一株枯草芽孢桿菌工程菌及其應(yīng)用的制作方法

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本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種及工業(yè)品的微生物發(fā)酵制備，尤其涉及一株枯草芽孢桿菌工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

D-核糖是一種五碳糖，是生命遺傳物質(zhì)核糖核酸以及生理活性物質(zhì)ATP、NADH、NADPH、FADH的重要組成部分，是生物體內(nèi)能量代謝的主要參與者，具有重要的生理功能。

D-核糖在工業(yè)中主要用于核黃素維生素B₂以及食品鮮味劑的生產(chǎn)，近年來，更多的研究已將D-核糖可作為醫(yī)藥中間體，用于抗病毒、抗腫瘤藥物的合成，另外，D-核糖還可以作為輔助藥物用于治療心肌局部缺血、過度勞損引起的肌肉僵硬、肌肉酸痛等病癥。

D-核糖的生產(chǎn)方法包括從酵母核酸中提取、化學(xué)合成法以及利用微生物菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化。提取法和化學(xué)合成生產(chǎn)D-核糖因為生產(chǎn)效率低、工藝復(fù)雜等諸多原因始終沒有形成規(guī)?；a(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)D-核糖生產(chǎn)效率高、工藝簡便、生產(chǎn)成本低，使D-核糖價格大幅度下降，真正實現(xiàn)了D-核糖規(guī)?；a(chǎn)。

D-核糖生產(chǎn)菌株多是通過傳統(tǒng)誘變篩選轉(zhuǎn)酮酶缺陷型突變株。1970年Sasajima等人發(fā)現(xiàn)一株枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)酮酶缺失突變株積累D-核糖，產(chǎn)量達(dá)35g/L，并且發(fā)現(xiàn)一株轉(zhuǎn)酮酶缺失回復(fù)突變株不再積累D-核糖，證明D-核糖積累是由于轉(zhuǎn)酮酶缺失造成的(Sasajima K et al.Agric Biol Chem,35(4),509-517,1971)。

3-羥基丁酮是一種廣泛應(yīng)用的食用香料，此外，3-羥基丁酮作為一種中間體化合物，廣泛應(yīng)用于制藥、化工和日化食品等領(lǐng)域。3-羥基丁酮和D-核糖的生產(chǎn)方式包括化學(xué)合成、酶法合成和微生物工業(yè)發(fā)酵制備，其中以糖原為原料的微生物發(fā)酵法制備具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景而收到廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有技術(shù)中實現(xiàn)3-羥基丁酮和D-核糖聯(lián)產(chǎn)微生物發(fā)酵法較少，其中CN10197444A公開了一種高產(chǎn)D-核糖且聯(lián)產(chǎn)3-羥基丁酮的枯草芽孢桿菌，該菌株實在轉(zhuǎn)酮酶缺陷菌株的基礎(chǔ)上二次誘變得到的，其3-羥基丁酮和D-核糖的產(chǎn)量均較高，但誘變的方式獲得同樣性能的菌株較難實現(xiàn)，如何實現(xiàn)3-羥基丁酮和D-核糖的高效聯(lián)產(chǎn)，仍是本領(lǐng)域技術(shù)人員面臨的主要問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明人前期通過傳統(tǒng)誘變的手段選育獲得一株轉(zhuǎn)酮酶缺失突變株SFR-4，經(jīng)條件優(yōu)化后該菌株D-核糖產(chǎn)率可達(dá)到62.3g/L(趙祥穎等,食品與藥品,7(3):23-26,2005)，然而發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)由于隨機(jī)誘變產(chǎn)生的負(fù)突變積累，菌株SFR-4環(huán)境耐受性較差，在工業(yè)生產(chǎn)過程中存在較大的染菌風(fēng)險，這成為限制該菌株D-核糖發(fā)酵效率提升、降低成本的一個重要原因。

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，尤其是針對發(fā)現(xiàn)的菌株SFR-4環(huán)境耐受性較差、生產(chǎn)過程中存在較大的染菌風(fēng)險的問題，本發(fā)明提供一株抗逆性強(qiáng)、不易染菌的D-核糖發(fā)酵的枯草芽孢桿菌工程菌，本發(fā)明基于現(xiàn)有傳統(tǒng)誘變選育獲得轉(zhuǎn)酮酶缺陷型D-核糖高產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗逆性差的問題，通過分子生物學(xué)手段獲得一株高產(chǎn)D-核糖菌株，同時具有抗逆性好、耗糖速度快的特點。此外，本發(fā)明的目的還在于提供該枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖和/3-羥基丁酮的應(yīng)用和發(fā)酵方法。

