螺旋口帶蓋的管(Falcon)中，所述的管在進(jìn)行操作前已置于冰上冷卻。將上述管在冷卻離心機(jī)中500xg離心5min使細(xì)胞成為小塊。棄去培養(yǎng)基，向管中添加10ml 1×PBS(冰冷的)然后輕輕研磨以懸浮細(xì)胞。再棄去PBS重復(fù)清洗。
將細(xì)胞懸浮于4ml冰冷的蔗糖緩沖液A中在冰上孵育2min使細(xì)胞裂解，可任選地使用上述應(yīng)用于粘著性細(xì)胞的杜恩斯勻漿器。
(c)分離方法
依實(shí)施例4所述方法通過蔗糖墊離心將核與細(xì)胞碎片向分離，但分別用蔗糖緩沖液A和B替代蔗糖緩沖液1和2。
5.核連綴轉(zhuǎn)錄方法
實(shí)施例5提供了該方法，通過核連綴轉(zhuǎn)錄方法，以制備通過膜雜交進(jìn)行基因特異性檢測(cè)的[α-32P]-UTP-標(biāo)記的新生RNA轉(zhuǎn)錄本(實(shí)施例6，7和8)。為檢測(cè)基因特異性連綴轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，一種可替代膜雜交的方法是核糖核酸酶保護(hù)分析。通過標(biāo)準(zhǔn)的方法制備鏈特異性，基因特異性非標(biāo)記的RNA探針。它們與32P-標(biāo)記的由連綴轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)分離得到的RNA退火。為檢測(cè)雙鏈RNA，用對(duì)單鏈具有特異性的RNA酶處理退火產(chǎn)物并用PAGE檢測(cè)。這一技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的并在RPAIII(商標(biāo))手冊(cè)“糖核酸酶保護(hù)分析”(Catalog #s 1414，1415；-AmbionInc.)中有描述。
一種另外的方法用于制備由實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)進(jìn)行基因特異性檢測(cè)的RNA轉(zhuǎn)錄本(Patrone等，2000)。從粘著性細(xì)胞和非-粘著性細(xì)胞中分離完整核(參見實(shí)施例12-19，如下)，在甘油貯存緩沖液[50mMTris-HCl，pH8.3；40％v/v甘油，5mM MgCl2和0.1mM EDTA]以1×108每ml的濃度保存于-70℃。
在甘油貯存緩沖液中的100微升核(107)添加到100μl冰冷的添加了核苷酸的反應(yīng)緩沖液[200mM KCl，20mM Tris-HCl pH 8.0，5mM MgCl2，4mM二硫蘇糖醇(DTT)，ATP，GTP和CTP各4mM，200mM蔗糖和20％v/v甘油]中。生物素-16-UTP(由10mM四鋰鹽；Sigma)添加的混合物中并于29℃下孵育30min。終止反應(yīng)，所述的核裂解，添加20μl 20mM氯化鈣(Sigma)和10μl 10mg/ml無RNA酶的DNA酶I(Roche)消化DNA。所述混合物在29℃下溫育10min。
用TRIzol(注冊(cè)商標(biāo))試劑(Life Technologies)依制造商提供的方法進(jìn)行核連綴和總的(包含細(xì)胞質(zhì)的)RNA的分離。RNA懸浮于50μl無RNase的水中。將新生的生物素-16-UTP標(biāo)記的連綴轉(zhuǎn)錄物通過抗生蛋白鏈霉素珠(Dynabeads(注冊(cè)商標(biāo))kilobaseBINDER(商標(biāo))Kit，Dynal)依照制造商提供的方法從總RNA中分離出來。
實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)對(duì)這些連綴實(shí)驗(yàn)中的基因轉(zhuǎn)錄比率進(jìn)行定量。實(shí)時(shí)PCR化學(xué)過程對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。設(shè)計(jì)對(duì)轉(zhuǎn)基因，內(nèi)源基因和普遍表達(dá)的對(duì)照序列特異的寡核苷酸引物對(duì)。用引物表達(dá)軟件(Perkin Elmer)進(jìn)行寡核苷酸的擴(kuò)增和報(bào)告引物的設(shè)計(jì)。相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平用Rotor-Gene RG-2000系統(tǒng)(Corbett Research)進(jìn)行定量。
6.mRNA的檢測(cè)
核糖核酸酶保護(hù)試驗(yàn)，用未標(biāo)記的mRNA與32P標(biāo)記的探針退火的方法，可用于檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄本。用PAGE檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。通過Northern分析估計(jì)內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定狀態(tài)下的RNA產(chǎn)物水平。
可替代地，使用以引物表達(dá)軟件設(shè)計(jì)的對(duì)轉(zhuǎn)基因，內(nèi)源基因和普遍表達(dá)的對(duì)照序列特異的擴(kuò)增和報(bào)告寡核苷酸，由Rotor-Gene RG-2000系統(tǒng)，通過實(shí)時(shí)PCR對(duì)相對(duì)mRNA水平進(jìn)行定量。
7.哺乳動(dòng)物基因組DNA的Southern印跡實(shí)驗(yàn)
對(duì)于所有的下述實(shí)施例，基因組DNA的Southern印跡實(shí)驗(yàn)是通過下述方法進(jìn)行的。向含40ml DMEM或RPMI 1640，10％v/v FBS T75培養(yǎng)瓶中接種4×106細(xì)胞并在37℃5％ v/v CO2條件下培養(yǎng)24hr。
(a)粘著性細(xì)胞
對(duì)于粘著性細(xì)胞，操作如下倒出培養(yǎng)基添加5ml 1×PBS到T75培養(yǎng)瓶中輕輕晃動(dòng)以清洗組織單層細(xì)胞。倒出PBS重復(fù)用1×PBS清洗細(xì)胞。倒出PBS。用2ml 1×PBS/1x胰蛋白酶-EDTA覆蓋所述的單層細(xì)胞。輕晃上述的瓶水平地蓋上所述的單層細(xì)胞表面。將T75培養(yǎng)瓶在37℃和5％ v/v CO2條件下培養(yǎng)，直到所述單層細(xì)胞與瓶相脫離。向所述的瓶中添加2ml含10％ v/v FBS的培養(yǎng)基。進(jìn)行鏡檢此時(shí)的細(xì)胞應(yīng)是分離的且為圓形。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10ml帶蓋的管中添加3ml冰冷的1×PBS。將管倒轉(zhuǎn)混合。通過冷凍離心機(jī)(4℃)500xg離心10min使細(xì)胞結(jié)為顆粒狀物。棄上清向帶蓋的管中添加5ml冰冷的1×PBS。輕輕渦旋使細(xì)胞懸浮。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板確定細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)應(yīng)不超過2×108。通過(4℃)500xg冷凍離心10min使細(xì)胞結(jié)為顆粒狀物。棄上清。
(b)非-粘著性細(xì)胞
對(duì)非-粘著性細(xì)胞操作如下將細(xì)胞懸液倒入50ml Falcon管，500xg冷凍離心10min(4℃)。倒出上清液，向細(xì)胞中添加5ml冰冷的1×PBS，輕輕渦旋使細(xì)胞懸浮。通過冷凍離心機(jī)(4℃)500xg離心10min使細(xì)胞結(jié)為顆粒狀物。棄上清向Falcon管中添加5ml冰冷的1×PBS。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板確定細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)應(yīng)不超過2×108。通過(4℃)500xg冷凍離心10min使細(xì)胞結(jié)為顆粒狀物。棄上清。
(c)DNA抽提和分析
對(duì)于粘著性和非-粘著性細(xì)胞均通過Qiagen基因組DNA抽提試劑盒(Cat No.10243)依照制造商提供的方法抽提基因組DNA。用Beckman model DU64分光光度計(jì)在260nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)回收的基因組DNA的濃度。
用合適的限制性內(nèi)切酶和緩沖液以200μl的體積在37℃下消化基因組DNA(10μg)約16hr。消化后，向消化物中添加20μl 3M醋酸鈉pH5.2和500μl無水乙醇并將所述溶液倒轉(zhuǎn)混合。所述的混合物在-20℃下處理2hr以沉淀所消化的基因組DNA。在4℃下10,000xg離心30min所述的DNA結(jié)為顆粒狀物。棄上清用500μl 70％ v/v乙醇洗DNA沉淀。棄去70％ v/v乙醇，將DNA沉淀在空氣中干燥，再將DNA溶解于20μl水中。
向重懸DNA中添加凝膠上樣染料(0.25％ w/v 溴酚藍(lán)(Sigma)；0.25％ w/v二甲苯氰基FF(Sigma)；15％ w/v Ficoll Type 400(Pharmacia))(5μl)混合后上樣到含0.5μg/ml溴化乙錠的0.7％w/v瓊脂糖/TAE凝膠孔中。消化的基因組DNA在14伏下電泳約16hr。在平行的孔中含有適當(dāng)?shù)腄NA分子標(biāo)記。
將所消化的基因組DNA在凝膠中變性(1.5M NaCl，0.5M NaOH)再使所述的凝膠中和(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH7.0)。經(jīng)電泳的DNA片段通過毛細(xì)作用印跡到Hybond NX(Amersham)膜上并通過UV交聯(lián)固定(Bio Rad GS Gene Linker)。
含交聯(lián)的基因組DNA的膜浸潤(rùn)于無菌中。然后將所述的膜在0.4％v/v300mM醋酸鈉(pH5.2)亞甲基藍(lán)中染色5min以觀察所轉(zhuǎn)移的基因組DNA。將所述的膜在無菌水中浸潤(rùn)兩次再用40％ v/v乙醇脫色。然后再浸潤(rùn)于無菌水中以去除乙醇。
將所述的膜置于添加了5ml預(yù)雜交液(6×SSPE，5×Denhardt’s試劑，0.5％ w/v SDS，100μg/ml變性的，片段化的鯡精DNA)的雜交瓶中。將所述的膜在60℃下于雜交箱中預(yù)雜交約14hr，雜交箱恒定轉(zhuǎn)速(6rpm)。
探針(25ng)依制造商提供的方法通過MegaprimeDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham Cat.No.RPN1606)用[α32p]-dCTP(特定活性3000Ci/mmol)標(biāo)記。依制造商提供的方法將標(biāo)記探針過G50 SephadexQuick Spin(商標(biāo))柱(Roche，Cat.No.1273973)以去除未摻入的核苷酸。
將熱變性的探針加入2ml雜交緩沖液(6×SSPE，0.5％ w/v SDS，100μg/ml變性的片段化鯡精DNA)預(yù)熱至60℃。棄去所述的預(yù)雜交緩沖液，換為含有標(biāo)記探針的2ml預(yù)熱的雜交緩沖液。將所述的膜在60℃下于雜交箱中雜交約16hr，雜交箱恒定轉(zhuǎn)速(6rpm)。
棄去含有探針的雜交緩沖液，將上述的膜進(jìn)行下述清洗
2×SSC，0.5％ w/v SDS 5min，室溫下；
2×SSC，0.1％ w/v SDS 15min，室溫下；
0.1×SSC，0.5％ w/v SDS 30min，37℃下，輕輕晃動(dòng)；
0.1×SSC，0.5％ w/v SDS 1hr，68℃輕輕晃動(dòng)；和
0.1×SSC 5min，室溫下，輕輕晃動(dòng)。
在68℃下的清洗時(shí)間隨用手提式蓋革計(jì)數(shù)器所檢測(cè)的放射性的量的不同而變化。
將濕潤(rùn)的膜包在塑料膜中暴露于X-光片(Curix Blue HC-S Plus，AGFA)下24到48hr，顯影后可以觀察到與探針雜交的基因組DNA帶。
8.培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記
蓋玻片(12mm×12mm)用乙醇通過火焰滅菌后浸沒于2ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在6-孔板中每孔兩個(gè)。將細(xì)胞加入含有1-2ml培養(yǎng)基的孔中，生長(zhǎng)16hr后使細(xì)胞達(dá)到一定的密度并保持相互分離(依細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速率200,000到500,000)。在不從孔上取下蓋片的情況下將培養(yǎng)基吸除并用PBS洗細(xì)胞。用4％ w/v于PBS中的低聚甲醛(Sigma)處理1hr以固定細(xì)胞，然后用PBS洗三次。固定的細(xì)胞用PBS中的0.1％ v/v Triton X-100(Sigma)滲透5min然后用PBS洗三次。將蓋片上的細(xì)胞用一滴(約100μl)0.5％ w/v牛血清白蛋白片段V(BSA，Sigma)封閉10min。
將蓋片置于25μl用含0.5％ v/v BSA的PBS進(jìn)行1/100稀釋的初級(jí)小鼠單克隆抗體中至少1hr。然后用100μl含0.5％ v/v BSA的PBS將蓋片洗三次每次約3min，然后置于25μl用含0.5％ v/v BSA的PBS進(jìn)行1/100稀釋的二抗Alexa Fluor(注冊(cè)商標(biāo))488羊抗鼠IgG偶聯(lián)物(Molecular Probes)30min到1hr。將蓋片上的細(xì)胞用PBS洗三次。將蓋片固定在玻片上，每玻片上三片，于甘油/DABCO[25mg/ml DABCO(1，4-二氮雜二環(huán)(2.2.2)-辛烷(Sigma D 2522))在含80％ v/v甘油的PBS]用100X油浸物鏡于500-550nm UV光下檢測(cè)。
9.實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基的組分
所用DMEM，OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))減少血清的培養(yǎng)基，及PBS和胰蛋白酶-EDTA的組成于實(shí)施例1中列出。
(a)RPMI 1640培養(yǎng)基
使用購(gòu)自Life Technologies的RPMI 1640培養(yǎng)基制劑(Cat.No.21870)。該液體制劑是
Ca(NO3)2.4H2O 100mg/l
KCl 400mg/l
MgSO4(無水) 48.84mg/l
NaCl 6,000mg/l
NaHCO32,000mg/l
NaH2PO4(無水)800mg/l
D-葡萄糖 2,000mg/l
谷胱甘肽(還原型) 1.0mg/l
酚紅 5mg/l
L-精氨酸 200mg/l
L-天冬酰胺(游離堿) 50mg/l
L-天冬氨酸 20mg/l
L-胱氨酸.2HCl 65mg/l
L-谷氨酸 20mg/l
甘氨酸 10mg/l
L-組氨酸(游離堿) 15mg/l
L-羥脯氨酸 20mg/l
L-異亮氨酸 50mg/l
L-亮氨酸 50mg/l
L-賴氨酸HCl40mg/l
L-甲硫氨酸 15mg/l
L-苯丙氨酸 15mg/l
L-脯氨酸 20mg/l
L-絲氨酸 30mg/l
L-蘇氨酸 20mg/l
L-色氨酸 5mg/l
L-酪氨酸.2Na.2H2O 29mg/l
L-纈氨酸 20mg/l
生物素 0.2mg/l
D-泛酸鈣 0.25mg/l
氯化膽堿 3mg/l
葉酸 1mg/l
i-肌醇35mg/l
尼克酰胺 1mg/l
對(duì)氨基苯甲酸 1mg/l
鹽酸吡哆醇1mg/l
核黃素0.2mg/l
鹽酸硫胺素1mg/l
維生素B12 0.005mg/l
實(shí)施例11
用于實(shí)現(xiàn)共抑制的質(zhì)粒構(gòu)建體盒的制備
1.一般的RNA分離，cDNA合成和PCR方法
依制造商提供的方法用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)從所指出的細(xì)胞系中純化總RNA。為制備cDNA，用Omniscript反轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen)將該RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。依制造商提供的方法(Qiagen)，用2微克總RNA用1μM寡dT(Sigma)作為引物在20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
為擴(kuò)增特定的產(chǎn)物用2μl這種混合物作為底物用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件包括最初的激活步驟95℃ 15min，接下來在94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后的延長(zhǎng)步驟是在72℃4min。
所克隆的PCR產(chǎn)物通常是用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化；當(dāng)由PCR產(chǎn)生了多種片段時(shí)可依制造商提供的方法用QIAquick凝膠純化試劑盒(Qiagen)純化正確大小的片段。
依制造商提供的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO(Invitrogen)中。
2.一般克隆技術(shù)
為制備下述的構(gòu)建體，依制造商提供的方法(Roche)用限制性內(nèi)切酶從中間載體上切下插入片段，并將片段依制造商提供的方法用QIAquick凝膠純化試劑盒(Qiagen)從凝膠中純化出來。載體通常依制造商提供的方法經(jīng)限制酶消化并經(jīng)蝦堿性磷酸酶(Amersham)處理。依制造商提供的方法(Roche)用T4 DNA將載體和插入片段連接起來并通過標(biāo)準(zhǔn)的方法(Sambrook等；1984)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α中。
3.構(gòu)建
(a)可商購(gòu)質(zhì)粒
質(zhì)粒pEGFP N1
質(zhì)粒pEGFP-N1(圖1；Clontech)包含CMV IE啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作的與編碼野生型GFP的紅移(red-shifted)變異體的開放閱讀框相連，所述的變異體經(jīng)優(yōu)化產(chǎn)生更亮的熒光。Cormack等(1996)已描述了由pEGFP-N1編碼的特定GFP變異體。質(zhì)粒pEGFP-N1帶有包含BglII和BamHI位點(diǎn)和許多其它限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)位于CMV IE啟動(dòng)子和EGFP開放閱讀框之間。所述的質(zhì)粒pEGFP-N1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)EGFP蛋白。
另外，克隆到多克隆位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基因假如與EGFP-編碼序列在同一框內(nèi)并缺乏功能性的翻譯終止密碼，則將作為EGFP融合多肽表達(dá)。所述的質(zhì)粒中進(jìn)一步包含位于EGFP開放閱讀框下游的SV40多聚腺苷酸信號(hào)以指導(dǎo)由CMV IE啟動(dòng)子序列(SV40pA)轉(zhuǎn)錄的mRNA3’-端的正確加工。所述的質(zhì)粒還包括在動(dòng)物細(xì)胞中有功能的SV40復(fù)制起點(diǎn)；含SV40早期啟動(dòng)子和HSV胸苷激酶多聚腺苷酸信號(hào)的新霉素抗性基因(SV40-E，在圖1中)，所述的啟動(dòng)子可操作地與來自Tn5(Kan/Neo圖1中)的新霉素/卡那霉素-抗性基因相連接，以便利用卡那霉素，新霉素或遺傳霉素篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；在細(xì)菌中是功能的pUC19復(fù)制起點(diǎn)和用于制備單鏈DNA的f1復(fù)制起點(diǎn)。
質(zhì)粒pBluescript II SK+
質(zhì)粒pBluescript II SK+購(gòu)自Stratagene，其包含lacZ啟動(dòng)子序列和lacZ-α轉(zhuǎn)錄終止子，和位于其間的多限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。設(shè)計(jì)質(zhì)粒pBluescript II SK+以通過該多限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)克隆核酸片段。質(zhì)粒還包括Col E1和f1復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因。
質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1
質(zhì)粒pCR2.1是可從Invitrogen商購(gòu)的T-尾載體，其包括lacZ啟動(dòng)子序列和lacZ-α轉(zhuǎn)錄終止子，和位于其間用于插入結(jié)構(gòu)基因序列的克隆位點(diǎn)。設(shè)計(jì)質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1以便利用在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中Taq聚合酶經(jīng)常合成的A-突出端克隆核酸片段。所述的質(zhì)粒還包括ColE1和f1復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性和氨芐青霉素抗性基因。
