本發(fā)明屬于煙草種植領(lǐng)域，尤其涉及一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草屬草茄木，茄科一年生或有限多年生草本植物，基部稍木質(zhì)化?；ㄐ蝽斏?，圓錐狀，多花；蒴果卵狀或矩圓狀，長約等于宿存萼。夏秋季開花結(jié)果。主要分布于南美洲、南亞、中國。為有效提高煙草產(chǎn)量，提高產(chǎn)能，煙草的病害防治顯得尤為重要。

煙草赤星病由煙草赤星病菌引起，是世界各煙草產(chǎn)區(qū)煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一，在我國各煙區(qū)均有發(fā)生，每年發(fā)病面積約占我國種植面積的30～35％。目前，主要采用化學(xué)防治為主的防治技術(shù)，但藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)及病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)影響，限制了農(nóng)藥的大規(guī)模利用。分離篩選出對(duì)赤星病菌具有良好抑制作用和防治效果的拮抗菌是實(shí)施生物防治的一項(xiàng)重要工作。

因此，研發(fā)出一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中，化學(xué)防治煙草赤星病藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)和病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)影響，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中，化學(xué)防治煙草赤星病藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)和可能導(dǎo)致病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)影響，實(shí)現(xiàn)煙草赤星病的綠色防控。本發(fā)明提供的技術(shù)方案篩選而得的煙草赤星病拮抗菌，可發(fā)酵培育得到大量的、抑菌活性高的煙草赤星病拮抗菌，對(duì)于煙草赤星病的生物防治起到積極的防治作用。

本發(fā)明提供了一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法為：所述煙草赤星病拮抗菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，得煙草赤星病拮抗菌；

所述振蕩培養(yǎng)的時(shí)間為72h。

優(yōu)選地，所述煙草赤星病拮抗菌的接種量為0.1％～2％。

優(yōu)選地，所述煙草赤星病拮抗菌的接種量為0.5％。

優(yōu)選地，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為25～45℃。

更優(yōu)選地，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為30℃。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為5～9。

更優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6。

優(yōu)選地，所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為130～170r/min。

更優(yōu)選地，所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150r/min。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源選自：牛肉膏、甘露醇以及D-果糖中的一種或多種。

更優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為牛肉膏。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源選自：蛋白胨、酵母浸膏以及胰蛋白胨中的一種或多種。

更優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨。

優(yōu)選地，所述發(fā)酵方法還包括：分離提純；

所述分離提純步驟在所述振蕩培養(yǎng)后進(jìn)行。

本發(fā)明還提供了一種包括以上任意一項(xiàng)所述的發(fā)酵方法培養(yǎng)制得的煙草赤星病拮抗菌在煙草抗病領(lǐng)域的應(yīng)用。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法為：所述煙草赤星病拮抗菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，得煙草赤星病拮抗菌；所述振蕩培養(yǎng)的時(shí)間為72h。本發(fā)明還提供了一種上述發(fā)酵方法培育制得的煙草赤星病拮抗菌在煙草抗病領(lǐng)域的應(yīng)用。經(jīng)檢測可得，本發(fā)明提供的技術(shù)方案培育得到的煙草赤星病拮抗菌，抑菌率顯著提高，可用于煙草赤星病的防治。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法中，振蕩培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)于抑菌率的影響結(jié)果；

圖2為本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法中，接種量對(duì)于抑菌率的影響結(jié)果；

圖3為本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法中，振蕩培養(yǎng)的溫度對(duì)于抑菌率的影響結(jié)果；

圖4為本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對(duì)于抑菌率的影響結(jié)果；

圖5為本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法中，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速對(duì)于抑菌率的影響結(jié)果；

圖6為本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源對(duì)于抑菌率的影響結(jié)果；

圖7為本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源對(duì)于抑菌率的影響結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法及其應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中，化學(xué)防治煙草赤星病藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)和可能導(dǎo)致病原菌抗藥性風(fēng)險(xiǎn)影響，實(shí)現(xiàn)煙草赤星病的綠色防控。本發(fā)明提供的技術(shù)方案篩選而得的煙草赤星病拮抗菌，可發(fā)酵培育得到大量的、抑菌活性高的煙草赤星病拮抗菌，對(duì)于煙草赤星病的生物防治起到積極的防治作用。

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了更詳細(xì)說明本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法及其應(yīng)用，進(jìn)行具體地描述。

本發(fā)明的下述實(shí)施例中，抑菌活性用抑菌率表示，計(jì)算公式為：

抑菌率(％)＝【(ck菌落直徑-處理菌落直徑)/ck菌落直徑】*100％

實(shí)施例1

本實(shí)施例為分離煙草赤星病拮抗菌的具體實(shí)施例。

1.1備料

煙草赤星病菌：由江西省煙葉科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室分離保存。

土壤樣品：采自瑞金市壬田鎮(zhèn)煙草種植區(qū)煙草赤星病菌感染區(qū)的健康煙草植物根際土壤。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂18g和去離子水1000mL混合制得。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂18g和去離子水1000mL混合制得。