發(fā)明人將菌株SFR-4進(jìn)行了全基因組測序，針對測序結(jié)果，發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)菌株SFR-4與另一株發(fā)明人篩選的積累3-羥基丁酮的枯草芽孢桿菌菌株SFA-H43(趙祥穎等，一株產(chǎn)3-羥基丁酮的芽孢桿菌及其應(yīng)用，中國專利CN 103333842A，保藏號CCTCC No:M2013181)基因組功能基因組成高度相似，而與枯草芽孢桿常用168菌株比較差異相對較大(見附圖1)。

進(jìn)一步的，通過對三菌株的轉(zhuǎn)酮酶基因比對，發(fā)現(xiàn)SFR-4菌株轉(zhuǎn)酮酶基因的后50bp基因序列較SFA-H43菌株發(fā)生了明顯變異(見附圖2)。發(fā)明人通過對兩株菌(SFR-4、SFA-H43)進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)菌株SFA-H43對環(huán)境的耐受力比菌株SFR-4強(qiáng)，且生長旺盛，耗糖速度快，發(fā)酵過程不易染菌?；谏鲜龇治?，發(fā)明人大膽預(yù)期，如果將菌株SFA-H43正常的轉(zhuǎn)酮酶基因替換成菌株SFR-4發(fā)生了變異的轉(zhuǎn)酮酶基因，即可獲得轉(zhuǎn)酮酶發(fā)生變異的SFA-H43工程菌株，預(yù)期該工程菌株可以積累D-核糖，同時仍然保持菌株SFA-H43其他優(yōu)良特性，提高D-核糖發(fā)酵的抗逆性、減少發(fā)酵染菌風(fēng)險。

基于上述分析和試驗，具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

首先，本發(fā)明提供了一種用于D-核糖生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌工程菌，所述工程菌為枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉(zhuǎn)酮酶基因替換為SEQ ID NO.7所示基因序列后獲得的工程菌。

優(yōu)選的，SEQ ID NO.7所示基因序列源自枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉(zhuǎn)酮酶基因。

所述枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株，保藏號為CCTCC No:M2013181。

所述枯草芽孢桿菌SFR-4菌株，為發(fā)明人早先篩選到的轉(zhuǎn)酮酶缺失突變株，參見趙祥穎等，食品與藥品,7(3):23-26,2005；公眾可以合理途徑獲得。

具體的，本發(fā)明所述用于D-核糖生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌工程菌，為枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉(zhuǎn)酮酶基因終止密碼子前500bp序列，替換為枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉(zhuǎn)酮酶基因終止密碼子前500bp序列(包含突變位點)獲得的工程菌。

本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，公開了一株用于D-核糖生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)工程菌SFR-43T，該菌株于2016年11月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏號為：CCTCCM 2016666。

所述用于D-核糖生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌工程菌株SFR-43T，在LB培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)培養(yǎng)12h開始出現(xiàn)菌落，24小時菌落直徑約1.0-1.5mm，菌落呈圓形，邊緣不整齊，乳白色，扁平、表面光滑、不透明，與菌株SFA-H43菌落有明顯區(qū)別；在LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12-20小時，細(xì)胞呈直桿狀，呈單個或短鏈存在，革蘭氏染色陽性，產(chǎn)孢子能力降低。

所述菌株SFR-43T，為轉(zhuǎn)酮酶突變工程菌株，在合適的培養(yǎng)條件(培養(yǎng)溫度、pH、溶解氧等)下，為其提供恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基組分(碳源、氮源、無機(jī)鹽等)，該菌株在培養(yǎng)液中能夠積累D-核糖。

所述菌株SFR-43T是通過分子生物學(xué)的方法獲得的，其親株為SFA-H43菌株，發(fā)生突變的轉(zhuǎn)酮酶基因來自D-核糖生產(chǎn)菌株SFR-4。

其次，本發(fā)明提供一種用于D-核糖生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建方法，其通過同源重組的方法，將枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉(zhuǎn)酮酶基因替換為SEQ ID NO.7所示基因序列。

優(yōu)選的，SEQ ID NO.7所示基因序列源自枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉(zhuǎn)酮酶基因。

具體的，用于D-核糖生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌工程菌SFR-43T的構(gòu)建方法中，同源重組替換的基因片段為枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉(zhuǎn)酮酶基因終止密碼子前500bp序列替換為枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉(zhuǎn)酮酶基因終止密碼子前500bp序列。