質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO
質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO是可商購(gòu)的T-尾載體，來自Invitrogen，其含有l(wèi)acZ啟動(dòng)子序列和lacZ-α轉(zhuǎn)錄終止子，和位于其間的限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO帶有共價(jià)結(jié)合的拓?fù)洚悩?gòu)酶I以便快速克隆。所述的質(zhì)粒還包括ColE1和f1復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因。
質(zhì)粒pPUR
質(zhì)粒pPUR可由Clontech購(gòu)得，其包含SV40早期啟動(dòng)子，后者可操作地與編碼白黑鏈霉菌(Streptomyces alboniger)嘌呤霉素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(pac)基因的開放閱讀框相連接(de la Luna和Ortin，1992)。該質(zhì)粒還包括pac開放閱讀框下游的SV40多聚腺苷酸信號(hào)，以指導(dǎo)由SV40E啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄的mRNA3’-端的正確加工。該質(zhì)粒還包括用于大腸桿菌復(fù)制的細(xì)菌中復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素(β-內(nèi)酰胺酶)基因。
(b)中間盒
質(zhì)粒TOPO.BGI2
質(zhì)粒TOPO.BGI2包含位于質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO多克隆區(qū)域的人β-珠蛋白內(nèi)含子2(BGI2)。為產(chǎn)生該質(zhì)粒，用下述擴(kuò)增引物從人基因組DNA中克隆人β-珠蛋白內(nèi)含子2
GD1 GAG CTC TTC AGG GTG AGT CTA TGG GAC CC[SEQ ID NO1]和
GAl CTG CAG GAG CTG TGG GAG GAA GAT AAG AG[SEQ ID NO2]并將其克隆到質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO中以形成質(zhì)粒TOPO.BGI2。BGI2是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能性的內(nèi)含子序列，其在轉(zhuǎn)錄后能夠從含有它的RNA轉(zhuǎn)錄本中切除。
質(zhì)粒TOPO.PUR
質(zhì)粒TOPO.PUR包含位于質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO的多克隆區(qū)域的來自pPUR的SV40E啟動(dòng)子，嘌呤霉素-N-乙酰-轉(zhuǎn)移酶基因，SV40多聚腺苷酸信號(hào)序列。為產(chǎn)生該質(zhì)粒，質(zhì)粒pPUR中含SV40E啟動(dòng)子，嘌呤霉素-N-乙酰-轉(zhuǎn)移酶基因，和SV40多聚腺苷酸的區(qū)域通過下述擴(kuò)增引物由質(zhì)粒pPUR(Clontech)擴(kuò)增獲得
AflIII-pPUR-Fwd TCT CCT TAC GCG TCT GTG CGG TAT[SEQID NO3]和
AflIII-pPUR-Rev ATG AGG ACA CGT AGG AGC TTC CTG[SEQID NO4]并克隆到質(zhì)粒pCR(注冊(cè)商標(biāo))2. 1-TOPO中以形成質(zhì)粒TOPO.PUR。
(c)質(zhì)粒盒
質(zhì)粒pCMV.cass
質(zhì)粒pCMV.cass(圖2)是驅(qū)動(dòng)CMV-IE啟動(dòng)子序列控制下的結(jié)構(gòu)基因序列表達(dá)的表達(dá)盒。質(zhì)粒pCMV.cass是通過下述方式缺失EGFP開放閱讀框由pEGFP-N1(圖1)衍生而來。用PinAI和NotI消化質(zhì)粒pEGFP-N1，用PfuI DNA聚合酶進(jìn)行平末端化然后再連接。利用多克隆位點(diǎn)將結(jié)構(gòu)基因序列克隆到pCMV.cass，上述多克隆位點(diǎn)除缺少PinAI位點(diǎn)外，與pEGFP-N1的多克隆位點(diǎn)相同。
質(zhì)粒pCMV.BGI2.cass
為構(gòu)建pCMV.BGI2.cass(圖3)，從TOPO.BGI2中分離含人β珠蛋白序列的SacI/PstI片段，然后克隆到pCMV.cass.的SacI和PstI位點(diǎn)之間。在pCMV.BGI2.cass中，任何由CMV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA均包含人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列；由于所述的內(nèi)含子序列包括正常內(nèi)含子加工所需的剪接供體和剪接受體序列，故推測(cè)這些內(nèi)含子序列將作為正常內(nèi)含子加工程序的一部分從轉(zhuǎn)錄本中被切除掉。
實(shí)施例12
在體外豬腎1型細(xì)胞中綠色熒光蛋白的共抑制
1.細(xì)胞系的培養(yǎng)
如上述實(shí)施例10所述將PK-1細(xì)胞(來自豬腎上皮細(xì)胞)利用添加了10％ v/v FBS的DMEM培養(yǎng)為貼壁單層。
2.遺傳構(gòu)建體的制備
(a)中間質(zhì)粒
質(zhì)粒pBluescript.EGFP
質(zhì)粒pBluescript.EGFP包含置于質(zhì)粒pBluescript II SK+多克隆區(qū)域的來源于質(zhì)粒pEGFP-N1(圖1，參見實(shí)施例11)的EGFP開放閱讀框。為構(gòu)建該質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶NotI和XhoI消化質(zhì)粒pEGFP-N1切除EGFP開放閱讀框，再將其與經(jīng)NotI和XhoI消化的質(zhì)粒pBluescript II SK+相連接。
質(zhì)粒pCR.Bgl-GFP-Bam
質(zhì)粒pCR.Bgl-GFP-Bam包含來自質(zhì)粒pEGFP-N1(圖1)并置于質(zhì)粒pCR2.1(Invitrogen，參見實(shí)施例11)的多克隆區(qū)域的EGFP開放閱讀框的內(nèi)部區(qū)域。為構(gòu)建該質(zhì)粒，依制造商的指導(dǎo)(Invitrogen)用下述擴(kuò)增引物由pEGFP-N1擴(kuò)增EGFP開放閱讀框
Bgl-GFPCCC GGG GCT TAG TGT AAA ACA GGC TGA GAG[SEQID NO5]和
GFP-BamCCC GGG CAA ATC CCA GTC ATT TCT TAG AAA[SEQID NO6]并克隆到質(zhì)粒pCR2.1中。
在質(zhì)粒pCR.Bgl-GFP-Bam中的EGFP編碼區(qū)域的內(nèi)部區(qū)域缺乏功能性的翻譯起始和終止密碼子。
質(zhì)粒pCMV.GFP.BGI2.PFG
質(zhì)粒pCMV.GFP.BGI2.PFG(圖4)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的EGFP開放閱讀框內(nèi)部區(qū)的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCMV.GFP.BGI2.PFG由下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將質(zhì)粒pCR.Bgl-GFP-Bam的GFP序列作為BglII-到-BamHI片段以有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2.cass(圖3，參見實(shí)施例11)中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.GFP.BGI2，及(ii)來自質(zhì)粒pCR.Bgl-GFP-Bam的GFP序列作為BglII-到-BamHI片段以反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.GFP.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.GFP.BGI2.PFG。
(b)檢測(cè)質(zhì)粒
質(zhì)粒pCMV.FGFP
質(zhì)粒pCMV.EGFP(圖5)在CMV-IE啟動(dòng)子序列的控制下能夠表達(dá)完整的EGFP開放閱讀框。為構(gòu)建pCMV.EGFP，上述來自pBluescript.EGFP的EGFP序列作為BamHI-到-SacI片段以有義方向亞克隆到由BglII/SacI-消化的pCMV.cass(圖2，參見實(shí)施例11)中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.EGFP.
質(zhì)粒pCMVpur.BGI2.cass
質(zhì)粒pCMVpur.BGI2.cass(圖6)包含在pCMV.BGI2.cass中的嘌呤霉素抗性選擇標(biāo)記基因(圖3)，并作為這些實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照。為構(gòu)建PCMVpur BG12.cass，將來自TOPO.PUR(實(shí)施例10)的嘌呤霉素抗性基因以AflII片段克隆到用AflII-消化的pCMV.BGI2.cass中。
質(zhì)粒pCMpur.GFP.BGI2.PFG
質(zhì)粒pCMVpur.GFP.BGI2.PFG(圖7)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的EGFP開放閱讀框編碼區(qū)的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)和嘌呤霉素抗性選擇標(biāo)記基因。將TOPO.PUR(實(shí)施例10)中含有嘌呤霉素抗性基因的AflII片段克隆到由AflII-消化的pCMV.GFP.BGI2.PFG(圖4)中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMVPur.GFP.BGI2.PFG。
3.共抑制表型的檢測(cè)
(a)將表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因插入PK-1細(xì)胞
在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。每孔在2ml of DMEM，10％ v/vFBS中接種4×104 PK-1細(xì)胞，在37℃5％v/v CO2條件下培養(yǎng)到單層細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60-90％匯合，典型地需16到24hr。
要轉(zhuǎn)化一塊板(6孔)，12μg pCMV.EGFP(圖5)質(zhì)粒DNA和108μl GenePORTER2(商標(biāo))(Gene Therapy Systems)在OPTI-MEM-I(注冊(cè)商標(biāo))中稀釋至終體積6ml，于室溫下溫育45min。
去除每孔中的組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用1ml 1×PBS洗其中的單層細(xì)胞。每孔中用1ml質(zhì)粒DNA/GenePORTER2(商標(biāo))偶聯(lián)物覆蓋所述的單層細(xì)胞并在37℃ 5％ v/v CO2條件下溫育4.5hr。
向每孔添加含20％ v/v FBS的OPTI-MEM-I(注冊(cè)商標(biāo))(1ml)并將所述的容器繼續(xù)溫育24hr，此時(shí)用1×PBS洗滌所述單層細(xì)胞，用2ml含10％ v/v FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基更換所用的培養(yǎng)基。用pCMV.EGFP轉(zhuǎn)化的細(xì)胞經(jīng)24-48hr后用熒光顯微鏡在500-550nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)瞬間EGFP表達(dá)。
轉(zhuǎn)染后48hr，去除培養(yǎng)基，用1×PBS洗細(xì)胞，向每孔中添加4ml新鮮的含10％ v/v FBS和1.5mg/ml遺傳霉素(Life Technologies)的DMEM。培養(yǎng)基中含遺傳霉素以選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。所述的DMEM，10％ v/v FBS，1.5mg/ml遺傳霉素培養(yǎng)基每48-72hr更換一次。篩選進(jìn)行21天后穩(wěn)定的，表達(dá)EGFP的PK-1集落即顯而易見。
如實(shí)施例10的一般技術(shù)中所述對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PK-1細(xì)胞單集落進(jìn)行克隆，維持和貯存。
用pCMV.EGFP轉(zhuǎn)化了大量親本細(xì)胞系。如表2和圖9A，9B，9C和9D所示，其中許多的GFP表達(dá)極低或完全檢測(cè)不到。
表2
這些數(shù)據(jù)表明GFP的失活經(jīng)常出現(xiàn)在由3個(gè)不同的種所建立的不同類型的細(xì)胞系中。
(b)在PK-1細(xì)胞中表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄后沉默
為研究表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄后沉默(PTGS)的起始，用構(gòu)建體pCMVpur GFP.BGI2.PFG(圖7)轉(zhuǎn)染來自12個(gè)穩(wěn)定的表達(dá)EGFP的PK-1細(xì)胞系(PK-1/EGFP)的細(xì)胞。還包括兩個(gè)對(duì)照。第一個(gè)對(duì)照是每個(gè)穩(wěn)定的由質(zhì)粒pCMVpar.BGI2.cass轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的復(fù)制物(圖6)。第二個(gè)對(duì)照是用未轉(zhuǎn)染的PK1/EGFP細(xì)胞系的復(fù)制物。
用pCMVpur.GFP.BGI2.PFG和pCMVpur.BGI2.cass轉(zhuǎn)化PK-1細(xì)胞是在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行的，用如上述(a)中所述的方法，一式三份。
轉(zhuǎn)染后48hr去除培養(yǎng)基用PBS洗滌細(xì)胞單層(見上)，向每孔細(xì)胞中加入4ml含10％ v/v FBS和1mg/ml遺傳霉素的新鮮DMEM(GGM)。另外，用pCMVpur.BGI2.cass或pCMVpur.GFP.BGI2.PFG轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，所述的GGM中還要添加1.0μg/ml嘌呤霉素；培養(yǎng)基中包含嘌呤霉素是為了篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。篩選后21天，共轉(zhuǎn)化的沉默集落即顯而易見。轉(zhuǎn)染后，所有的復(fù)制物在顯微鏡下鏡檢是否存在PTGS，用pCMVpur.GFP.BGI2.PFG轉(zhuǎn)化的細(xì)胞缺失表達(dá)EGFP的表型，而用pCMVpur.BGI2.cass轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染的復(fù)制物對(duì)照中不存在上述缺失。
3.核連綴轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)
為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因RNA在PK-1細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的無細(xì)胞的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。
依照上述實(shí)施例10中所述的核連綴轉(zhuǎn)錄分析方法對(duì)來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV.EGFP的轉(zhuǎn)基因EGFP和來自共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMVpur.GFP.BGI2.PFG的轉(zhuǎn)基因GFP.BGI2.PFG的核RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。
對(duì)于所有被分析的PK-1細(xì)胞核，無論是用質(zhì)粒pCMV.EGFP或用轉(zhuǎn)基因GFP.BGI2.PFG轉(zhuǎn)染的，與用未轉(zhuǎn)染的PK-1/EGFP對(duì)照細(xì)胞系或用質(zhì)粒pCMVpur.BGI2.cass轉(zhuǎn)化的對(duì)照細(xì)胞系的核相比，其中的轉(zhuǎn)錄速率基本上沒有區(qū)別。
5.未轉(zhuǎn)化和共抑制的細(xì)胞系中的mRNA的比較
依照上述實(shí)施例10中所述的方法分析了來自質(zhì)粒pCMV.EGFP的EGFP的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因GFP.BGI2.PFG轉(zhuǎn)錄的RNA。
6.Southern實(shí)驗(yàn)
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)基因PK-1細(xì)胞系(轉(zhuǎn)染的和共轉(zhuǎn)染的)以確定整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。圖8中舉例說明了一個(gè)實(shí)例。
實(shí)施例13
體外Madin Darby牛腎CRIB-1型細(xì)胞中的牛腸道病毒的共抑制
1.細(xì)胞系的培養(yǎng)
CRIB-1細(xì)胞(來自牛腎上皮細(xì)胞)如上述實(shí)施例10中所述在添加了10％v/v供體小牛血清的(DCS；Life Technologies)的DMEM中生長(zhǎng)成為貼壁單層細(xì)胞。細(xì)胞一直在37℃含5％ v/v CO2的空氣中生長(zhǎng)。
2.遺傳構(gòu)建體的制備
(a)中間質(zhì)粒
質(zhì)粒pCR.BEV2
用下述引物由編碼牛腸道病毒RNA聚合酶的全長(zhǎng)cDNA克隆擴(kuò)增完整的牛腸道病毒(BEV)RNA聚合酶編碼區(qū)域
BEV-1 CGG CAG ATC CTA ACA ATG GCA GGA CAA ATC GAG TACATC [SEQ ID NO7]和
BEV-3 GGG CGG ATC CTT AGA AAG AAT CGT ACC AC[SEQ ID NO8]。
引物BEV-1的第4到9位(首尾包括在內(nèi))包含BglII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，在第16-18位(首尾包括在內(nèi))為ATG起始點(diǎn)。引物BEV-3在第5到10位(首尾包括在內(nèi))包含BamHI酶切位點(diǎn)和在第11到13位(首尾包括在內(nèi))包含與TAA翻譯終止信號(hào)互補(bǔ)的堿基。結(jié)果含有翻譯起始和終止信號(hào)的開放閱讀框包含在BglII和BamHI酶切位點(diǎn)之間。將所述擴(kuò)增片段克隆到pCR2.1中以構(gòu)建質(zhì)粒pCR.BEV2。
質(zhì)粒pBS.PFGE
質(zhì)粒pBS.PFGE包含克隆到pBluescript II SK+的多接頭的來自pEGFP-N1的EGFP編碼序列。為構(gòu)建該質(zhì)粒，來自pEGFP-N1的EGFP編碼序列作為NotI-到-SacI片段克隆到用NotI/SacI-消化的pBluescript II SK+中。
(b)檢測(cè)質(zhì)粒
質(zhì)粒pCMV.EGFP
質(zhì)粒pCMV.EGFP(圖5)能夠表達(dá)完整的EGFP開放閱讀框，在本實(shí)施例和下面的實(shí)施例中用作陽(yáng)性轉(zhuǎn)染對(duì)照(參見實(shí)施例12，2(b))。
質(zhì)粒pCMV.BEV2.BGI2 2VEB
質(zhì)粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB(圖10)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的BEV聚合酶編碼區(qū)的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒pCR.BEV2的BEV2序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2.cass(實(shí)施例11)以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.BEV2.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒pCR.BEV2的BEV2序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.BEV2.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB。