高氏I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g、KNO₃1g、K₂HPO₄0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl0.05g、FeSO₄·7H₂O0.01g、瓊脂18g和去離子水1000mL混合制得。

1.2土壤細(xì)菌和放線菌的分離和純化

稱取10g研磨好的土樣裝入滅菌的三角瓶中，加入90mL無菌水，制成1:10的土壤稀釋液，在28℃搖床中充分震蕩培養(yǎng)30分鐘，然后配成10^-1～10^-5稀釋液備用。分別取上述5個(gè)濃度土壤稀釋液100μL，分別加入已做好的NA和高氏I號(hào)平板培養(yǎng)基上，用滅菌的玻璃涂棒將稀釋液均勻的涂布，放入28℃恒溫箱中培養(yǎng)，設(shè)三個(gè)重復(fù)。通過肉眼觀察挑取培養(yǎng)特征不同的單菌落，純化后保存在4℃冰箱中備用。

1.3平板初篩及抑菌率測定

初篩采用平板對(duì)峙法，對(duì)分離純化到的放線菌和細(xì)菌，以供試病原真菌為靶標(biāo)，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，用瓊脂平板直接測定。具體方法為：在PDA平板中心接種病原菌菌餅，四周接種待測的放線菌菌株。于28～30℃恒溫培養(yǎng)4d，觀察是否有抑菌圈產(chǎn)生。有抑菌圈的，測量抑菌圈半徑，計(jì)算抑菌率。

1.4初篩拮抗菌發(fā)酵液抑菌活性復(fù)篩

選擇在初篩中拮抗性好的放線菌或細(xì)菌，以液體發(fā)酵培養(yǎng)的方法進(jìn)行繁殖，測定發(fā)酵濾液對(duì)病原菌的拮抗性，其方法為：

(1)、放線菌或細(xì)菌接入液體培養(yǎng)基，恒溫水浴搖床培養(yǎng)，28℃，150r/min，培養(yǎng)72h。

(2)、發(fā)酵液預(yù)處理：放線菌液體培養(yǎng)72h后取出，靜置1h后，在無菌條件下過濾，得發(fā)酵濾液。

(3)、生長速率法測定拮抗性：將發(fā)酵濾液取3mL注入培養(yǎng)皿中，然后將熔化的PDA培養(yǎng)基(約15mL)倒入皿中與發(fā)酵濾液混合均勻，冷卻后接病原菌的菌餅。分別以加無菌水的和不接菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)液的PDA平板為對(duì)照，28℃恒溫培養(yǎng)3d后測量菌落直徑，計(jì)算抑制率。

1.5拮抗菌的分子鑒定

將上述抑菌率最優(yōu)的細(xì)菌用常規(guī)分子鑒定方法，鑒定拮抗菌的種類。經(jīng)鑒定，該拮抗菌為芽孢桿菌(Bacillus vanillea)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例為檢測在煙草赤星病拮抗菌，即芽孢桿菌的發(fā)酵方法中，振蕩培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)于拮抗菌抑菌率影響的具體實(shí)施例。

以1％接種量將拮抗菌培養(yǎng)液接種到發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于28℃，150r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)24、48、72、96、120和144h后檢測不同振蕩培養(yǎng)對(duì)菌株抑菌活性的影響，確定最適振蕩培養(yǎng)時(shí)間。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱圖1。由圖1可得，振蕩培養(yǎng)對(duì)發(fā)酵液產(chǎn)生抑菌效果的影響較大，抑菌活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。振蕩培養(yǎng)24～72h時(shí)抑菌率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸增大，在發(fā)酵72h時(shí)菌株的抑菌效果最好，抑菌率達(dá)到最大，為77.72％。因此，振蕩培養(yǎng)72h對(duì)赤星病菌的抑菌率與其他7種發(fā)酵時(shí)間相比較，抑菌效果最佳。

實(shí)施例3

本實(shí)施例為檢測在煙草赤星病拮抗菌，即芽孢桿菌的發(fā)酵方法中，振蕩培養(yǎng)的溫度對(duì)于拮抗菌抑菌率影響的具體實(shí)施例。

在1％接種量、150r/min轉(zhuǎn)速條件下，選用實(shí)施例2中已確定的最適振蕩培養(yǎng)時(shí)間，分別以20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃6個(gè)培養(yǎng)溫度進(jìn)行發(fā)酵，檢測不同溫度對(duì)拮抗菌抑菌活性的影響，確定菌株最適振蕩培養(yǎng)溫度。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱圖3。由圖3可得，在25～45℃范圍內(nèi)，菌株的抑菌率都呈現(xiàn)在一個(gè)良好的抑菌狀態(tài)；其中，在30℃時(shí)抑菌活性最高，抑制率為53.08％。因此，最適宜的振蕩培養(yǎng)溫度為30℃。

實(shí)施例4

本實(shí)施例為檢測在煙草赤星病拮抗菌，即芽孢桿菌的發(fā)酵方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對(duì)于拮抗菌抑菌率影響的具體實(shí)施例。