本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述菌株SFR-43T是通過下述步驟構(gòu)建而成的(構(gòu)建流程參見附圖3)：

(1)以菌株SFR-4基因組為模板，擴(kuò)增該菌株轉(zhuǎn)酮酶基因終止密碼子前500bp片段(包含突變位點)，稱為L-tkt(其序列如SEQ ID NO.10所示)，其中下游引物含有質(zhì)粒p7Z6的lox71-zeo-lox66片段前端25bp互補序列；優(yōu)選的，所用引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(2)以菌株SFA-H43基因組為模板，擴(kuò)增其轉(zhuǎn)酮酶基因下游500bp片段，為R-tkt(其序列如SEQ ID NO.11所示)，其中上游引物含有質(zhì)粒p7Z6的lox71-zeo-lox66末端25bp互補序列；優(yōu)選的，所用引物序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

(3)以質(zhì)粒p7Z6為模板，擴(kuò)增攜帶有l(wèi)ox位點的博來霉素抗性基因片段lox71-zeo-lox66；優(yōu)選的，所用引物序列為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

(4)采用融合PCR方法，將L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt融合；優(yōu)選的，融合PCR所用引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示；

(5)將融合片段轉(zhuǎn)化菌株SFA-H43，通過博來霉素抗性平板篩選整合型重組突變菌株，獲得了含有菌株SFR-4轉(zhuǎn)酮酶突變位點的菌株SFA-H43的工程菌株，并采用Cre/lox系統(tǒng)方法敲除工程菌株中的抗性基因zeo(Xin Yan et al.Appled and Environmental Microbiology,2008,74(17):5556-5562.)，獲得不帶抗生素抗性基因的安全轉(zhuǎn)酮酶突變工程菌株，命名為SFR-43T。

此外，本發(fā)明還公開了上述枯草芽孢桿菌工程菌在發(fā)酵制備D-核糖中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，上述應(yīng)用還包括在生產(chǎn)D-核糖的同時還發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丁酮。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種枯草芽孢桿菌工程菌發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖和/3-羥基丁酮的方法。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，具體的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)方案：

一種枯草芽孢桿菌工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)D-核糖和/3-羥基丁酮的方法，其采用如下的搖瓶發(fā)酵和/發(fā)酵罐發(fā)酵方式：

(1)菌種培養(yǎng)：將工程菌株活化后接種到種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得一級種子和/二級種子；

(2)搖瓶發(fā)酵：將步驟(1)培養(yǎng)好的一級種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，搖瓶培養(yǎng)至發(fā)酵液中D-核糖含量不再增加，結(jié)束發(fā)酵；

(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：將步驟(1)培養(yǎng)好的一級或二級種子接種到發(fā)酵罐中，進(jìn)行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，控制pH，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比，控制溶解氧進(jìn)行發(fā)酵。

優(yōu)選的實施方案中，步驟(1)中菌種培養(yǎng)為：取35-40℃培養(yǎng)2-3天工程菌株的新鮮斜面，用接種環(huán)取1-2環(huán)斜面菌種，接種到50ml液體種子培養(yǎng)基中，35-40℃，150-200rpm，搖瓶培養(yǎng)10-16小時，是為一級種子。將一級種子以1-10％的(體積百分?jǐn)?shù))接種種子培養(yǎng)基，35-40℃培養(yǎng)6-12小時，是為二級種子；

優(yōu)選的實施方案中，(2)搖瓶發(fā)酵：將步驟(1)培養(yǎng)好的一級種子以1-10％(體積百分?jǐn)?shù))的接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，35-40℃、180-220rpm，搖瓶培養(yǎng)至發(fā)酵液中D-核糖含量不再增加，結(jié)束發(fā)酵；

優(yōu)選的實施方案中，(3)發(fā)酵罐發(fā)酵：將步驟(1)培養(yǎng)好的一級或二級種子以1-10％(體積百分?jǐn)?shù))的接種量接種到發(fā)酵罐中(65-75％的裝液量)，35-40℃進(jìn)行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中，控制pH在5-7，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比，保持發(fā)酵液中相對溶解氧濃度5-30％。

進(jìn)一步地，上述斜面培養(yǎng)所用的斜面菌種培養(yǎng)基的組成為：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，其余為水，pH7.0-7.2。

進(jìn)一步地，上述液體一級種子培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20-40g/L，酵母浸提物2-10g/L，玉米漿8-12g/L，pH 7.0-7.2。