質(zhì)粒pCMV.BEV.EGFP.VEB
質(zhì)粒pCMV.BEV.EGFP.VEB(圖11)包含被作為填充片段的EGFP編碼序列打斷的BEV聚合酶編碼區(qū)的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。為構(gòu)建該質(zhì)粒，將來自pBS.PFGE的含EGFP編碼序列的EcoRI片段分離出來，按相對(duì)于CMV啟動(dòng)子的有義方向克隆到用EcoRI-消化的pCMV.cass中以構(gòu)建pCMV.EGFP.cass。質(zhì)粒pCMV.BEV.EGFP.VEB是通過下述的連續(xù)步驟構(gòu)建的(i)將來自質(zhì)粒pCR.BEV2的BEV聚合酶序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMVEGFP.cass中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.BEV.EGFP和(ii)將來自質(zhì)粒pCR.BEV2的BEV聚合酶序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.BEV.EGFP中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.BEV.EGFP.VEB。
3.共抑制表型的檢測(cè)
(a)將表達(dá)牛腸道病毒RNA聚合酶的轉(zhuǎn)基因插入CRIB-1細(xì)胞
轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。在每孔的2m DMEM，10％v/vDCS中接種2×105 CRIB-1細(xì)胞并在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)，直到單層細(xì)胞達(dá)60-90％匯合，典型地需要16到24hr。
在10ml無菌的管中配置下述溶液
溶液A對(duì)每次轉(zhuǎn)染，1μg DNA(pCMV.BEV2.BGI2. 2VEB或pCMV.EGFP-轉(zhuǎn)染對(duì)照)在100μl OPTI MEM-I(注冊(cè)商標(biāo))減少血清培養(yǎng)基(無血清培養(yǎng)基)中稀釋；
溶液B對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，10μl LIPOFECTAMINE(商標(biāo))試劑于100μl OpTI-MEM-I(注冊(cè)商標(biāo))減少血清培養(yǎng)基中稀釋。
將兩種溶液倒在一起輕輕混合于室溫下溫育45min以形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。形成復(fù)合物時(shí)將所述的CRIB-1用2ml OPTI-MEMI(注冊(cè)商標(biāo))減少血清培養(yǎng)基沖洗一次。
對(duì)于每次轉(zhuǎn)染，將0.8ml OPTI-MEMI(注冊(cè)商標(biāo))減少血清培養(yǎng)基添加到含上述復(fù)合物的管中，將所述的管輕輕混合，將經(jīng)過稀釋的復(fù)合物溶液倒在沖洗過的CRIB-1細(xì)胞上。然后將所述細(xì)胞與上述復(fù)合物在37℃5％ v/v CO2條件下孵育16到24hr。
去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，用2ml DMEM，10％ v/v DCS覆蓋CRIB-1單層細(xì)胞。所述細(xì)胞在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)約48hr。為選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，所述的培養(yǎng)基每72hr用4ml DMEM，10％ v/v DCS，0.6mg/ml遺傳霉素更換一次。24-48hr后用熒光顯微鏡在500-550nm波長(zhǎng)下檢測(cè)由轉(zhuǎn)染對(duì)照pCMV.EGFP轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的瞬間EGFP表達(dá)。篩選21天后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的CRIB-1集落顯而易見。
如實(shí)施例10的一般技術(shù)中所述對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CRIB-1細(xì)胞單集落進(jìn)行克隆，維持和貯存。
(b)牛腸道病毒滴度的確定
用于這些實(shí)驗(yàn)中的BEV分離物是一種克隆分離物，K2577。這一原始的病毒貯藏物的滴度是未知的。為從這一貯藏物中擴(kuò)增BEV病毒，如下所述每孔用5μl病毒貯藏物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使病毒復(fù)制48hr。收獲培養(yǎng)基將其轉(zhuǎn)移到帶有螺旋蓋的管中。在Sigma 3K18離心機(jī)中于4℃下3,500rpm離心15min以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將上清倒入新管中用Beckman J2-M1離心機(jī)于4℃下20,000rpm離心30min以去除余下的碎片。倒出上清，如下所述測(cè)定這一新BEV貯液的滴度并于4℃下保存。
絕對(duì)值
用6-孔組織培養(yǎng)板，在每孔2ml DMEM，10％ v/v DCS中接種2.5×105 CRIB-1細(xì)胞。將所述細(xì)胞37℃含 5％ v/v CO2下培養(yǎng)直到所述細(xì)胞達(dá)90-100％匯合。
用無血清培養(yǎng)基DMEM按10-1到10-9稀釋BEV。從CRIB-1單層細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基。用2ml 1×PBS覆蓋單層細(xì)胞，并輕輕搖動(dòng)組織培養(yǎng)容器以清洗所述單層細(xì)胞。從上述單層細(xì)胞中吸出PBS再重復(fù)洗一次。
立即將1ml經(jīng)稀釋的病毒溶液(10-4到10-9)直接添加到清洗過的CRIB-1細(xì)胞中，每孔用一個(gè)稀釋度，一式兩份。將所述的CRIB-1細(xì)胞與BEV在37℃ 5％ v/v CO2條件下培養(yǎng)1hr并伴隨輕柔攪拌。吸出病毒接種物，用3ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂(在DMEM中加入1％純凈瓊脂)覆蓋轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。用無菌蒸餾水配置2％ w/v純凈瓊脂，DMEM為2×DMEM。熔化所述的純凈瓊脂在50℃水浴中平衡1hr。在使用前將2×DMEM在37℃水浴中平衡15min。將兩種溶液以1∶1混合，用于覆蓋轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。
使所覆蓋的營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝結(jié)，于37℃ 5％ v/v CO2條件下倒置培養(yǎng)18-24hr。培養(yǎng)后每孔用3ml中性紅瓊脂(1.7ml中性紅溶液(LifeTechnologies)/100ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂)覆蓋。使所覆蓋的中性紅瓊脂凝結(jié)將所述的6孔板倒置，于黑暗中在37℃ 5％ v/v CO2條件下培養(yǎng)18-24hr。在加入中性紅瓊脂后24hr數(shù)噬斑的數(shù)目以確定BEV病毒貯液的滴度。
經(jīng)驗(yàn)值
用24-孔組織培養(yǎng)板，在每孔800μl DMEM，10％ v/v DCS中接種4×104 CRIB-1細(xì)胞。將所述細(xì)胞37℃含 5％ v/v CO2下培養(yǎng)直到所述細(xì)胞達(dá)90-100％鋪滿。
由濃縮的BEV病毒貯液，用無血清培養(yǎng)基DMEM按10-1到10-9稀釋BEV。從CRIB-1單層細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基。用800μl 1×PBS覆蓋單層細(xì)胞，并輕輕搖動(dòng)組織培養(yǎng)容器以清洗所述細(xì)胞。從上述單層細(xì)胞中吸出PBS再重復(fù)洗一次。
立即將200μl經(jīng)稀釋的病毒溶液(10-3到10-9)直接添加到清洗過的CRIB-1細(xì)胞中，每孔用一個(gè)稀釋度，一式兩份。將所述的CRIB-1細(xì)胞與BEV在37℃ 5％ v/v CO2條件下培養(yǎng)1hr，并對(duì)每孔鏡檢細(xì)胞裂解的情況。在每孔中再添加600μl無血清的DMEM。再經(jīng)過24hr后，對(duì)每孔進(jìn)行鏡檢細(xì)胞裂解的情況。正確的稀釋度是可以在24后殺死大部分CRIB-1細(xì)胞，在48hr后殺死全部細(xì)胞的最低病毒濃度。
(c)牛腸道病毒攻擊由pCMV.BEV2.BGI2.2VEB轉(zhuǎn)化的CRIB-1細(xì)胞
用24-孔組織培養(yǎng)板，在每孔800μl DMEM，10％ v/v DCS中接種4×104 CRIB-1細(xì)胞，一式三份。將所述細(xì)胞37℃含5％ v/v CO2下培養(yǎng)直到所述細(xì)胞達(dá)90-100％鋪滿。
由濃縮的BEV病毒貯液，用無血清的DMEM以通過絕對(duì)或經(jīng)驗(yàn)方式確定的正確稀釋度稀釋BEV病毒。另外，將BEV病毒貯液用高于和低于正確稀釋度1個(gè)log值的稀釋度(典型的為10-4到10-6)稀釋。由CRIB-1單層細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基，然后用800μl 1×PBS覆蓋所述的單層細(xì)胞，輕輕晃動(dòng)所述的組織培養(yǎng)容器以洗細(xì)胞。吸出PBS，再重復(fù)洗一次。
立即將200μl經(jīng)稀釋的病毒溶液(每個(gè)平行實(shí)驗(yàn)一個(gè)稀釋度)直接添加到清洗過的CRIB-1細(xì)胞中。將所述的CRIB-1細(xì)胞與BEV在37℃ 5％ v/v CO2條件下培養(yǎng)24hr，并對(duì)每孔鏡檢細(xì)胞裂解的情況。再在每孔中在添加600μl無血清的DMEM。再經(jīng)過24hr后，對(duì)每孔進(jìn)行鏡檢細(xì)胞裂解的情況。
轉(zhuǎn)基因(BEV2.BGI2.2VEB)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)對(duì)于病毒復(fù)制是必需的BEV RNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。BEV RNA聚合酶基因基因沉默誘導(dǎo)抗牛腸道病毒感染。這些細(xì)胞系在病毒存在下繼續(xù)分裂生長(zhǎng)，而對(duì)照細(xì)胞在48hr內(nèi)死亡。將耐受病毒的細(xì)胞進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。
(d)CRIB-1病毒耐受性細(xì)胞系的產(chǎn)生
為確定用pCMV.BEV.EGFP.VEB或pCMV.BEV2.BGI2.2VEB轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是否可以耐BEV感染，用BEV稀釋液侵染轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞系并檢測(cè)細(xì)胞的存活情況。為克服這些實(shí)驗(yàn)的固有差異，進(jìn)行了多個(gè)侵染試驗(yàn)，將一致表現(xiàn)耐病毒性的細(xì)胞分離出來進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表3和4中。
表3 pCMV.BEV.EGFP.VEB轉(zhuǎn)染的CRIB-1細(xì)胞(CRIB-1 EGFP) - 沒有細(xì)胞存活 + 1-10％的細(xì)胞存活 ++ 10-90％的細(xì)胞存活 +++90％+的細(xì)胞存活 nd 未測(cè)
表4 用pCMV.BEV2.BGI2.2VEB轉(zhuǎn)染的CRIB-1細(xì)胞(CRIB-1 BGI2) - 沒有細(xì)胞存活 + 1-10％的細(xì)胞存活 ++ 10-90％的細(xì)胞存活 +++90％+的細(xì)胞存活 nd 未測(cè)
這些數(shù)據(jù)表明耐病毒的細(xì)胞系可以以這種方式定義。另外，能在病毒侵染下存活的細(xì)胞逐漸增長(zhǎng)用于下述實(shí)驗(yàn)。
為進(jìn)一步確定這些細(xì)胞系的病毒耐受程度，細(xì)胞系CRIB-1 BGI2#19，和由在初次侵染(CRIB-1細(xì)胞系BGI2#19(tol))下存活的細(xì)胞長(zhǎng)成的耐病毒細(xì)胞系用更細(xì)比例的系列稀釋的BEV進(jìn)行進(jìn)一步分析。
用部份3(c)中概述的方法，將三倍系列稀釋的BEV用于感染一式三份的細(xì)胞系。結(jié)果列于表5中。
表5 - 轉(zhuǎn)染后48hr沒有細(xì)胞存活 + 轉(zhuǎn)染后48hr 1-10％的細(xì)胞存活。
++轉(zhuǎn)染后48hr 10-90％的細(xì)胞存活。
+++轉(zhuǎn)染后48hr 90％+的細(xì)胞存活。
這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞系CRIB-1 BGI2#19和CRIB-1 BGI2#19(tol)比親本CRIB-1細(xì)胞系能耐受更高滴度的BEV。圖12A，12B和12C是比較CRIB-1和CRIB-1 BGI2#19(tol)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后48hr的顯微照片。
4.核連綴轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)
為檢測(cè)CRIB-1的細(xì)胞核中轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的無細(xì)胞的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。
依照上述實(shí)施例10中所述的核連綴轉(zhuǎn)錄分析方法對(duì)來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB的轉(zhuǎn)基因BEV2.BGI2.2VEB的核RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。
5.未轉(zhuǎn)化的和共抑制的細(xì)胞系中mRNA的比較
依照上述實(shí)施例10中所述的方法分析了相應(yīng)于BEVRNA聚合酶的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因BEV2.BGI2.2VEB轉(zhuǎn)錄的RNA。
6.Southern實(shí)驗(yàn)
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)基因CRIB-1細(xì)胞系以確定轉(zhuǎn)基因的整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例14
體外鼠科動(dòng)物B16型細(xì)胞中酪氨酸酶的共抑制
1.細(xì)胞系的培養(yǎng)
依上述實(shí)施例10中所述，來自鼠科動(dòng)物黑素瘤的B16細(xì)胞(ATCCCRL-6322)用添加了10％ v/v FBS的RPMI 1640培養(yǎng)，長(zhǎng)成貼壁單層細(xì)胞
2.遺傳構(gòu)建體的制備
(a)中間質(zhì)粒
質(zhì)粒TOPO.TYR
如實(shí)施例11所述方法，從所培養(yǎng)的鼠科動(dòng)物B16黑素瘤細(xì)胞中純化總RNA并制備cDNA。
為擴(kuò)增鼠科動(dòng)物酪氨酸酶基因區(qū)域，用2μl這種混合物作為底物利用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
TYR-FGTT TCC AGA TCT CTG ATG GC[SEQ ID NO9]和
TYR-RAGT CCA CTC TGG ATC CTA GG[SEQ ID NO10]。
用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的條件包括起始激活步驟95℃ 15min，接下來在94℃30秒、55℃ 30秒、72℃ 60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后的延長(zhǎng)步驟是在72℃ 4min。
酪氨酸酶的PCR擴(kuò)增區(qū)域用柱純化(PCR純化柱，Qiagen)然后依制造商的說明書(Invitrogen)克隆到pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO中以構(gòu)建質(zhì)粒TOPO.TYR。
(b)測(cè)試質(zhì)粒
質(zhì)粒pCMV.EGFP
質(zhì)粒pCMV.EGFP(圖5)能夠表達(dá)完整的EGFP開放閱讀框，在本實(shí)施例和下面的實(shí)施例中用作陽(yáng)性轉(zhuǎn)染對(duì)照(參見實(shí)施例12，2(b))。
質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2.RYT
質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2.RYT(圖13)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的鼠科動(dòng)物酪氨酸酶基因區(qū)域的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2.RYT通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒TPOP.TYR的TYR序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒TOPO.TYR的TYR序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.TYR.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2.RYT。
質(zhì)粒pCMV.TYR
質(zhì)粒pCMV.TYR(圖14)包含單拷貝的酪氨酸酶cDNA序列，其表達(dá)受CMV啟動(dòng)子的控制。將質(zhì)粒TOPO.TYR上帶有TYR序列的BamHI-到-BglII片段克隆到由BamHI-消化的pCMV.cass中，篩選含有相對(duì)于CMV啟動(dòng)子為有義方向的TYR序列的質(zhì)粒，以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.TYR。
質(zhì)粒pCMV.TYR.TYR
質(zhì)粒pCMV.TYR.TYR(圖15)包含小鼠酪氨酸酶cDNA序列的直接重復(fù)，其表達(dá)受CMV啟動(dòng)子的控制。質(zhì)粒pCMV.TYR.TYR是通過下述方式構(gòu)建的將質(zhì)粒TOPO.TYR的含TYR序列的BamHI-到-BglII片段克隆到用BamHI-消化的pCMV.TYR中，篩選含有第二個(gè)TYR序列(相對(duì)于CMV啟動(dòng)子為有義方向)的質(zhì)粒。
4.共抑制表型的檢測(cè)
(a)向鼠科動(dòng)物黑素瘤B16細(xì)胞插入酪氨酸酶基因區(qū)域通過酪氨酸酶的PTGS減少黑色素形成
酪氨酸酶是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中控制色素形成的主要的酶。如果該基因失活，B16黑素瘤細(xì)胞將不再產(chǎn)生黑色素。這與白化病動(dòng)物中的反應(yīng)過程本質(zhì)上相同。
轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。在每孔的2ml RPMI 1640，10％v/v FBS中接種1×105細(xì)胞并在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)，直到單層細(xì)胞達(dá)60-90％鋪滿，典型地需要16到24hr。
接下來的步驟除了B16細(xì)胞與DNA脂質(zhì)體復(fù)合物僅在37℃ 5％ v/vCO2下培養(yǎng)3到4hr外，同上述實(shí)施例13，3(a)中所述。
如實(shí)施例10的一般技術(shù)中所述對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的B16細(xì)胞單集落進(jìn)行克隆，維持和貯存。
篩選出36個(gè)用pCMV.TYR.BGI2.RYT穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的克隆、34個(gè)用pCMV.TYR穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的克隆、和37個(gè)用pCMV.TYR.TYR穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的克隆進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)內(nèi)源酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)錄后沉默時(shí)，在B16細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素減少。在正常情況下帶有深棕色色素沉淀的B16細(xì)胞表現(xiàn)出淺色素沉淀或無色素沉淀。