在1％接種量和150r/min轉(zhuǎn)速的條件下，將培養(yǎng)基初始pH值分別設(shè)置為5、6、7、8、9和10等6個(gè)不同梯度，選用已確定的最適發(fā)酵時(shí)間和溫度進(jìn)行發(fā)酵，檢測不同pH值對(duì)拮抗菌抑菌活性的影響，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始pH值。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱圖4。由圖4可得，在培養(yǎng)基初始pH為5～9范圍內(nèi)，菌株的抑菌率都呈現(xiàn)在一個(gè)良好的抑菌狀態(tài)；其中，在培養(yǎng)基初始為7時(shí)抑菌活性最高。因此，最適宜的培養(yǎng)基初始為7。

實(shí)施例5

本實(shí)施例為檢測在煙草赤星病拮抗菌，即芽孢桿菌的發(fā)酵方法中，接種量對(duì)于拮抗菌抑菌率影響的具體實(shí)施例。

在150r/min轉(zhuǎn)速的條件下，分別以0.05％、0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的接種量將拮抗菌培養(yǎng)液接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，選用已確定的最適發(fā)酵時(shí)間、溫度和初始pH值進(jìn)行發(fā)酵，檢測不同接種量對(duì)拮抗菌抑菌活性的影響，確定最適接種量。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱圖2。由圖2可得，在接種量為0.1％～2％的范圍內(nèi)，菌株的抑菌率都呈現(xiàn)在一個(gè)良好的抑菌狀態(tài)；其中，在接種量為0.5％時(shí)抑菌活性最高。因此，最適宜的接種量為0.5％。

實(shí)施例6

本實(shí)施例為檢測在煙草赤星病拮抗菌，即芽孢桿菌的發(fā)酵方法中，振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速對(duì)于拮抗菌抑菌率影響的具體實(shí)施例。

設(shè)置振蕩培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)速分別為100r/min、130r/min、150r/min、170r/min、190r/min和210r/min共計(jì)6個(gè)不同轉(zhuǎn)速，并在實(shí)施例2～5已確定的最適發(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH值和接種量下進(jìn)行發(fā)酵，檢測不同轉(zhuǎn)速對(duì)拮抗菌抑菌活性的影響，確定最佳轉(zhuǎn)速。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱圖5。由圖5可得，在振蕩培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)速為130～170r/min的范圍內(nèi)，菌株的抑菌率都呈現(xiàn)在一個(gè)良好的抑菌狀態(tài)；其中，在振蕩培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)抑菌活性最高。因此，最適宜的振蕩培養(yǎng)的搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。

實(shí)施例7

本實(shí)施例為檢測在煙草赤星病拮抗菌，即芽孢桿菌的發(fā)酵方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源對(duì)于拮抗菌抑菌率影響的具體實(shí)施例。

碳源是微生物生長必需的一類重要營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中的碳水化合物不僅是微生物生命活動(dòng)能量的主要來源，而且也是微生物各種代謝產(chǎn)物的主要原料。以碳源添加量為0.3％的比例，分別用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-果糖、牛肉膏以及甘露醇為菌株生長提供碳源，并在實(shí)施例2～6已確定的最適發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值、接種量和最佳轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行發(fā)酵，檢測不同碳源對(duì)拮抗菌抑菌活性的影響，確定最佳碳源。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱圖6。由圖6可得，在發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源選自：牛肉膏、甘露醇以及D-果糖中的一種或多種時(shí)，菌株的抑菌率都呈現(xiàn)在一個(gè)良好的抑菌狀態(tài)；其中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為牛肉膏時(shí)，抑菌活性最高。因此，最適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為牛肉膏。

實(shí)施例8

本實(shí)施例為檢測在煙草赤星病拮抗菌，即芽孢桿菌的發(fā)酵方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源對(duì)于拮抗菌抑菌率影響的具體實(shí)施例。

以氮源添加量為1％的比例，分別用蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏、草酸銨以及脲為菌株生長提供氮源，并在實(shí)施例2～7已確定的最適發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值、接種量、轉(zhuǎn)速和碳源條件下進(jìn)行發(fā)酵，檢測不同氮源對(duì)拮抗菌抑菌活性的影響，確定最佳氮源。

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參閱圖7。由圖7可得，在發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源選自：蛋白胨、酵母浸膏以及胰蛋白胨中的一種或多種時(shí)，菌株的抑菌率都呈現(xiàn)在一個(gè)良好的抑菌狀態(tài)；其中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨時(shí)，抑菌活性最高。因此，最適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種煙草赤星病拮抗菌的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法為：所述煙草赤星病拮抗菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，得煙草赤星病拮抗菌；所述振蕩培養(yǎng)的時(shí)間為72h。本發(fā)明還提供了一種上述發(fā)酵方法培育制得的煙草赤星病拮抗菌在煙草抗病領(lǐng)域的應(yīng)用。經(jīng)檢測可得，本發(fā)明提供的技術(shù)方案培育得到的煙草赤星病拮抗菌，抑菌率顯著提高，可用于煙草赤星病的防治。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。