進(jìn)一步地，上述二級種子培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖30-60g/L，酵母浸提物2-10g/L，玉米漿8-12g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，pH 7.0-7.2。

進(jìn)一步地，上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖120-150g/L，酵母浸提物2-10g/L，玉米漿5-15g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH7.0-7.2。

進(jìn)一步地，上述發(fā)酵罐發(fā)酵初始培養(yǎng)基組成為：葡萄糖120-150g/L，酵母浸提物3-6g/L，玉米漿5-10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH 6.0-7.2。

優(yōu)選的，所述一級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為12-14小時。

優(yōu)選的，所述二級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的時間為6-8小時。

優(yōu)選的，所述搖瓶發(fā)酵或發(fā)酵罐發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為36-38℃。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵罐發(fā)酵的pH控制在5.5-6.5。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵罐發(fā)酵的溶解氧濃度保持在20-30％。

優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖130-150g/L，酵母浸提物3-6g/L，玉米漿6-10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH 7.0-7.2。

優(yōu)選的，發(fā)酵罐通過補料的方式提高發(fā)酵效率和增加發(fā)酵產(chǎn)率。

優(yōu)選的，補料發(fā)酵，初始葡萄糖濃度為120-150g/L。

優(yōu)選的，補料采用一次補料方式。

優(yōu)選的，補料時間為發(fā)酵液中葡萄糖濃度降至20-40g/L。

優(yōu)選的，補料量為40-60g/L葡萄糖。

優(yōu)選的，補料葡萄糖濃度為600-800g/L，酵母浸提物0.5g/L。

本發(fā)明取得了以下優(yōu)點和積極效果：

(1)本發(fā)明基于菌株SFR-4與菌株SFA-H43基因組功能基因組成高度相似的發(fā)現(xiàn)以及SFR-4菌株轉(zhuǎn)酮酶基因50bp基因序列較SFA-H43菌株發(fā)生了明顯變異的特點，將SFR-4菌株與SFA-H43菌株的優(yōu)勢進(jìn)行組合；本發(fā)明選用的轉(zhuǎn)化用親株SFA-H43為自然篩選的積累3-羥基丁酮的菌株，經(jīng)全基因組測序比較分析與D-核糖高產(chǎn)菌株SFR-4同源性較高，轉(zhuǎn)酮酶基因序列除突變位點外核酸序列完全相同，本發(fā)明采用同源重組的方法將菌株SFR-4菌株的轉(zhuǎn)酮酶基因突變序列轉(zhuǎn)入菌株SFA-43，替換該菌株轉(zhuǎn)酮酶基因的正常序列，獲得一株轉(zhuǎn)酮酶發(fā)生變異的工程菌株SFR-43T，經(jīng)發(fā)酵試驗驗證，工程菌株SFR-43T既保持了菌株SFA-43的其他優(yōu)良性能(抗逆性好、耗糖速度快、生長旺盛、不易染菌)，同時可以積累高濃度的D-核糖，發(fā)酵抗逆性明顯提高。

(2)SFA-H43菌株為發(fā)明人前期從白酒大曲磚中分離篩選到的生理生化性質(zhì)適于代謝生產(chǎn)3-羥基丁酮的菌株，基于菌株SFR-4與菌株SFA-H43基因組功能基因組成高度相似的特點，將SFA-H43菌株中轉(zhuǎn)酮酶基因替換為SFR-4菌株的轉(zhuǎn)酮酶基因后，本發(fā)明所述工程菌可以利用高濃度葡萄糖來高產(chǎn)D-核糖并聯(lián)產(chǎn)3-羥基丁酮，提高了工程菌生產(chǎn)D-核糖的價值。

附圖說明：

圖1菌株SFR-4、菌株SFA-H43、菌株168基因組功能基因相似度分析

圖2菌株SFR-4、菌株SFA-H43、菌株168轉(zhuǎn)酮酶基因序列差異位點的比對

圖3工程菌SFR-43T的構(gòu)建路線圖

圖4 PCR獲得的L-tkt、R-tkt、lox71-zeo-lox66片段的電泳圖，1.DL5000Marker；2.L-tkt基因片段；3.R-tkt基因片段；4.zeo基因片段

圖5融合PCR獲得的L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt重組基因片段電泳圖，1.DL5000Marker；2.重組基因片段