(b)在轉(zhuǎn)化的B16細(xì)胞系中可見地監(jiān)測(cè)黑色素的產(chǎn)生
為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中黑色素的含量，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移到含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中以抑制胰蛋白酶的活性。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，再將2×106細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管中。于室溫下2,500rpm離心3min收集細(xì)胞，憑視力檢測(cè)沉淀物。
用pCMV.TYR.BGI2.RYT轉(zhuǎn)化的5個(gè)克隆，即B16.21.11，B163.1.4，B16 3.1.15，B16 4.12.2和B16 4.12.3，比B16對(duì)照蒼白(圖16)。用pCMV.TYR轉(zhuǎn)化的4個(gè)克隆(B16+Tyr2.3，B16+Tyr 2.9，B16+Tyr 3.3，B16+Tyr 3.7和B16+Tyr4.10)和用pCMV.TYR.TYR轉(zhuǎn)化的5個(gè)克隆(B16+TyrTyr 1.1，B16+TyrTyr 2.9，B16+TyrTyr 3.7，B16+TyrTyr 3.13和B16+TyrTyr 4.4)也比B16對(duì)照蒼白得多。
(c)依照Schmorl通過染色鑒定黑色素
用經(jīng)修飾的Schmorl’s黑色素染色方法(Koss，L.G.(1979)Diagnostic Cytology.J.B. Lippincott，Philadelphia)可以特異性診斷細(xì)胞黑色素的存在。用該方法可以通過將黑色素轉(zhuǎn)變成深綠色(greenish-black)色素的特異性染色過程檢測(cè)細(xì)胞中的黑色素。
將待染色的細(xì)胞群以500,000細(xì)胞每ml RPMI 1640培養(yǎng)基的濃度重懸。滴加200μl到表面無菌的顯微鏡載玻片上，將所述玻片置于100mm TC盤中在濕潤(rùn)的空氣中于37℃下孵育，直到細(xì)胞與玻片緊密粘附。去除培養(yǎng)基在加熱塊上于37℃空氣干燥30min以固定細(xì)胞，然后再用PBS中的4％ w/v低聚甲醛(Sigma)后固定1hr。將固定后的細(xì)胞浸潤(rùn)在用蒸餾水配置的96％ v/v乙醇，70％ v/v乙醇，50％ v/v乙醇，然后是蒸餾水中進(jìn)行水合。帶有貼壁細(xì)胞的玻片置于硫酸亞鐵溶液[2.5％ w/v硫酸亞鐵/水]中1hr，然后用蒸餾水沖洗4次，每次1min。再將所述玻片置于高鐵氰化鉀溶液[1％(w/v)高鐵氰化鉀在1((v/v)乙酸的蒸餾水溶液中]中30min。所述玻片浸潤(rùn)于1％ v/v乙酸(浸15下)然后浸于蒸餾水中(浸15下)。
細(xì)胞在Nuclear Fast Red制劑[在5％ w/v硫酸銨水溶液中加熱溶解0.1％ w/v Nuclear Fast Red(C.I.60760 Sigma N 8002)]中染色1-2min。在玻片上固定并染色的細(xì)胞浸潤(rùn)于蒸餾水中清洗(浸15下)。將蓋玻片蓋在于甘油/DABCO[在含80％ v/v甘油的PBS液中含25mg/ml DABCO(1，4-二氮雜二環(huán)(2.2.2)辛烷(Sigma D2522))]中的載玻片上。用100x油浸物鏡通過亮視野檢測(cè)細(xì)胞。
對(duì)所有細(xì)胞，通過Schmorl’s染色的結(jié)果與經(jīng)簡(jiǎn)單觀察的數(shù)據(jù)(如圖16所示)相關(guān)。當(dāng)用上述方法對(duì)B16細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，在大部分細(xì)胞中黑色素均很明顯。相反，在轉(zhuǎn)化系B16 2.1.11，B16 3.1.4，B16 3.1.15，B16 4.12.2，B16 4.12.3，B16 Tyr 2.3，B16Tyr 2.9，B16 Tyr 4.10，B16 TyrTyr 1.1，B16 TyrTyr 2.9和B16 TyrTyr 3.7中幾乎沒有細(xì)胞表現(xiàn)出黑色素染色，這與在這些細(xì)胞系中所觀察到的總酪氨酸酶活性降低相一致。
(d)在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中分析酪氨酸酶的酶活性
酪氨酸酶催化黑色素合成的頭兩步酪氨酸羥基化成多巴(二羥苯基丙氨酸)，多巴氧化成多巴醌。可通過測(cè)定多巴氧化酶活性測(cè)定酪氨酸酶。這一實(shí)驗(yàn)用Besthorn腙(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽，MBTH)捕獲L-多巴氧化形成的多巴醌。在反應(yīng)混合物中低濃度N，N’-二甲基甲酰胺的存在使MBTH可溶解，該方法可在一定范圍的pH下使用。通過Michael加成反應(yīng)MBTH與多巴醌反應(yīng)形成可由分光光度計(jì)或平板讀數(shù)儀監(jiān)測(cè)的深粉紅色的產(chǎn)物。可以認(rèn)為MBTH與多巴醌的反應(yīng)相對(duì)于酶-催化的L-多巴氧化來說相當(dāng)迅速。產(chǎn)生粉紅色素的速率可用于定量測(cè)定酶活性(Winder和Harris，1991；Dutkiewicz等，2000)。
B16細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的B16細(xì)胞系置于96-孔板的各孔中，一式三份。恒量的細(xì)胞(25,000)加入各孔中并將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)24或48hr后如下述進(jìn)行酪氨酸酶實(shí)驗(yàn)。
每孔用200μl PBS洗，然后每孔加入20μl于50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.9)中的0.5％ v/v Triton X-100。通過下述凍-融操作使細(xì)胞裂解和溶解-70℃ 30min，接著于室溫下25min和37℃下5min孵育。
向每孔添加190μl新鮮配制的分析緩沖液(6.3mM MBTH，1.1mML-多巴，4％ v/v N，N’-二甲基甲酰胺于48mM磷酸鈉緩沖液(pH7.1)中)以分析酪氨酸酶活性。在Tecan板讀數(shù)儀中于505nm下監(jiān)測(cè)顏色的形成用X/Scan軟件收集數(shù)據(jù)。以恒定的時(shí)間間隔讀數(shù)，于室溫下，典型地為22℃下監(jiān)測(cè)反應(yīng)。計(jì)算所測(cè)定的三個(gè)平行樣品的平均酶活性。分析數(shù)據(jù)，在產(chǎn)物線性形成的早期時(shí)間點(diǎn)(典型地為2到12min之間)，估計(jì)酪氨酸酶活性。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于下述表6和7中。
表6
表7
這些數(shù)據(jù)表明酪氨酸酶的酶活性在用構(gòu)建體pCMV.TYR.BGI2.RYT，pCMV.TYR和pCMV.TYR.TYR轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中受到抑制。
4.核連綴轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)
為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因RNA在B16細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的無細(xì)胞的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。
依照上述實(shí)施例10中所述的核連綴轉(zhuǎn)錄分析方法對(duì)來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2.RYT的轉(zhuǎn)基因TYR.BGI2.RYT和內(nèi)源酪氨酸酶基因的核RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。
為評(píng)估在B16細(xì)胞和轉(zhuǎn)化系B163.1.4和B16 Tyr Tyr 1.1中內(nèi)源酪氨酸酶基因轉(zhuǎn)錄速率，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的細(xì)胞核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。用實(shí)施例10概述的方法，連綴轉(zhuǎn)錄本用生物素標(biāo)記，并用鏈霉親合素捕獲物進(jìn)行純化。
為確定上述細(xì)胞中內(nèi)源酪氨酸酶基因的轉(zhuǎn)錄速率，用實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)對(duì)由核連綴轉(zhuǎn)錄分析實(shí)驗(yàn)中分離出的生物素標(biāo)記的酪氨酸酶轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量。內(nèi)源酪氨酸酶基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄速率通過將生物素標(biāo)記的酪氨酸酶RNA的水平與普遍表達(dá)的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，即鼠科動(dòng)物磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的水平比較進(jìn)行評(píng)估。
內(nèi)源酪氨酸酶和小鼠GAPDH基因的表達(dá)水平通過重復(fù)PCR反應(yīng)確定。為對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行定量地解釋，用由B16細(xì)胞分離的經(jīng)寡dT-純化的RNA制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Dynabeads mRNA DIRECT Micro試劑盒依照制造商的建議(Dynal)進(jìn)行寡dT-純化。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表8中。
表8
這些數(shù)據(jù)清楚地表明在兩個(gè)分別用pCMV.TYR.BGI2.RYT和pCMV.TYR.TYR轉(zhuǎn)化的沉默的B16細(xì)胞系B16 3.1.4和B16 TyrTyr1.1的核中內(nèi)源酪氨酸酶基因的轉(zhuǎn)錄速率與未轉(zhuǎn)化的B16細(xì)胞核中的酪氨酸酶基因的轉(zhuǎn)錄速率沒有明顯的差異。
5.在未轉(zhuǎn)化的和共抑制的細(xì)胞系中mRNA的比較
依照上述實(shí)施例10中所述的方法分析了內(nèi)源酪氨酸酶的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因TYR.BGI2.RYT轉(zhuǎn)錄的RNA。
為精確地評(píng)估在B16和轉(zhuǎn)化系中的酪氨酸酶mRNA水平而進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于表9中
表9
這些數(shù)據(jù)清楚地表明，在兩個(gè)沉默的B16細(xì)胞系B16 3.1.4和B16 TyrTyr 1.1(分別用pCMV.TYR.BGI2.RYT和pCMV.TYR.TYR轉(zhuǎn)化的)中酪氨酸酶mRNA的水平(作為poly(A)RNA)與未轉(zhuǎn)化的B16細(xì)胞中的酪氨酸酶mRNA水平?jīng)]有顯著的差異。
6.Southern分析
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)基因B16細(xì)胞系以確定整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例15
在Mus肌肉株C57BL/6和C57BL/6×DB1雜合體中酪氨酸酶的
體內(nèi)共抑制
1.構(gòu)建體的制備
所述的中間質(zhì)粒TOPO.TYR和測(cè)試質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2. RYT如上述實(shí)施例14中所述進(jìn)行制備。
2.轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
通過對(duì)受精卵的原核進(jìn)行遺傳修飾產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。將受精卵從輸卵管中分離出來后置于注射顯微鏡上，將以純化的DNA溶液形式存在的轉(zhuǎn)基因注射到最可見的原核中(U.S.專利No.4,873,191)。
通過誘導(dǎo)模擬受孕的激素階段產(chǎn)生假孕的雌鼠作為“受體母親”。經(jīng)過注射的受精卵或培養(yǎng)過夜以評(píng)估其存活力，或直接轉(zhuǎn)回到假孕受體的輸卵管中。在421個(gè)已注射的受精卵中轉(zhuǎn)移了255個(gè)。通過上述注射所形成的轉(zhuǎn)基因子代稱作“基鼠(founder)”。為確定轉(zhuǎn)基因是否已整合到小鼠基因組中，斷奶后確定了子代的基因型。確定基因型是通過對(duì)從尾活檢組織純化的基因組DNA進(jìn)行PCR和/或Southern印跡進(jìn)行的。
使基鼠進(jìn)行交配開始建立轉(zhuǎn)基因系。由于每一譜系在轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和染色體定位方面均不同，因此基鼠和其子代維持不同的血統(tǒng)。通過原核注射產(chǎn)生的每一轉(zhuǎn)基因小鼠都是一個(gè)新種的基鼠。如果所述的基鼠是雌鼠，則分析了一些由該基鼠產(chǎn)生的第一窩子鼠的轉(zhuǎn)基因傳遞情況。
3.共抑制表型的檢測(cè)
成功轉(zhuǎn)基因的小鼠的可見變化是皮毛顏色的改變。通過標(biāo)準(zhǔn)的方法(Bennett等，1989；Spanakis等，1992；Sviderskaya etal.，1995)從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得皮膚細(xì)胞活檢組織，并作為黑色素細(xì)胞的原代培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。
剃除成年小鼠進(jìn)行活組織檢查部分的毛，用70％ v/v乙醇進(jìn)行皮膚表面消毒，然后用PBS沖洗。在無菌條件下移出待進(jìn)行活組織檢查的部分。對(duì)新生小鼠進(jìn)行取樣是在處死動(dòng)物后進(jìn)行的，將所述樣品用70％v/v乙醇消毒再用PBS沖洗。在無菌條件下解剖皮膚樣品。
所有的活檢組織均貯藏于6-孔板的PBS中。為獲得單細(xì)胞懸浮液，用移液管移去PBS，將皮膚樣品用解剖刀切成小塊(2×5mm)然后在2x胰蛋白酶(5mg/ml)PBS中于37℃下孵育約1hr(對(duì)于新生樣品)，和在1x胰蛋白酶(2.5mg/ml)中于4℃孵育多達(dá)15hr(對(duì)于成熟的皮膚樣品)(0.5g在2.5ml中)。這一消化使表皮和真皮相分離。用RPMI 1640培養(yǎng)基替換胰蛋白酶以終止酶活性。用細(xì)鑷子(無菌的)分離每一片表皮，收集分離的表皮樣品合并于1x胰蛋白酶的PBS液中。通過抽吸制備單細(xì)胞懸液，將已分離的細(xì)胞收集在RPMI1640培養(yǎng)基中。可將表皮樣皮重復(fù)用胰蛋白酶消化。稍離心(1000rpm，3min)濃縮匯合的表皮細(xì)胞，再將細(xì)胞重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基[RPMI 1640加有5％ v/v FBS，2mML-谷氨酰胺，20單位/ml青霉素，20μg/ml鏈霉素加13-乙酸12-肉豆蔻佛波醇(PMA)10ng/ml(16nM)和霍亂毒素(CTX)20ng/ml(1.8nM)]。將懸液轉(zhuǎn)移到T25培養(yǎng)瓶在沒有擾動(dòng)的條件下培養(yǎng)48hr。更換培養(yǎng)基并在48hr時(shí)去除未貼壁的細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)48-72后棄去培養(yǎng)基，將貼壁的細(xì)胞用PBS洗滌，由1x胰蛋白酶的PBS處理。經(jīng)過此種處理后，黑素細(xì)胞首先分離開，將已分離開的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新燒瓶中的新鮮培養(yǎng)基中。
由形態(tài)可以容易地將組織培養(yǎng)中的黑素細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞區(qū)分開。角質(zhì)細(xì)胞具有圓或多角的外形；黑素細(xì)胞為兩極或分枝狀。黑素細(xì)胞可由Schmorl’s法(參見實(shí)施例14，見上)染色以檢測(cè)黑色素顆粒。另外，可以利用鼠科動(dòng)物對(duì)MART-1(NeoMarkers MS-614)的單克隆抗體為一抗通過免疫熒光標(biāo)記(參見實(shí)施例10，見上)檢測(cè)在蓋玻片上生長(zhǎng)的培養(yǎng)物樣品，所述的MART-1是一種在黑素體中發(fā)現(xiàn)的抗原。這一抗體不與上皮細(xì)胞，淋巴細(xì)胞或間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)。
4.核連綴轉(zhuǎn)錄分析
為檢測(cè)酪氨酸酶內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)基因RNA在原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞的核中的轉(zhuǎn)錄，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的無細(xì)胞的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。
依照上述實(shí)施例10中所述的核連綴轉(zhuǎn)錄分析方法對(duì)酪氨酸酶內(nèi)源基因和來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV.TYR.BGI2.RYT的轉(zhuǎn)基因的核RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。
5.在未轉(zhuǎn)化的和共抑制的細(xì)胞系中mRNA的比較
依照上述實(shí)施例10中所述的方法分析了內(nèi)源酪氨酸酶的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因TYR.BGI2.RYT轉(zhuǎn)錄的RNA。
6.Southern分析
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析原代培養(yǎng)的黑素細(xì)胞系以確定整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例16
在Mus肌肉株C57BL/6中α-1，3，-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)的體
內(nèi)共抑制
1.遺傳構(gòu)建體的制備
(a)質(zhì)粒TOPO.GALT
如實(shí)施例11中所述方法，從所培養(yǎng)的鼠科動(dòng)物2. 3D17神經(jīng)細(xì)胞純化總RNA，并制備cDNA。
用2μl此種混合物作為底物，用下述引物通過PCR擴(kuò)增鼠科動(dòng)物α-1，3，-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)基因的3’-UTR
GALT-F2CAC AGA CAG ATC TCT TCA GG[SEQ ID NO11]和
GALT-R1ACT TTA GAC GGA TCC AGC AC[SEQ ID NO12]。
PCR擴(kuò)增使用HotStar Taq DNA聚合酶按廠家說明書(Qia gen)進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件包括最初的激活步驟95℃15min，接下來在94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后的延長(zhǎng)步驟是在72℃4min。
GalT的PCR擴(kuò)增區(qū)域用柱純化(PCR純化柱，Qiagen)然后依制造商的建議(Invitrogen)克隆到pCR2.1-TOPO中以構(gòu)建質(zhì)粒TOPO.GALT。
(b)檢測(cè)質(zhì)粒
質(zhì)粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG
質(zhì)粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG(圖17)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的鼠科動(dòng)物GalT基因3’UTR的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒質(zhì)粒TOPO.GALT的GALT序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.GALT.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒TOPO.GALT的GALT序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.GALT.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG。
2.轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
通過對(duì)受精卵的原核進(jìn)行遺傳修飾產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。將受精卵從輸卵管中分離出來后置于注射顯微鏡上，將以純化的DNA溶液形式存在的轉(zhuǎn)基因注射到最可見的原核中(U.S.Patent No.4,873,191)。
通過誘導(dǎo)模擬受孕的激素階段產(chǎn)生假孕的雌鼠作為“受體母親”。經(jīng)過注射的受精卵或培養(yǎng)過夜以評(píng)估其存活力，或直接轉(zhuǎn)回到假孕受體的輸卵管中。在99個(gè)已注射的受精卵中轉(zhuǎn)移了25個(gè)。通過上述注射所形成的轉(zhuǎn)基因子代稱作“基鼠”。為確定轉(zhuǎn)基因是否已整合到小鼠基因組中，斷奶后確定了子代的基因型。確定基因型是通過對(duì)從活檢組織中純化的基因組DNA進(jìn)行PCR和/或Southern印跡進(jìn)行的。
使基鼠進(jìn)行交配開始建立轉(zhuǎn)基因系。由于每一譜系在轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和染色體定位方面均不同，因此基鼠和其子代維持不同的血統(tǒng)。通過原核注射產(chǎn)生的每一轉(zhuǎn)基因小鼠都是一個(gè)新種的基鼠。如果所述的基鼠是雌鼠，則分析了一些由該基鼠產(chǎn)生的第一窩子鼠的轉(zhuǎn)基因傳遞情況。
3.共抑制表型的檢測(cè)
所述的α-1，3，-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GalT)催化將半乳糖殘基添加到除人和其它靈長(zhǎng)目之外的所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白上。由GalT的作用造成的表位是負(fù)責(zé)人體中異體移植(xenotransplants)排斥的主要抗原。用FACS對(duì)外周血白細(xì)胞(PBL)和脾細(xì)胞中的GalT表達(dá)水平的細(xì)胞學(xué)分析確證了基因活性的下調(diào)。
通過FACS對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的外周血白細(xì)胞和脾細(xì)胞的分析
為分析用GalT構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因小鼠的細(xì)胞，對(duì)外周血白細(xì)胞(PBL)和脾細(xì)胞進(jìn)行了FACS分析。白細(xì)胞是最方便用于分析的組織來源其可由PBL或脾細(xì)胞中分離獲得。為分離PBL，將小鼠從眼部放血，收集50到100μl血液到肝素化管中。所述的紅細(xì)胞(RBCs)通過NH4Cl緩沖液(0.168M)的處理而裂解，回收PBL。
為獲得脾細(xì)胞，將動(dòng)物安樂死，取出脾臟浸潤(rùn)并如上述裂解RBCs。將產(chǎn)生的脾細(xì)胞在體外于白介素-2(IL-2；Sigma)存在下培養(yǎng)以產(chǎn)生短期T培養(yǎng)物。所述的細(xì)胞用4％ w/v PFA的PBS固定。所有的操作步驟均在冰上進(jìn)行。GalT活性最適宜通過能與細(xì)胞表面蛋白的半乳糖殘基特異結(jié)合的植物凝集素(IB4；Sigma)進(jìn)行分析。通過結(jié)合與生物素偶聯(lián)的IB4，在細(xì)胞表面檢測(cè)GalT。用與Cy5熒光團(tuán)偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白處理所述的白細(xì)胞。另一細(xì)胞標(biāo)記，T特異的糖蛋白Thy-1用異硫氰酸熒光素-偶聯(lián)抗體(FITC；Sigma)標(biāo)記。所述的白細(xì)胞與上述試劑混合物一起溫育30min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。清洗后，所述細(xì)胞在FACScan上進(jìn)行分析(Tearle，R.G.等，1996)。
4.核連綴轉(zhuǎn)錄分析
為檢測(cè)脾細(xì)胞核中轉(zhuǎn)基因RNA的轉(zhuǎn)錄，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的無細(xì)胞的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。脾細(xì)胞在體外于白介素-2(IL-2；Sigma)存在下培養(yǎng)以產(chǎn)生短期T培養(yǎng)物。所述的核是依照上述實(shí)施例10中用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物的核分離方法獲得的。
依照上述實(shí)施例10中所述的核連綴轉(zhuǎn)錄分析方法對(duì)GalT內(nèi)源基因和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG的轉(zhuǎn)基因的核RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。
5.未轉(zhuǎn)化和共抑制的細(xì)胞系中的mRNA的比較
依照上述實(shí)施例10中所述的方法分析了內(nèi)源GalT的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因GALT.BGI2.TLAG轉(zhuǎn)錄的RNA。
6.Southern實(shí)驗(yàn)
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)基因脾細(xì)胞系以確定整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例17
體外NIH/3T3細(xì)胞中小鼠胸苷激酶的共抑制
細(xì)胞通過兩條途徑-從頭合成途徑或補(bǔ)救途徑產(chǎn)生核糖核酸和脫氧核糖核酸。從頭合成途徑是從簡(jiǎn)單化合物如氨基酸，糖，CO2和NH3裝配核苷酸。嘌呤和嘧啶核苷酸的各自前體肌苷5’一磷酸鹽(IMP)和尿苷5’一磷酸鹽(UMP)最初是通過該途徑產(chǎn)生的。IMP和胸苷5’一磷酸鹽(TMP)的從頭合成需要四氫葉酸衍生物作為輔因子，并且這些核苷酸的從頭合成受抑制二氫葉酸還原酶的抗葉酸氨基蝶呤的阻斷。補(bǔ)救途徑是指將游離的已形成的嘌呤堿基或胸苷轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的核苷單磷酸(NMP)的酶促反應(yīng)。當(dāng)從頭合成途徑受阻時(shí)，若培養(yǎng)基中存在預(yù)形成的堿基則補(bǔ)救酶可使細(xì)胞存活。
正常情況下哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)幾種補(bǔ)救酶，包括可將胸苷轉(zhuǎn)化成TMP的胸苷激酶(TK)。藥物5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU；Sigma)可選擇缺乏TK的細(xì)胞。含有功能性TK的細(xì)胞中，所述的酶將上述藥物的類似物轉(zhuǎn)化或相應(yīng)的5’一磷酸鹽，當(dāng)其整合到DNA中后即成為致命因子。相反，無TK表達(dá)的細(xì)胞不能在含氨基喋呤和胸苷的HAT培養(yǎng)基(Life Technologies)上生長(zhǎng)。上述補(bǔ)充的第一個(gè)因子阻斷了NMP的從頭合成途徑，第二個(gè)因子提供了TK補(bǔ)救途徑的底物，因此具有完整的該途徑的細(xì)胞可以存活。
1.NIH/3T3細(xì)胞系的培養(yǎng)
鼠科動(dòng)物成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系NIH/3T3(ATCC CRL-1658)的細(xì)胞如上述實(shí)施例10中所述在添加了10％ v/v FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中生長(zhǎng)成為貼壁單層細(xì)胞。細(xì)胞按常規(guī)在37℃含5％ v/v CO2的空氣中生長(zhǎng)。
2.遺傳構(gòu)建體的制備(a)中間質(zhì)粒
質(zhì)粒TOPO.MTK
用鼠科動(dòng)物cDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增鼠科動(dòng)物胸苷激酶基因區(qū)域。所述的cDNA由自鼠科動(dòng)物黑素瘤細(xì)胞系B16中分離的總RNA制備。所述的總RNA按上述實(shí)施例14中所述進(jìn)行純化。用下述引物擴(kuò)增鼠科動(dòng)物胸苷激酶序列
MTK1AGA TCT ATT TTT CCA CCC ACG GAC TCT CGG[SEQ IDNO13]和
MTK4GGA TCC GCC ACG AAC AAG GAA GAA ACT AGC[SEQ IDNO14]。
將上述擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCR(注冊(cè)商標(biāo))2. 1-TOPO以構(gòu)建中間克隆TOPO.MTK。
(b)檢測(cè)質(zhì)粒
質(zhì)粒DCMV MTK.BG12.KTM
質(zhì)粒pCMV.MTK.BGI2.KTM(圖18)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的鼠科動(dòng)物胸苷激酶編碼區(qū)的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCMV.MTK.BGI2.KTM通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒TOPO.MTK的MTK序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2.cass(實(shí)施例11)以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.MTK.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒TOPO.MTK的MTK序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.MTK.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.MTK.BGI2.KTM。
3.共抑制表型的檢測(cè)
(a)將表達(dá)TK的轉(zhuǎn)基因插入到NIH/3T3細(xì)胞中
轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。在每孔的2ml DMEM，10％ v/vFBS中接種1×105細(xì)胞并在37℃5％ v/v CO2下培養(yǎng)，直到單層細(xì)胞達(dá)60-90％鋪滿，典型地需要16到24hr。
接下來的步驟除了NIH/3T3細(xì)胞與DNA脂質(zhì)體復(fù)合物僅在37℃ 5％v/v CO2下培養(yǎng)3到4hr外，同上述實(shí)施例13，3(a)中所述。
(b)在NIHl3T3細(xì)胞中小鼠TK基因的轉(zhuǎn)錄后沉默
具有PTGS的TK的NIH/3T3細(xì)胞能夠耐受在其正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中添加100μg/ml的BrdU(NeoMarkers)，并在這種情況下繼續(xù)復(fù)制。經(jīng)過類似處理的對(duì)照NIH/3T3細(xì)胞群停止復(fù)制，在含BrdU的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7天后，細(xì)胞數(shù)不再增加。對(duì)照NIH/3T3細(xì)胞能夠在添加了1xHAT的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中復(fù)制，而在此種條件下TK發(fā)生PTGS的細(xì)胞不能生長(zhǎng)。TK發(fā)生PTGS的再一證據(jù)是通過利用直接針對(duì)BrdU的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光染色(參見實(shí)施例10，見上)以檢測(cè)細(xì)胞核中的BrdU整合而獲得的。符合所有標(biāo)準(zhǔn)的克隆(i)抵抗BrdU的致命作用；(ii)失去了核苷酸補(bǔ)救途徑，和(iii)在核中沒有BrdU整合-經(jīng)核連綴轉(zhuǎn)錄分析對(duì)PTGS進(jìn)行直接檢測(cè)。
4.核連綴轉(zhuǎn)錄分析
為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因RNA在NIH/3T3細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的無細(xì)胞的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。
依照上述實(shí)施例10中所述的核連綴轉(zhuǎn)錄分析方法對(duì)來自轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV.MTK.BGI2.KTM的轉(zhuǎn)基因MTK.BGI2.KTM和內(nèi)源TK基因的核RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。
5.未轉(zhuǎn)化和共抑制的細(xì)胞系中的mRNA的比較
依照上述實(shí)施例10中所述的方法分析了內(nèi)源TK的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因MTK.BGI2.KTM轉(zhuǎn)錄的RNA。
6.Southern實(shí)驗(yàn)
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)基因NIH/3T3細(xì)胞系以確定整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例18
體外MDA-MB-468細(xì)胞中的HER-2共抑制
HER-2(也稱作neu和erbB-2)編碼185kDa的以低水平被組成型激活的跨膜受體酪氨酸激酶，當(dāng)其過表達(dá)時(shí)表現(xiàn)潛在的致癌活性。HER-2蛋白過表達(dá)在約30％侵襲性人乳腺癌中出現(xiàn)。HER-2的生物功能并不十分清楚。其與表皮生長(zhǎng)因子受體家族的其他成員具有共同的組織結(jié)構(gòu)，并可以參與相似信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重組，細(xì)胞移動(dòng)，蛋白酶表達(dá)和細(xì)胞粘附方面的改變。HER-2在乳腺癌細(xì)胞中的過表達(dá)導(dǎo)致瘤性，侵染性和轉(zhuǎn)移潛力的提高(Slamon等，1987)。
1.細(xì)胞系的培養(yǎng)
人MDA-MB-468細(xì)胞在添加了10％ v/v FBS的RPMI 1640中培養(yǎng)。通過胰蛋白酶處理打散細(xì)胞，將一定比例的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中以使細(xì)胞每周傳代兩次，如上述實(shí)施例10中所述。
2.遺傳構(gòu)建體的制備
(a)中間質(zhì)粒
質(zhì)粒TOPO.HER-2
用人cDNA作為模板通過PCR擴(kuò)增人HER-2基因區(qū)域。所述的cDNA是從由人乳腺腫瘤細(xì)胞系SK-BR-3分離的總RNA制備的。所述的總RNA如上述實(shí)施例14所述進(jìn)行純化。人HER-2序列用下述引物擴(kuò)增
H1CTC GAG AAG TGT GCA CCG GCA CAG ACA TG[SEQ ID NO15]和
H3GTC GAC TGT GTT CCA TCC TCT GCT GTC AC[SEQ ID NO16]。
將所述的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCR(注冊(cè)商標(biāo))2. 1-TOPO中以構(gòu)建中間克隆TOPO.HER-2。
(b)檢測(cè)質(zhì)粒
質(zhì)粒pCMV.HER2.BGI2.2REH
質(zhì)粒pCMV.HER2.BGI2.2REH(圖19)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的HER-2b編碼區(qū)域的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCMV.HER2.BGI2.2REH通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒TOPO.HER2的HER-2序列以SalI/XhoI片段按有義方向亞克隆到用SalI-消化的pCMV.BGI2.cass(實(shí)施例11)以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.HER2.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒TOPO.HER2的HER2序列以SalI/XhoI片段按反義方向亞克隆到用XhoI-消化的pCMV.HER2.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.HER2.BGI2.2REH。
4.共抑制起始的確定
(a)HER-2構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。在每孔的2ml RPMI1640培養(yǎng)基，10％ v/v FBS中接種4×105 MDA-MB-468細(xì)胞并在37℃ 5％ v/vCO2下培養(yǎng)，直到單層細(xì)胞達(dá)60-90％鋪滿，典型地需要16到24hr。
接下來的步驟除了MDA-MB-468細(xì)胞與DNA脂質(zhì)體復(fù)合物僅在37℃5％ v/v CO2下培養(yǎng)3到4hr外，同上述實(shí)施例13，3(a)中所述。分離出36個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。
(b)MDA-MB-468細(xì)胞中的HER-2的轉(zhuǎn)錄后沉默
MDA-MB-468細(xì)胞過表達(dá)HER-2，該基因在由這一細(xì)胞系衍生的由遺傳霉素-選擇的克隆中的PTGS首先利用直接針對(duì)HER-2蛋白細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的鼠科動(dòng)物單克隆抗體(Transduction Laboratories和NeoMarkers)作為-抗通過免疫熒光標(biāo)記克隆(參見實(shí)施例10，見上)進(jìn)行檢測(cè)。用抗-HER-2抗體通過western印跡實(shí)驗(yàn)(見下)比較(i)MDA-MB-468細(xì)胞；(ii)明顯表現(xiàn)出該基因PTGS的克隆，和(iii)對(duì)照人細(xì)胞系中的HER-2蛋白的水平。完全符合標(biāo)準(zhǔn)，即缺乏HER-2蛋白表達(dá)的克隆通過核連綴轉(zhuǎn)錄分析對(duì)PTGS進(jìn)行直接檢測(cè)。
為分析MDA-MB-468細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中HER-2的表達(dá)，細(xì)胞如實(shí)施例10中所述利用免疫熒光標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。所述的一抗是小鼠抗-erbB2單克隆抗體(Transduction Laboratories，Cat.No.E19420，一種IgG2b同種型)，以1/400稀釋使用；二抗是AlexaFluor 488羊抗-鼠IgG(H+L)偶聯(lián)物(Molecular Probes，Cat.No.A-11001)，以1/100稀釋使用。作為陰性對(duì)照，MDA-MB-468細(xì)胞(親本和轉(zhuǎn)化系)僅用Alexa Fluor 488羊抗-鼠IgG(H+L)偶聯(lián)物探測(cè)。
發(fā)現(xiàn)幾種用pCMV.HER2.BGI2.2REH轉(zhuǎn)化的MDA-MB-468細(xì)胞系免疫熒光降低，其實(shí)例如圖20A，20B，20C和20D所示。
(c)FACS分析以定義Her-2表達(dá)降低的細(xì)胞系
為確定轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中HER-2的表達(dá)水平，將在6-孔板中生長(zhǎng)的約500,000細(xì)胞用1×PBS洗兩次，然后用500μl細(xì)胞離散溶液(Sigma C 5789)依制造商的建議(Sigma)分散。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到微離心管中的培養(yǎng)基中，經(jīng)2,500rpm離心3min收集細(xì)胞。棄上清將細(xì)胞重懸于1ml 1×PBS中。