圖6工程菌SFR-43T發(fā)酵進(jìn)程

圖7菌株SFR-4發(fā)酵進(jìn)程

圖8工程菌SFR-43T發(fā)酵罐補料發(fā)酵進(jìn)程

具體實施方式：

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法，所用引物合成均購自華大基因，所用質(zhì)粒p7Z6及質(zhì)粒pDGC由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)贈與(Xin Yan et al.Appled and Environmental Microbiology,74(17):5556-5562,2008.)。

實施例1菌株SFR-43T構(gòu)建

(1)以菌株SFR-4基因組為模板，擴(kuò)增該菌株轉(zhuǎn)酮酶基因終止密碼子前500bp片段(包含突變位點)，稱為L-tkt(其序列如SEQ ID NO.10所示)。其下游引物含有l(wèi)ox71-zeo-lox66前端25bp互補序列。

模板：菌株SFR-4基因組

上游引物：GCAGCATGGAAGCTTGCAG(SEQ ID NO.1)

下游引物：TATAATGTATGCTATACGAACGGTATTATCTTGATACTATATAGAAACATCTCAAGG(SEQ ID NO.2)

PCR反應(yīng)體系(50uL)：菌株SFR-4基因組DNA模板1uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水17.5uL。

PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min，98℃10s，60.3℃30s，72℃30s，33個循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。

(2)以菌株SFA-H43基因組為模板，擴(kuò)增其轉(zhuǎn)酮酶基因下游500bp片段，為R-tkt(其序列如SEQ ID NO.11所示)。其上游引物含有l(wèi)ox71-zeo-lox66末端25bp互補序列。

模板：菌株SFA-H43基因組

上游引物：

ATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCTTTTGAAAGAGGATGAGTCAAAT(SEQ ID NO.3)

下游引物：AAAGAATATCGTTTCTGCCTCGTAA(SEQ ID NO.4)

PCR反應(yīng)體系(50uL)：菌株SFA-H43基因組DNA模板1uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水17.5uL。

PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min，98℃10s，60.8℃30s，72℃30s，33個循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。

(3)以質(zhì)粒p7Z6為模板，擴(kuò)增攜帶有l(wèi)ox位點的博來霉素抗性基因(zeo)片段lox71-zeo-lox66。

模板：質(zhì)粒p7Z6

上游引物:TACCGTTCGTATAGCATACATTATACG(SEQ ID NO.5)

下游引物:TATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGTC(SEQ ID NO.6)

PCR反應(yīng)體系(50uL)：菌株SFA-H43基因組DNA模板1uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水8.5uL。

PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min，98℃10s，59.2℃30s，72℃30s，33個循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。

PCR獲得的L-tkt、R-tkt、lox71-zeo-lox66zeo基因片段電泳圖見附圖4。

(4)采用融合PCR方法，制備L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt融合片段。

①融合反應(yīng)

融合PCR反應(yīng)體系：L-tkt基因片段3uL，R-tkt基因片段3uL，lox71-zeo-lox66zeo基因片段3uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水11.5uL。

融合PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min，98℃10s，59.2℃30s，72℃90s，10個循環(huán)。

②擴(kuò)增反應(yīng)

模板：融合片段

上游引物：GCAGCATGGAAGCTTGCAG(SEQ ID NO.1)

下游引物：AAAGAATATCGTTTCTGCCTCGTAA(SEQ ID NO.4)

反應(yīng)體系：融合片段10uL，上游引物1uL，下游引物1uL，2*Buffer 25uL，dNTP 4uL，高保真PCR酶PrimeSTAR 0.5uL，無菌水8.5uL。

反應(yīng)條件：95℃變性5min，98℃10s，59.2℃30s，72℃90s，33個循環(huán)。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過1％瓊脂糖凝膠電泳檢測并收集。附圖5為融合PCR獲得重組基因片段電泳圖。

(5)采用電轉(zhuǎn)法將該融合片段轉(zhuǎn)化SFA-H43菌株，通過博來霉素抗性平板(25ug/mL)篩選到8株抗性菌株，經(jīng)多次傳代獲得4株遺傳穩(wěn)定菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)有3株菌積累D-核糖，挑選其中一株進(jìn)行下一步抗性基因zeo敲除。

(6)采用電轉(zhuǎn)法將質(zhì)粒pDGC導(dǎo)入(5)獲得的重組工程菌株中，采用IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒中cre基因的表達(dá)，采用Cre/lox系統(tǒng)方法敲除重組體中的zeo基因，經(jīng)篩選和發(fā)酵試驗獲得一株攜帶菌株SFR-4轉(zhuǎn)酮酶基因突變序列、且不帶抗性基因的轉(zhuǎn)酮酶突變工程菌株，命名為SFR-43T。

該菌株于2016年11月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏號為：CCTCC M 2016666。

實施例2菌株SFR-43T產(chǎn)物分析

取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環(huán)取1-2環(huán)斜面菌種，接種到液體種子培養(yǎng)基中，37℃，180rpm搖床培養(yǎng)14小時，5％接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，180rpm搖瓶培養(yǎng)72小時。發(fā)酵液經(jīng)4500rpm離心10min，取上清，進(jìn)行產(chǎn)物分析，結(jié)果顯示菌株SFR-43T發(fā)酵液中同時檢出3-羥基丁酮和D-核糖組分。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.5g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

本發(fā)明以菌株SFR-4D-核糖發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對菌株SFR-43T發(fā)酵D-核糖的培養(yǎng)基氮源等組分進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。

氮源優(yōu)選：取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環(huán)挑取1-2環(huán)，接種到液體種子培養(yǎng)基中，37℃，180rpm搖床培養(yǎng)14小時，接種量5％，接種到含不同氮源的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(氮源分別為蛋白胨、酵母浸提物、玉米漿干粉、硝酸銨、磷酸氫二銨、硫酸銨，濃度均為10g/L，碳源為葡萄糖，其他組分相同)，37℃，180rpm搖瓶培養(yǎng)72小時。發(fā)酵液經(jīng)離心去菌體，上清液用于D-核糖含量測定。結(jié)果顯示菌株SFR-43T單獨利用蛋白胨、酵母浸提物、玉米漿干粉、硝酸銨(NH₄NO₃)、磷酸氫二銨((NH₄)₂HPO₄)、硫酸銨((NH₄)₂SO₄)為氮源均可產(chǎn)生D-核糖，其中單獨利用酵母浸提物為氮源，D-核糖產(chǎn)量最高?？紤]到酵母浸提物售價較高，本發(fā)明對多種復(fù)合氮源的各成分進(jìn)行組合優(yōu)選，結(jié)果當(dāng)酵母浸提物3-6g/L，玉米漿6-10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L時，菌株SFR-43T發(fā)酵D-核糖產(chǎn)率最高。

葡萄糖濃度優(yōu)選：取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環(huán)挑取1-2環(huán)，接種到液體種子培養(yǎng)基中，37℃，180rpm搖床培養(yǎng)14小時，接種量5％，接種到含不同濃度葡萄糖的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，180rpm搖瓶培養(yǎng)72小時。發(fā)酵液經(jīng)離心去菌體，上清液用于D-核糖含量測定。結(jié)果顯示，葡萄糖濃度在120-150g/L的范圍內(nèi)，菌株D-核糖產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率較高。

無機(jī)離子優(yōu)選：取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，用接種環(huán)挑取1-2環(huán)，接種到液體種子培養(yǎng)基中，37℃，180rpm搖床培養(yǎng)14小時，接種量5％，接種到含不同無機(jī)離子的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(無機(jī)離子分別為硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鈉、硫酸鋅，濃度均為1g/L，碳源為葡萄糖，氮源為酵母浸提物2-10g/L，玉米漿5-15g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-3g/L，其他組分相同)，37℃，180rpm搖瓶培養(yǎng)72小時。發(fā)酵液經(jīng)離心去菌體，上清液用于D-核糖含量測定。發(fā)酵液經(jīng)4500rpm離心15min，上清液經(jīng)液相色譜測定D-核糖含量，結(jié)果顯示菌株SFR-43T在添加有硫酸鎂和硫酸錳的培養(yǎng)基中，D-核糖含量較高，經(jīng)復(fù)合優(yōu)化該無機(jī)離子，結(jié)果顯示，當(dāng)MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L時，菌株SFR-43T發(fā)酵D-核糖產(chǎn)率較高。

實施例4菌株SFR-43T與菌株SFR-4對比發(fā)酵

本實施例用于對比所提供的基因比較工程菌SFR-43T與菌株SFR-4的D-核糖發(fā)酵特征。

工程菌SFR-43T與菌株SFR-4接入搖瓶種子培養(yǎng)基，后分別接入5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，8h取樣一次，發(fā)酵罐發(fā)酵的pH控制在6.5，通風(fēng)量為2L/min，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，溶解氧濃度保持在20-30％。比較菌體量、殘?zhí)菨舛取-核糖產(chǎn)量，并繪制發(fā)酵進(jìn)程曲線，如附圖6、圖7所示，相比于自然誘變選育菌株SFR-4，工程菌SFR-43T雖然D-核糖產(chǎn)量略有降低，但菌體生長較快，發(fā)酵周期較短。