為固定，如上所述通過離心收集細(xì)胞并懸浮于50μl PBA(1×PBS，0.1％ w/v BSA組分V(痕量)和0.1％w/v疊氮化鈉)，接下來添加250μl 4％ w/v低聚甲醛的1×PBS，在4℃下培養(yǎng)10min。為透化細(xì)胞，通過10,000rpm離心30秒收集細(xì)胞，棄上清，將細(xì)胞懸浮于50μl 0.25％ w/v皂苷(Sigma S 4521)的PBA中，于4℃下孵育10min。為封閉細(xì)胞，通過10,000rpm離心30sec收集細(xì)胞，棄上清，將細(xì)胞懸浮于50μl PBA，1％ v/v FBS，在4℃下培養(yǎng)10min。
為對(duì)HER-2蛋白進(jìn)行定量，經(jīng)固定、透化的細(xì)胞用1/100稀釋的抗-erbB2單克隆抗體(Transduction Laboratories)，然后用1/100稀釋的Alexa Fluor 488羊抗-鼠IgG偶聯(lián)物(分子探針)探測(cè)。然后用Becton Dickinson FACSCalibur和Cellquest軟件(Becton Dickinson)通過FACS分析細(xì)胞。為估計(jì)真實(shí)的背景熒光值，用均為1/100稀釋的無關(guān)的一抗 (MART-1，一種IgG2b抗體(NeoMarkers))和所述的Alexa Fluor 488二抗對(duì)未染色的MDA-MB-468細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。FACS數(shù)據(jù)的實(shí)例如圖21A，21B和21C所示。對(duì)所有細(xì)胞系的分析結(jié)果匯編于表10。
表10
″MDA-MB-468對(duì)照1″是未經(jīng)一抗和二抗染色的MDA-MB-468細(xì)胞?！錗DA-MB-468對(duì)照2″是用無關(guān)一抗MART-1和Alexa Fluor 488二抗染色的MDA-MB-468細(xì)胞。其他的所有細(xì)胞，如上，是用抗-erbB2一抗和Alexa Fluor 488二抗染色的。
這些數(shù)據(jù)表明，用pCMV.HER2.BGI2.2REH轉(zhuǎn)化的MDA-MB-468細(xì)胞中HER-2蛋白表達(dá)水平顯著下降了。
4.核連綴轉(zhuǎn)錄分析
為檢測(cè)轉(zhuǎn)基因RNA在MDA-MB-468細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的無細(xì)胞的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。
依照上述實(shí)施例10中所述的核連綴轉(zhuǎn)錄分析方法對(duì)轉(zhuǎn)基因HER2.BGI2. 2REH和內(nèi)源HER-2基因的核RNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。
5.未轉(zhuǎn)化和共抑制的細(xì)胞系中的mRNA的比較
依照上述實(shí)施例10中所述的方法分析了內(nèi)源HER-2基因的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因HER2.BGI2. 2REH轉(zhuǎn)錄的RNA。
6.Southern實(shí)驗(yàn)
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)基因NIH/3T3細(xì)胞系以確定整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。
7.Western印跡分析
將選擇的克隆和對(duì)照MDA-MB-468細(xì)胞培養(yǎng)過夜至接近鋪滿100mmTC板(107細(xì)胞)。將板中的細(xì)胞首先用含磷酸酶抑制劑的緩沖液(50mM Tris-HCl pH6.8，1mM Na4P2O7，10mM NaF，20μM Na2MoO4，1mM Na3VO4)清洗，然后用已加熱到100℃的600μl裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH 6.8，1mM Na4P2O7，10mM NaF，20μM Na2MoO4，1mM Na3VO4，2％ w/v SDS)將細(xì)胞從板上刮下。將所得懸液在帶蓋的螺口管中于100℃下處理15min。帶有裂解細(xì)胞的管于13,000rpm離心10min；將上清提取物吸出在-20℃下貯存。
在Protean裝置(BioRad)中用29∶1丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺(Bio-Rad)和Tris-HCl緩沖液(分別在pH8.8和6.8)制備SDS-PAGE 10％ v/v分離膠和5％ v/v濃縮膠(0.75mm)。60μl體積的抽提物結(jié)合20μl 4x上樣緩沖液(50mM Tris-HCl pH6.8，2％w/v SDS，40％ v/v甘油，溴酚藍(lán)和400mM二硫蘇糖醇，使用前添加)在100℃下加熱5min，冷卻后上樣到孔中，用120V電壓在寒冷的房間里電泳使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后換為240V電壓。依制造商提供的方法通過電印跡(Bio-Rad)將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到Hybond-ECL硝酸纖維膜(Amersham)上。
將上述膜在TBST緩沖液(10mM Tris-HCl pH8.0，150mMNaCl，0.05％ v/v Tween20)中漂洗后在含TBST的平皿中用5％w/v脫脂奶粉加磷酸酶抑制劑(1mM Na4P2O7，10mM NaF，20uM Na2MoO4，1mM Na3VO4)封閉。所述的膜在小體積的TBST(含1∶4000稀釋的抗HER-2的ECD的小鼠單克隆抗體(Transduction Laboratories，NeoMarkers)、2.5％w/v脫脂奶粉加磷酸酶抑制劑)中孵育。將膜在含2.5％w/v 脫脂奶粉加磷酸酶抑制劑的TBST中洗三次，10min。所述的膜在小體積的TBST(含1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗、2.5％ w/v脫脂奶粉加磷酸酶抑制劑)中孵育。將膜在TBST中(含2.5％w/v 脫脂奶粉加磷酸酶抑制劑)洗三次，10min。
依制造商提供的方法用基于ECL氨基苯二酰一肼的系統(tǒng)(Amersham)檢測(cè)HER-2蛋白的存在。將膜上探針剝離以便進(jìn)行第二對(duì)照蛋白的檢測(cè)，方式是將膜在100ml剝離緩沖液(62mM Tris-HClpH 6.7，2％w/v SDS，100mM新鮮配置的2-巰基乙醇)55℃下處理30min。
實(shí)施例19
體外MM96L黑素瘤細(xì)胞中Brn-2的共抑制
Brn-2轉(zhuǎn)錄因子屬于一類DNA結(jié)合蛋白，稱作Oct因子，其可特異性的與八聚體控制序列ATGCAAAT相互作用。所有的Oct-因子屬于原本根據(jù)對(duì)序列特異性的高親和力的DNA結(jié)合至關(guān)重要的保守區(qū)域，稱作POU結(jié)構(gòu)域而劃分的蛋白家族。所述的POU結(jié)構(gòu)域存在于三個(gè)哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子，Pit-1，Oct-1和Oct-2和C.elegans中的發(fā)育控制基因unc-86中。其他的POU蛋白已在許多種中有所描述，且它們是以細(xì)胞譜系特異的方式表達(dá)的。所述的brn-2基因可能參與胚胎神經(jīng)元發(fā)育途徑，Brn-2蛋白出現(xiàn)于成人的腦中。培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)元和神經(jīng)嵴來源的腫塊的核提取物的電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSAs)已檢測(cè)了許多Oct-因子蛋白。這些包括N-Oct-2，N-Oct-3，N-Oct-4和N-Oct-5。已經(jīng)證實(shí)N-Oct-2，N-Oct-3和N-Oct-5在人黑素細(xì)胞、黑素瘤組織和黑素瘤細(xì)胞系(均來自神經(jīng)嵴譜系)中也是差異性表達(dá)的。已知所述的bru-2基因組座位編碼N-Oct-3和N-Oct-5 DNA結(jié)合活性。N-Oct-3存在于所有檢測(cè)的黑素瘤細(xì)胞中，包括應(yīng)用于這些實(shí)驗(yàn)的MM96L系。當(dāng)Brn-2蛋白的表達(dá)被封閉時(shí)，N-Oct-3 DNA-結(jié)合活性消失，并產(chǎn)生其它下游效應(yīng)，包括細(xì)胞形態(tài)的改變，黑素生成/色素沉著途徑的元件表達(dá)的喪失，黑素細(xì)胞譜系的神經(jīng)嵴和標(biāo)記和其他標(biāo)記的喪失。無Brn-2的黑素瘤細(xì)胞在免疫缺陷的小鼠中不再致腫瘤(Thomson等，1995)。
1.細(xì)胞系的培養(yǎng)
來自人黑素瘤的MM96L系細(xì)胞在添加了10％ v/v FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培養(yǎng)以長(zhǎng)成貼壁單層細(xì)胞，參見上述實(shí)施例10中所述方法。
2.遺傳構(gòu)建體的制備
(a)中間質(zhì)粒
質(zhì)粒TOPO.BRN-2
用人Brn-2基因組克隆由下述引物通過PCR擴(kuò)增人Brn-2基因區(qū)域
brn1AGA TCT GAC AGA AAG AGC GAG CGA GGA GAG[SEQ IDNO17]和
brn4GGA TTC AGT GCG GGT CGT GGT GCG CGC CTG[SEQ IDNO18]。
將所述擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pCR(注冊(cè)商標(biāo))2.1-TOPO中以構(gòu)建中間克隆TOPO.BRN-2。
(d)檢測(cè)質(zhì)粒
質(zhì)粒pCMV.BRN2.BGI2. 2NRB
質(zhì)粒pCMV.BRN2.BGI2.2NRB(圖22)包含被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的BRN-2編碼區(qū)域的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pCMV.BRN2.BGI2.2NRB通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒TOPO.BRN2的BRN2序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglI-消化的pCMV.BGI2.cass(實(shí)施例11)以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.BRN2.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒TOPO.BRN2的BRN2序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamgI-消化的pCMV.BRN2.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.BRN2.BGI2. 2NRB。
3.共抑制表型的檢測(cè)
(a)Brn-2構(gòu)建體轉(zhuǎn)染將表達(dá)Brn2的轉(zhuǎn)基因插入到MM96L細(xì)胞中
轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。在每孔的2ml RPMI/640培養(yǎng)基，10％v/v FBS中接種1×105 MM96L細(xì)胞并在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)，直到單層細(xì)胞達(dá)60-90％鋪滿，典型地需要16到24hr。
接下來的步驟除了MM96L細(xì)胞與DNA脂質(zhì)體復(fù)合物僅在37℃ 5％v/v CO2下培養(yǎng)3到4hr外，同上述實(shí)施例13，3(a)中所述。
總共篩選出36個(gè)用構(gòu)建體pCMV.BRN2.BGI2.2NRB轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系用于下面的實(shí)驗(yàn)。
(b)在MM96L細(xì)胞中表達(dá)Brn-2的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄后沉默
來源于MM96L細(xì)胞由所述構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且具有Brn-2的PTGS特征的克隆，基于下述的形態(tài)改變進(jìn)行篩選即從黑素細(xì)胞所共有的明亮相，兩極和多分枝細(xì)胞型到清楚且易于鑒定的低反差(LC)，圓形。由這種LC克隆衍生的細(xì)胞通過電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA，見下)鑒定N-Oct-3活性的存在或不存在。其它的實(shí)驗(yàn)基于色素的消失。為確定黑色素的存在，如上述實(shí)施例14中所述，用經(jīng)修飾的用于色素生物聚合體染色的Schmorl方法對(duì)LC克隆的細(xì)胞進(jìn)行染色。符合所有標(biāo)準(zhǔn)，即(i)LC形態(tài)；(ii)缺乏N Oct-3 DNA結(jié)合活性，和(iii)色素沉著消失，的克隆通過核連綴轉(zhuǎn)錄分析直接檢測(cè)其PTGS。
為分離用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系，用上述概述中描述的技術(shù)，篩選出形態(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞系，通過在低密度下鋪親本克隆然后挑選形態(tài)發(fā)生改變的克隆以獲得這些細(xì)胞系的亞克隆(參見實(shí)施例10)。所選擇的用于下述實(shí)驗(yàn)的亞克隆是MM96L 2.1.1和MM96L 3.19.1。
4.核連綴轉(zhuǎn)錄分析
為評(píng)估在MM96L細(xì)胞和轉(zhuǎn)化系MM96L 2.1.1和MM96L 3.19.1中內(nèi)源BRN-2基因的轉(zhuǎn)錄速率，用由活躍分裂的細(xì)胞中分離出的核進(jìn)行了核連綴轉(zhuǎn)錄分析。所述的核是依照上述實(shí)施例10中的核分離方法獲得的。依照上述實(shí)施例10中所述，連綴轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本用生物素標(biāo)記，并用鏈霉抗生物素蛋白捕獲純化。
為確定內(nèi)源BRN-2基因在上述細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)錄速率，由核連綴轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中分離的生物素標(biāo)記的BRN-2轉(zhuǎn)錄本用實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)進(jìn)行定量。內(nèi)源BRN-2基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄速率是通過將生物素標(biāo)記的BRN-2 RNA的水平與普遍表達(dá)的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本，即人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的水平相比較而確定的。
內(nèi)源BRN-2和人 GAPDH基因的表達(dá)水平通過雙份PCR反應(yīng)確定。
5.未轉(zhuǎn)化和共抑制細(xì)胞系的mRNA的比較
內(nèi)源Brn-2基因的信使RNA和由轉(zhuǎn)基因BRN2.BGI2. 2NRB轉(zhuǎn)錄的RNA用如上述實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行了分析。
用實(shí)時(shí)PGR反應(yīng)精確地估計(jì)MM96L和轉(zhuǎn)化系中BRN-2mRNA的水平。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表11所示。
表11
這些數(shù)據(jù)表明帶有回復(fù)表型的兩轉(zhuǎn)化系，MM96L 2.1.1和MM96L3.19.1中的BRN-2mRNA(poly(A)RNA)水平與未轉(zhuǎn)化的MM96L細(xì)胞中的BRN-2 mRNA水平?jīng)]有顯著的差異。
6.Southern分析
用Southern印跡實(shí)驗(yàn)分析各轉(zhuǎn)基因MM96L細(xì)胞系以確定整合及轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)依照實(shí)施例10中所述的方法進(jìn)行。
7.電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)
為制備核和細(xì)胞質(zhì)抽提物，2×107細(xì)胞鋪于100mmTC皿中培養(yǎng)過夜。收獲細(xì)胞前，將TC皿置于冰上，完全吸出培養(yǎng)基，用冰冷的PBS將細(xì)胞洗兩次。加入700μl體積的PBS，將細(xì)胞從板上刮下，將懸浮液轉(zhuǎn)移到1.5ml微離心管中。將上述平板用400μl冰冷的PBS漂洗并將此加入管中。下述所有工作均在4℃下進(jìn)行。將細(xì)胞懸液于2,500rpm離心5min棄上清。150μl體積的HWB溶液[10mMHEPES pH7.4，1.5mM MgCl2，10mM KCl，蛋白酶抑制劑(Roche)，1mM原釩酸鈉和磷酸酶抑制劑(含10mM NaF，15mM Na2MoO4和100μM Na3VO4)]加入沉淀物中。用移液管將細(xì)胞重懸。在此時(shí)檢查細(xì)胞融脹。加入300μl體積的LB溶液[10mM HEPES pH 7.4，1.5mM MgCl2，10mM KCl，蛋白酶抑制劑(Roche)，1mM原礬酸鈉和磷酸酶抑制劑和0.1％NP-40]，細(xì)胞置于冰上5min。在此時(shí)檢查細(xì)胞裂解。將上述的管2500rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到一新管中。留下包含細(xì)胞核的沉淀物。
核重懸于800μl HWB溶液中清洗，然后將上述管于2,500rpm離心5min。棄上清，將核重懸于150μl NEB溶液[20mM HEPES pH7.8，0.42M NaCl，20％v/v甘油，0.2mM EDTA，1.5mM MgCl2，蛋白酶抑制劑，1mM原礬酸鈉和磷酸酶抑制劑]中，置于冰上10min。再將所述的管于13,000rpm離心使核剩余物沉淀，去除作為核提取物的上清液。保留小份的每一核提取物以通過Bradford比色實(shí)驗(yàn)(Bio-Rad)確定蛋白濃度。剩余物于-70℃貯藏。保存NEB溶液用于將提取物稀釋到工作濃度。
用于N-Oct-1和N-Oct-3的EMSA的雙鏈DNA探針如下
克隆25 GCATAATTAATGAATTAGTG [SEQ ID NO19]
CGTATTAATTACTTAATCAC
Oct-WT GAAGTATGCAAAGCATGCATCTC [SEQ ID NO20]
CTTCATACGTTTCGTACGTAGAG
Oct-dpm8 GAAGTAAGGAAAGCATGCATCTC [SEQ ID NO21]
CTTCATTCCTTTCGTACGTAGAG
克隆25探針對(duì)Oct-1和N-Oct-3具有高親和性。根據(jù)這一特性將所述序列從一組隨機(jī)形成的雙鏈寡核苷酸中篩選出來(Bendall等，1993)。探針Oct-WT由SV40增強(qiáng)子序列衍生，包含在Oct-dpm8探針中發(fā)生突變的共有八聚體結(jié)合位點(diǎn)(Sturm等，1987；Thomson等，1995)。
探針用[γ-32P]-ATP標(biāo)記。將所述探針稀釋到1μM，將5μl與1x多核苷酸激酶(PNK)緩沖液(Roche)，2μl[γ-32P]-ATP(10mCi/ml，3000Ci/mmol，Amersham)，1μl T4 PNK(10U/ul(Roche))(用MilliQ水調(diào)節(jié)體積到20μl)，在37℃下培養(yǎng)1hr。將所述的反應(yīng)用TE緩沖液(參見實(shí)施例10)稀釋到100μl，用TE過SephadexG25柱(Nap柱(Roche))。約4.5pmol的標(biāo)記探針以0.15pmol/μl的濃度回收，于-20℃貯存。
探針和抽提物的結(jié)合反應(yīng)在含12％v/v甘油，1x結(jié)合緩沖液(20mM HEPES pH7.0，140mM KCl)，13mM NaCl，5mM MgCl2，2μl標(biāo)記探針(0.04mol)，1μg蛋白抽提物，MilliQ水和需要時(shí)加入的未標(biāo)記探針競(jìng)爭(zhēng)物的10μl體積中進(jìn)行。加入的順序通常是競(jìng)爭(zhēng)物或水，標(biāo)記探針，蛋白抽提物。制備一個(gè)含有2μl PAGE上樣染料而不含蛋白樣品的管(參見實(shí)施例10)。
在將9μl上樣于用7％丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺29∶1 Tris-甘氨酸凝膠制備的Mini-Protean裝置(Bio-Rad)的孔中之前先將結(jié)合反應(yīng)物于室溫下孵育30min。所述的1x凝膠和1x凝膠電泳緩沖液分別自5x貯液0.75M Tris-HCl pH8.8和125mM Tris-HClpH8.3，0.96M甘氨酸，1mM EDTA pH8稀釋而來。凝膠于10V/cm下電泳，在10％v/v乙酸中固定15min，轉(zhuǎn)移到Whatman 3MM上，干燥然后在X-射線膠片下曝光16-48hr。
實(shí)施例20
體外鼠科動(dòng)物B10.2型和Pam212型細(xì)胞中YB-1和p53的共抑
制
1.細(xì)胞系的培養(yǎng)
來自鼠科動(dòng)物纖維肉瘤的B10.2細(xì)胞，來自鼠科動(dòng)物表皮角質(zhì)細(xì)胞的Pam212細(xì)胞用如上述實(shí)施例10中所述的方法在添加了5％v/vFBS的RPMI 1640或DMEM中生長(zhǎng)成為貼壁單層細(xì)胞。
2.遺傳構(gòu)建體的制備
(a)中間質(zhì)粒
質(zhì)粒TOPO.YB-1
用25ng含小鼠YB-1 cDNA(購(gòu)自Genesis Research &Development Corporation，Auckland NZ)的質(zhì)?？寺∽鳛榈孜?，用下述引物通過PCR擴(kuò)增小鼠YB-1基因區(qū)域
Y1AGA TCT GCA GCA GAC CGT AAC CAT TAT AGG[SEQ ID NO22]和
Y4GGA TCC ACC TTT ATT AAC AGG TGC TTG CAG[SEQ ID NO23]。
用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件包括最初的激活步驟95℃15min，接下來在94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后的延長(zhǎng)步驟是在72℃ 4min。
PCR擴(kuò)增的YB-1區(qū)域用柱純化(PCR純化柱，Qiagen)然后依制造商的建議(Invitrogen)克隆到pCR(注冊(cè)商標(biāo))2. 1-TOPO中以構(gòu)建質(zhì)粒TOPO.YB-1。
質(zhì)粒TOPO.p53
用25ng含小鼠p53cDNA(購(gòu)自Genesis Research &Development Corporation，Auckland NZ)的質(zhì)?？寺∽鳛榈孜镉孟率鲆锿ㄟ^PCR擴(kuò)增小鼠p53基因區(qū)域
P2AGA TCT AGA TAT CCT GCC ATC ACC TCA CTG[SEQ ID NO24]和
P4GGA TCC CAG GCC CCA CTT TCT TGA CCA TTG[SEQ ID NO25]。
用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件包括最初的激活步驟95℃15min，接下來在94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后的延長(zhǎng)步驟是在72℃4min。
PCR擴(kuò)增的p53區(qū)域用柱純化(PCR純化柱，Qiagen)，然后依制造商的建議(Invitrogen)克隆到pCR(注冊(cè)商標(biāo))2. 1-TOPO中以構(gòu)建質(zhì)粒TOPO. p53。
質(zhì)粒TOPO.YB1.p53
為構(gòu)建融合YB-1和p53 cDNA序列的構(gòu)建體，分離來自TOPO.YB-1含鼠科動(dòng)物YB-1序列的BglII-到-BamHI片段，將其克隆到TOPO.p53的BamHI位點(diǎn)。篩選YB-1以與p53相同的有義方向插入的克隆，將其命名為TOPO.YB1.p53。
(b)檢測(cè)質(zhì)粒
質(zhì)粒pCMV.YB1.BGI2.1BY
質(zhì)粒pCMV.YB1.BGI2.1BY(圖23)能夠轉(zhuǎn)錄被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)形式的鼠科動(dòng)物YB-1基因區(qū)域。質(zhì)粒pCMV.YB1.BGI2.1BY通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒TOPO.YB-1的YB-1序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.YB1.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒TOPO.YB1的YB1序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.YB1.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.YB1.BGI2.1BY。
質(zhì)粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY
質(zhì)粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY(圖24)能夠表達(dá)鼠科動(dòng)物YB-1和p53基因融合區(qū)域。該區(qū)域是被人β-珠蛋白內(nèi)含子2序列的插入打斷的倒轉(zhuǎn)重復(fù)或回文結(jié)構(gòu)形式。質(zhì)粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY通過下述連續(xù)的步驟構(gòu)建(i)將來自質(zhì)粒TOPO.YB1.p53的YB-1.p53融合序列以BglII-到-BamHI片段按有義方向亞克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.YB1.p53.BGI2，和(ii)將來自質(zhì)粒TOPO.YB1.p53.的YB1.p53.融合序列以BglII-到-BamHI片段按反義方向亞克隆到用BamHI-消化的pCMV.YB1.p53.BGI2中以構(gòu)建質(zhì)粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY。
3.共抑制表型的檢測(cè)
(a)通過將YB-1基因插入鼠科動(dòng)物纖維肉瘤B10.2細(xì)胞和鼠科動(dòng)物表皮角質(zhì)細(xì)胞Pam 212后YB-1的轉(zhuǎn)錄后基因沉默
YB-1(Y-框DNA/RNA-結(jié)合因子1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其主要結(jié)合于p53基因的啟動(dòng)子區(qū)域并由此抑制其表達(dá)。在以正常水平表達(dá)正常p53蛋白的癌細(xì)胞中(約占全部人癌癥的50％)，p53的表達(dá)受控于YB-1，因此YB-1表達(dá)的減少導(dǎo)致p53蛋白水平的升高以及隨后的細(xì)胞程序性死亡。鼠科動(dòng)物細(xì)胞系B10.2和Pam 212是這樣兩個(gè)具有正常p53表達(dá)的致腫瘤細(xì)胞系。在這兩個(gè)細(xì)胞系中所預(yù)望的YB-1共抑制表型就是細(xì)胞程序性死亡。
用pCMV.YB1.BGI2. 1BY進(jìn)行的轉(zhuǎn)化在6孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/v FBS中接種3.5×104細(xì)胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)24hr。
用于制備轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的兩種混合物為
混合物A1.5μl L1POFECTAMINE 2000(商標(biāo))試劑(LifeTechnologies)于100μl OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基(LifeTechnologies)中，于室溫下溫育5min；
混合物B1μl(400ng)pCMV.YB1.BGI2.1BY DNA于100μl OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基中。
預(yù)孵育過后，將混合物A添加到混合物B中混合并于室溫下繼續(xù)孵育20min。
覆蓋每一細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基用800μl新鮮培養(yǎng)基和200μl轉(zhuǎn)染混合物替換。細(xì)胞在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)72hr。
轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞類型(B10.2和Pam 212)的雙份培養(yǎng)物。
如實(shí)施例10中所述的方法將細(xì)胞用胰蛋白酶懸浮，離心并重懸于PBS中。
通過臺(tái)盼藍(lán)(0.2％)染色并一式四份在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)確定活的和死的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖25A，252B，25C和25D(參見

)。(b)通過將YB-1和p53基因共插入鼠科動(dòng)物纖維肉瘤B10.2細(xì)胞和鼠科動(dòng)物表皮角質(zhì)細(xì)胞Pam 212后YB-1和p53的轉(zhuǎn)錄后基因沉默
如圖25A，25B，25C和25D所示的數(shù)據(jù)表明，與共抑制的誘導(dǎo)相一致，在設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)YB-1共抑制的YB-1構(gòu)建體插入后在B10.2和Pam212細(xì)胞中死亡的細(xì)胞數(shù)增多了。負(fù)責(zé)在這些細(xì)胞中起始細(xì)胞程序性死亡應(yīng)答的p53的同時(shí)共抑制，預(yù)期將消除由于細(xì)胞程序性死亡而造成的過量細(xì)胞死亡。
用pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY進(jìn)行的轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/vFBS中接種3.5×104細(xì)胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)24hr。
用于制備轉(zhuǎn)染介質(zhì)的兩種混合物為
混合物A1.5μl L1POFECTAMINE 2000(商標(biāo))試劑(LifeTechnologies)于100μl OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基(LifeTeehnologies)中，于室溫下溫育5min；
混合物B1μl(400ng)pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BYDNA于100μl OPTI-MEMI(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基中。
預(yù)孵育過后，將混合物A添加到混合物B中混合并于室溫下繼續(xù)孵育20min。
覆蓋每一細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基用800μl新鮮培養(yǎng)基和200μl轉(zhuǎn)染混合物替換。細(xì)胞在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)72hr。
如實(shí)施例10中所述的方法將細(xì)胞用胰蛋白酶懸浮，離心并重懸于PBS中。
通過臺(tái)盼藍(lán)(0.2％)染色并一式四份在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)確定活的和死的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖25A，252B，25C和25D(參見

)。
(c)對(duì)照將GFP插入到鼠科動(dòng)物纖維肉瘤B10.2細(xì)胞和鼠科動(dòng)物表皮角質(zhì)細(xì)胞Pam 212中
用pCMV.EGFP進(jìn)行的轉(zhuǎn)化在6-孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/v FBS中接種3.5×104細(xì)胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)24hr。
用于制備轉(zhuǎn)染介質(zhì)的兩種混合物為
混合物A1.5μl L1POFECTAMINE 2000(商標(biāo))試劑(LifeTechnologies)于100μl OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基(LifeTechnologies)中，于室溫下溫育5min；
混合物B1μl(400ng)pCMV.EGFP DNA于100μl OPTI-MEMI(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基中。
預(yù)孵育過后，將混合物A添加到混合物B中混合并于室溫下繼續(xù)孵育20min。
覆蓋每一細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基用800μl新鮮培養(yǎng)基和200μl轉(zhuǎn)染混合物替換。細(xì)胞在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)72hr。
如實(shí)施例10中所述的方法將細(xì)胞用胰蛋白酶懸浮，離心并重懸于PBS中。
通過臺(tái)盼藍(lán)(0.2％)染色并一式四份在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)確定活的和死的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖25A，252B，25C和25D(參見

)。
(d)對(duì)照通過將假Y-框寡核苷酸插入到鼠科動(dòng)物纖維肉瘤B10.2細(xì)胞和鼠科動(dòng)物表皮角質(zhì)細(xì)胞Pam 21引起的YB-1表型弱化
所述的在B10.2和Pam 212細(xì)胞中抑制p53起始的細(xì)胞程序性死亡的YB-1的功能已通過下述兩種途徑對(duì)此種抑制的緩解表現(xiàn)出來(i)用YB-1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染；(ii)用相應(yīng)于p53啟動(dòng)子Y-框序列的假寡核苷酸轉(zhuǎn)染。后者用作本實(shí)施例中的陽(yáng)性對(duì)照。
用假YB1和對(duì)照(非特異性的)寡核苷酸進(jìn)行的轉(zhuǎn)化在24孔組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/vFBS中接種3.5×104細(xì)胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)24hr。
用于制備轉(zhuǎn)染介質(zhì)的兩種混合物為
混合物A1.5μl Lipofectin(商標(biāo))劑試(Life Technologies)于100μl OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基(Life Technologies)中，于室溫下溫育30min；
混合物B0.4μl(40pmol)寡核苷酸(假YB1或?qū)φ?于100μl OPTI-MEM I(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)基中。
預(yù)孵育過后，將混合物A添加到混合物B中混合并于室溫下繼續(xù)孵育15min。
制備一個(gè)無寡核苷酸的(僅有Lipofectin(商標(biāo)))對(duì)照。
細(xì)胞用無血清的培養(yǎng)基(Optimen)洗，然后加入轉(zhuǎn)染混合物。細(xì)胞在37℃ 5％ v/v CO2下培養(yǎng)4hr，然后用1ml含10％ v/v FBS的RPMI替換所用的培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)過夜(18hr)。
如實(shí)施例10中所述的方法將細(xì)胞用胰蛋白酶懸浮，離心并重懸于PBS中。
通過臺(tái)盼藍(lán)(0.2％)染色并一式四份在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)確定活的和死的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖25A，252B，25C和25D(參見

)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可以對(duì)本文所述發(fā)明進(jìn)行改變和修飾，而非僅僅局限于此處特定描述的那些。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括了所有這些改變和修飾。本發(fā)明還包括在上述說明書中單獨(dú)或集中涉及或指明的所有步驟，特征，組分和化合物，以及上述兩種或更多步驟或特征的任意或全部結(jié)合。
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<150> AU PR2700
<151> 2001-01-24
<160> 25
<170> PatentIn version 3.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物
<400> 1
gagctcttca gggtgagtct atgggaccc 29
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<212> DNA
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tctccttacg cgtctgtgcg gtat 24
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atgaggacac gtaggagctt cctg 24
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<212> DNA
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cccggggctt agtgtaaaac aggctgagag 30
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cccgggcaaa tcccagtcat ttcttagaaa 30
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cggcagatcc taacaatggc aggacaaatc gagtacatc 39
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<213> 雙鏈
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<210> 21
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<213> 雙鏈
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gaagtaagga aagcatgcat ctc 23
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agatctgcag cagaccgtaa ccattatagg 30
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ggatccacct ttattaacag gtgcttgcag 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物
<400> 24
ggattcagtg cgggtcgtgg tgcgcgcctg 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物
<400> 25
ggatcccagg ccccactttc ttgaccattg 30
權(quán)利要求
1.遺傳構(gòu)建體，其含有與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列，其中，當(dāng)將所述遺傳構(gòu)建體引入所述動(dòng)物細(xì)胞后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
2.如權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚或爬行動(dòng)物。
3.如權(quán)利要求2所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
4.如權(quán)利要求3所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，家畜動(dòng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
5.如權(quán)利要求4所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
6.如權(quán)利要求4所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