斜面培養(yǎng)基配方：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。

液體種子培養(yǎng)基配方(g/L)：葡萄糖20g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，pH7.0。

菌株SFR-43T發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

菌株SFR-4發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿3g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，MgSO₄ 2g/L，CaCO₃ 5g/L，pH6.5。

實例5工程菌SFR-43T搖瓶發(fā)酵

取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環(huán)取1環(huán)斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)14小時，以5％的接種量接種到50ml/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180rpm搖瓶發(fā)酵，每隔12h取樣，培養(yǎng)周期至72小時，葡萄糖耗盡，結(jié)束發(fā)酵，D-核糖產(chǎn)量達(dá)39.35g/L，3-羥基丁酮產(chǎn)率35.7g/L。

斜面培養(yǎng)基配方：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。

液體種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，pH7.0。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH7.0。

實例6工程菌SFR-43T搖瓶發(fā)酵

取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環(huán)取1環(huán)斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12小時，以10％的接種量接種到50ml/250mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200rpm搖瓶發(fā)酵，每隔12h取樣，培養(yǎng)周期至72小時，葡萄糖耗盡，結(jié)束發(fā)酵，D-核糖產(chǎn)量達(dá)36.28g/L，3-羥基丁酮產(chǎn)率33.65g/L。

斜面培養(yǎng)基配方：酵母浸提物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 3g/L，瓊脂20g/L，pH7.0。

液體種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿8g/L，pH7.0。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖140g/L，酵母浸提物6g/L，玉米漿8g/L，(NH₄)₂SO₄3.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH7.0。

實例7菌株SFR-43T發(fā)酵罐發(fā)酵

取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環(huán)取1環(huán)斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)14小時，以5％(體積百分?jǐn)?shù))的接種量接種到5L發(fā)酵罐中(裝液量為3L)，37℃通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，通風(fēng)量為2L/min，控制pH5.5-6.0。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速，保持發(fā)酵液中相對溶解氧濃度為20％左右，68h發(fā)酵結(jié)束，D-核糖產(chǎn)量達(dá)40.5g/L，3-羥基丁酮產(chǎn)率為35.6g/L。

液體種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖50g/L，酵母浸提物6g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，pH7.0。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

實例8菌株SFR-43T發(fā)酵罐發(fā)酵

取37℃培養(yǎng)2天菌株SFR-43T的新鮮斜面，接種環(huán)取1環(huán)斜面菌種，接種到50ml/250mL液體種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12小時，以5％(體積百分?jǐn)?shù))的接種量接種到800ml/5L三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)8小時，以10％的接種量接種50L發(fā)酵罐，通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，通風(fēng)比0.5-1.0，控制pH6.0±0.2。通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速，保持發(fā)酵液中相對溶解氧濃度為20-40％，64h發(fā)酵結(jié)束，D-核糖產(chǎn)量達(dá)42.5g/L，3-羥基丁酮產(chǎn)率為33.6g/L。

一級液體種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖20g/L，酵母浸提物8g/L，玉米漿8g/L，pH7.0。

二級液體種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖60g/L，酵母浸提物6g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，MgSO₄ 2g/L，pH7.0。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖150g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄2.5g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。

實例9菌株SFR-43T發(fā)酵罐補料發(fā)酵

一級種子37℃培養(yǎng)14小時，以5％(體積百分?jǐn)?shù))的接種量接種到二級種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8小時，10％的接種量接種50L發(fā)酵罐(裝液量30L)，通風(fēng)攪拌培養(yǎng)?？刂瓢l(fā)酵溫度36-37℃、通風(fēng)比0.5-0.8，控制pH6.0±0.2，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速，保持發(fā)酵液中相對溶解氧濃度為20-40％，44h補料1次，補料40g/L，80小時發(fā)酵結(jié)束，D-核糖產(chǎn)量達(dá)51.5g/L，3-羥基丁酮產(chǎn)率35.1g/L，發(fā)酵結(jié)果如圖8所示。

發(fā)酵罐發(fā)酵初始培養(yǎng)基配方：葡萄糖120g/L，酵母浸提物5g/L，玉米漿10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，MgSO₄ 2g/L，MnSO₄ 0.2g/L，pH6.5。發(fā)酵罐發(fā)酵過程流加物料組成：葡萄糖800g/L，酵母浸提物0.5g/L。

以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院

<120> 一株枯草芽孢桿菌工程菌及其應(yīng)用

<130> 11

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 1

gcagcatgga agcttgcag 19

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 2

tataatgtat gctatacgaa cggtattatc ttgatactat atagaaacat ctcaagg 57

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 3

ataacttcgt atagcataca ttatagcttt tgaaagagga tgagtcaaat 50

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 4

aaagaatatc gtttctgcct cgtaa 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 5

taccgttcgt atagcataca ttatacg 27

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 6

tataatgtat gctatacgaa gttattcagt c 31

<210> 7

<211> 2004

<212> DNA

<213> SFR-4 tkt

<400> 7

atggatacaa ttgaaaagaa atcagttgct accattcgca cactgtcaat agacgctatt 60

gaaaaagcaa attctggtca cccagggatg ccgatgggag ccgctccaat ggcatacacg 120

ctgtggacaa aatttatgaa cgtaagtccg gcaaaccctg gctggtttaa ccgtgaccgt 180

tttgttttat ctgctggaca cgggtcagca ctattataca gcatgcttca tttaagcggg 240

tttgatctta gtattgaaga tcttaaggga ttccgccagt ggggcagcaa aacaccagga 300

catccggaat tcggacatac tgccggtgtt gatgctacaa caggtccgct tggccaagga 360

attgccatgg cagtcggtat ggcaattgct gaacgccatt tagcggaaac atacaaccgc 420

gattcattta acgtagtcga tcattataca tacagtattt gcggtgatgg tgatttaatg 480

gaaggtattt cttctgaagc cgcttcactc gcaggccatc ttcagcttgg ccgtctgatc 540

gtactatacg attctaatga catctctctt gatggagacc tcgaccgttc attctctgaa 600

aacgtgaaac agcgttttga agcaatgaat tgggaagttc tttatgttga ggatggaaac 660

aatattgaag aattaacagc ggctatcgaa aaagcacgcc aaaatgaaaa gaaacctaca 720

ttaattgaag tgaaaacgac aatcggattc ggttcaccta accgtgccgg tacatccggt 780

gttcacggtg cgccgcttgg taaagaggaa agcaaattaa caaaagaagc ttacgcgtgg 840

acatatgaag aagacttcta cgttccgtca gaagtttatg agcatttcgc tgcagctgtt 900

aaagaatcag gtgagaaaaa agaacaagaa tggaatgctc aattcgctaa atataaagaa 960

gtttatcctg aacttgctga acagcttgaa ctggcaatca aaggagagct tccgaaggac 1020

tgggatcaag aggttcctgt gtatgaaaaa ggaagcagcc tggcatcccg tgcatcttcc 1080

ggtgaagttc tcaacggact tgcgaaaaaa attcctttct ttgtcggagg ttctgctgac 1140

ctagcgggat cgaacaaaac gactattaaa aatgccggtg attttacagc ggttgattac 1200

tcaggcaaaa acttctggtt tggtgtacgt gaatttgcga tgggtgcagc cttaaacggt 1260

atggcgcttc atggcggtct tcgtgtattc ggcggaactt tctttgtctt ctctgattac 1320

ctgcgtcctg cgattcgcct tgcagcgtta atgggccttc ctgtgacata tgtcttcaca 1380

catgacagta ttgcggttgg tgaagacggt ccgacgcacg agcctgttga acagcttgct 1440

tcactccgtg cgatgcctaa cctttctttg atccgtccag cagacggcaa tgagacagca 1500

gcagcatgga agcttgcagt gcaaagcact gaccacccaa cagcgctagt gcttacacgt 1560

caaaaccttc ctaccatcga tcaaacagct gaagaagcat tggcaggagt agaaaaaggt 1620

gcatatgtcg tttctaaatc taaaaacgaa acacctgacg ctcttctcat cgcttccgga 1680

tcagaggtag gtcttgcaat tgaagcgcag gctgaattgg caaaagaaaa tatcgatgtt 1740

tctgttgtca gcatgccttc aatggaccgt tttgagaaac aatctgatga atacaaaaac 1800

gaagtccttc ctgcagatgt gaaaaaacgt cttgcaattg aaatgggctc atcatttgga 1860

tggggcaaat acacggggct tgaaggtgac gttctcggca tagaccgatt cggtgcatct 1920

gctccaggtg aaaccatcat taacgaatac gggatggggg gctatttttt cgccttgaga 1980

tgtttctata tagtatcaag ataa 2004

<210> 8

<211> 2004

<212> DNA

<213> SFA-H43 tkt基因

<400> 8