7.如權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建體，其中，該構(gòu)建體還包含與所述的靶內(nèi)源核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的遺傳構(gòu)建體，其中，與所述的靶內(nèi)源核苷酸序列同一和互補(bǔ)的核苷酸序列被內(nèi)含子序列所分隔。
9.如權(quán)利要求8所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的內(nèi)含子序列是來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子。
10.如權(quán)利要求9所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的β-珠蛋白內(nèi)含子是人β-珠蛋白內(nèi)含子2。
11.如權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中，包含內(nèi)源靶序列的所述基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有降低。
12.如權(quán)利要求1到10中任意一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中，包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因所轉(zhuǎn)錄的RNA總水平基本上沒有降低。
13.遺傳構(gòu)建體，其包含
(i)與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；
(ii)與(i)中定義的所述靶內(nèi)源核酸序列基本上互補(bǔ)的單一核苷酸序列；
(ii) 將上述(i)和(ii)中所述的核苷酸序列分隔開的內(nèi)含子核苷酸序列；
其中，當(dāng)將所述的構(gòu)建體引入所述動(dòng)物細(xì)胞之后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的轉(zhuǎn)錄能力。
14.如權(quán)利要求13所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚或爬行動(dòng)物。
15.如權(quán)利要求14所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
16.如權(quán)利要求15所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
17.如權(quán)利要求16所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
18.如權(quán)利要求15所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
19.如權(quán)利要求13到18中任意一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述包含內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有降低。
20.如權(quán)利要求13到18中任意一項(xiàng)所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因所轉(zhuǎn)錄的RNA總水平基本上沒有降低。
21.遺傳構(gòu)建體，其包含
(i)與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；
(ii)與(i)中定義的所述靶內(nèi)源核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；
(iii)將上述(i)和(ii)中所述的核苷酸序列分隔開的內(nèi)含子核苷酸序列；
其中，當(dāng)將所述的構(gòu)建體引入所述的動(dòng)物細(xì)胞后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力，且包含內(nèi)源靶序列的所述基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有降低和/或包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的所述基因所轉(zhuǎn)錄的RNA總水平基本上沒有降低。
22.如權(quán)利要求21所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚或爬行動(dòng)物。
23.如權(quán)利要求22所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
24.如權(quán)利要求23所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
25.如權(quán)利要求24所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
26.如權(quán)利要求24所述的遺傳構(gòu)建體，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
27.經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于所述的細(xì)胞
(i)包含導(dǎo)入所述細(xì)胞或其親本細(xì)胞的靶內(nèi)源核苷酸序列的有義拷貝；和
(ii)與未經(jīng)遺傳修飾的相同細(xì)胞相比，基本上沒有由包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因編碼的蛋白產(chǎn)物。
28.如權(quán)利要求27所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚類和爬行動(dòng)物。
29.如權(quán)利要求28所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
30.如權(quán)利要求29所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
31.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
32.如權(quán)利要求30所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
33.如權(quán)利要求27所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的構(gòu)建體還包含與所述的靶內(nèi)源核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
34.如權(quán)利要求33所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，與所述的靶內(nèi)源核酸序列同一和互補(bǔ)的核苷酸序列被內(nèi)含子序列所分隔。
35.如權(quán)利要求34所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的內(nèi)含子序列是來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子。
36.如權(quán)利要求35所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的β-珠蛋白內(nèi)含子是人β-珠蛋白內(nèi)含子2。
37.如權(quán)利要求27到36中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的含內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有下降。
38.如權(quán)利要求27到36中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，由所述含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因所轉(zhuǎn)錄的RNA總水平基本上沒有降低。
39.經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于所述的細(xì)胞
(i)包含導(dǎo)入所述細(xì)胞或其親本細(xì)胞的靶內(nèi)源核苷酸序列的有義拷貝；
(ii)與未經(jīng)遺傳修飾的相同細(xì)胞相比，基本上沒有由包含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因編碼的蛋白產(chǎn)物；和
(iii) 與未經(jīng)遺傳修飾的相同細(xì)胞相比，穩(wěn)定狀態(tài)的總RNA的水平基本上沒有降低。
40.如權(quán)利要求39所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚類或爬行動(dòng)物。
41.如權(quán)利要求40所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
42.如權(quán)利要求41所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
43.如權(quán)利要求42所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
44.如權(quán)利要求42所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
45.如權(quán)利要求39所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的細(xì)胞還包含與所述靶內(nèi)源核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
46.如權(quán)利要求39所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，與所述的靶內(nèi)源核酸序列同一和互補(bǔ)的核苷酸序列被內(nèi)含子序列所分隔。
47.如權(quán)利要求46所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的內(nèi)含子序列是來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子。
48.如權(quán)利要求47所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞，其中，所述的β-珠蛋白內(nèi)含子是人β-珠蛋白內(nèi)含子2。
49.改變脊椎動(dòng)物細(xì)胞表型的方法，其中所述的表型是由內(nèi)源基因的表達(dá)所賦予或促進(jìn)的，該方法包括向所述細(xì)胞或所述細(xì)胞的親本細(xì)胞中導(dǎo)入遺傳構(gòu)建體，其中所述的遺傳構(gòu)建體包含與含有所述內(nèi)源基因或其部分的核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列，且與未導(dǎo)入所述遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚類或爬行動(dòng)物。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
55.如權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述的構(gòu)建體還包含與所述靶內(nèi)源核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
56.如權(quán)利要求49所述的方法，其中，與所述的靶內(nèi)源核苷酸序列同一和互補(bǔ)的核苷酸序列被內(nèi)含子序列所分隔。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述的內(nèi)含子序列是來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中，所述的β-珠蛋白內(nèi)含子是人β-珠蛋白內(nèi)含子2。
59.經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物，其包含如權(quán)利要求27到38中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
60.經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物，其包含如權(quán)利要求39到48中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
61.經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物，其包含與所述鼠科動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列，其中，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
62.如權(quán)利要求61所述的經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物，其中，所述的構(gòu)建體還包含與所述的靶內(nèi)源核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
63.如權(quán)利要求61所述的經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物，其中，與所述的靶內(nèi)源核酸序列同一和互補(bǔ)的核苷酸序列被內(nèi)含子序列所分隔。
64.如權(quán)利要求63所述的經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物，其中，所述的內(nèi)含子序列是來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子。
65.如權(quán)利要求64所述的經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物，其中，所述的β-珠蛋白內(nèi)含子是人β-珠蛋白內(nèi)含子2。
66.如權(quán)利要求61到65中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物，其中，所述的含內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有下降。
67.如權(quán)利要求61到65中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)遺傳修飾的鼠科動(dòng)物，其中，由含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的所述基因所轉(zhuǎn)錄的RNA總水平基本上沒有降低。
68.含有與脊椎動(dòng)物細(xì)胞基因組中靶內(nèi)源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體在產(chǎn)生動(dòng)物細(xì)胞中的用途，其中，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力.
69.如權(quán)利要求68所述的用途，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物，鳥類，魚類或爬行動(dòng)物。
70.如權(quán)利要求69所述的用途，其中，所述的脊椎動(dòng)物細(xì)胞來自哺乳動(dòng)物。
71.如權(quán)利要求70所述的用途，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
72.如權(quán)利要求71所述的用途，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
73.如權(quán)利要求71所述的用途，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
74.如權(quán)利要求68所述的用途，其中，所述的構(gòu)建體還包含與所述的靶內(nèi)源核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
75.如權(quán)利要求74所述的用途，其中，與所述的靶內(nèi)源核酸序列同一和互補(bǔ)的核苷酸序列被內(nèi)含子序列所分隔。
76.如權(quán)利要求75所述的用途，其中，所述的內(nèi)含子序列是來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子。
77.如權(quán)利要求76所述的用途，其中，所述的β-珠蛋白內(nèi)含子是人β-珠蛋白內(nèi)含子2。
78.如權(quán)利要求68到77中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述的含內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有下降。
79.如權(quán)利要求68到77中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，由所述含所述靶核苷酸內(nèi)源序列的基因所轉(zhuǎn)錄的RNA總水平基本上沒有降低。
80.在脊椎動(dòng)物中進(jìn)行遺傳治療的方法，所述的方法包括向所述動(dòng)物的細(xì)胞中引入含有與所述動(dòng)物細(xì)胞基因組中的靶內(nèi)源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列的構(gòu)建體，以使得在引入所述的核苷酸序列后，由含有所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)錄形成的RNA轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出改變了的翻譯成蛋白產(chǎn)物的能力。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，所述的脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，鳥類，魚類或爬行動(dòng)物。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中，所述的脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人，靈長(zhǎng)類，家畜或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述的哺乳動(dòng)物是鼠科動(dòng)物種。
85.如權(quán)利要求83所述的方法，其中，所述的哺乳動(dòng)物是人。
86.如權(quán)利要求80所述的方法，其中，所導(dǎo)入的核苷酸序列還包含與所述的靶內(nèi)源核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中，與所述的靶內(nèi)源核苷酸序列同一和互補(bǔ)的核苷酸序列被內(nèi)含子序列所分隔。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其中，所述的內(nèi)含子序列是來自編碼β-珠蛋白的基因的內(nèi)含子。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中，所述的β-珠蛋白內(nèi)含子是人β-珠蛋白內(nèi)含子2。
90.如權(quán)利要求80到89中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述的含內(nèi)源靶序列的基因的轉(zhuǎn)錄水平基本上沒有下降。
91.如權(quán)利要求80到89中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，由所述含所述內(nèi)源靶核苷酸序列的基因所轉(zhuǎn)錄的RNA總水平基本上沒有降低。
全文摘要
總的來說，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)，促進(jìn)或者易化動(dòng)物細(xì)胞或包含所述動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞組表型改變的方法。表型表達(dá)的調(diào)節(jié)可通過遺傳操作方便地進(jìn)行，如通過減少轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白產(chǎn)物等方法。誘導(dǎo)，促進(jìn)或易化可表達(dá)的遺傳序列沉默的能力提供了一種在例如，醫(yī)藥，獸醫(yī)和動(dòng)物飼養(yǎng)業(yè)中調(diào)節(jié)表型的方法。本發(fā)明所包含的可表達(dá)的遺傳序列不僅包括正常存在于特定動(dòng)物細(xì)胞中的基因(即固有基因)還包括通過重組方法或由病原媒介物如病毒轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入的基因。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1426466SQ01808640
公開日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月17日
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