本發(fā)明涉及植物內(nèi)生放線菌與生物防治領(lǐng)域，具體涉及一株具有拮抗稻瘟病菌的水稻內(nèi)生放線菌的分離及抗性相關(guān)研究。
背景技術(shù)：
：水稻稻瘟病是指由稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）引起的一種水稻真菌病害。稻瘟病菌生存能力很強(qiáng)及傳播廣泛的特點(diǎn)，使其成為對(duì)水稻危害最為嚴(yán)重的病害之一。目前對(duì)稻瘟病的防治主要包括抗病品種選育和藥劑防治。但是長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，污染環(huán)境，損害人類健康，還導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。稻瘟病菌的遺傳背景復(fù)雜且易變異，使得水稻抗病品種難以跟上致病菌生理小種的變異速度，在3-5年后就喪失抗病性。而采用以農(nóng)業(yè)可持續(xù)化發(fā)展為宗旨的生物防治方法，利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物控制稻瘟病菌，相對(duì)來(lái)說(shuō)更加安全高效。內(nèi)生菌是可以在其整個(gè)或部分生長(zhǎng)周期中穩(wěn)定定殖在植物內(nèi)部的微生物菌群。與根際和土壤微生物相比，內(nèi)生菌生長(zhǎng)在植物內(nèi)部而不會(huì)與土壤菌產(chǎn)生生存競(jìng)爭(zhēng)。而且，內(nèi)生菌在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，與植物形成了互利互惠的關(guān)系。它可以直接抵抗病菌的侵染或通過(guò)促進(jìn)寄主植物的生長(zhǎng)或誘發(fā)免疫反應(yīng)來(lái)間接提高植物抗病性。目前報(bào)到的用于稻瘟病生物防治的抗病性內(nèi)生菌大多是易培養(yǎng)的細(xì)菌和真菌類群，較難分離的內(nèi)生放線菌則報(bào)道較少。但放線菌作為抗生素的主要來(lái)源，其生防潛能更大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一株具有防治稻瘟病潛力的水稻內(nèi)生放線菌OsiLf-2，該菌株分離自稻瘟病發(fā)病區(qū)的水稻葉部，已于2015年11月16日由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）保藏（保藏地址是：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)），保藏號(hào)為CGMCCNo.11673，分類命名為產(chǎn)水鏈霉菌Streptomyceshydrogenans，發(fā)明人將其命名為OsiLf-2，經(jīng)檢測(cè)存活。該菌16sRNA的Genbank登錄號(hào)為KU350524。本發(fā)明所得菌株生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，易于培養(yǎng)。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）上生長(zhǎng)時(shí)，氣生菌絲黃白色，呈放射狀生長(zhǎng)，分枝較多，不產(chǎn)生可溶性色素。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其孢子呈連續(xù)棒狀結(jié)構(gòu)。該菌株在pH為6.0-12.0和溫度為20℃-40℃環(huán)境中均可良好生長(zhǎng)；能使淀粉水解，酪蛋白水解，明膠液化，能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶；能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、半乳糖、甘露醇、柳醇。發(fā)明所得菌株能對(duì)至少5種不同生理小種的稻瘟病菌有較好拮抗作用，能明顯抑制菌絲生長(zhǎng)，其對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)抑制率最高達(dá)83%。發(fā)明所得菌株發(fā)酵液有較好的抗稻瘟病菌活性，培養(yǎng)溫度為35℃或培養(yǎng)基pH為7的發(fā)酵液抗稻瘟病菌活性較好。當(dāng)其生長(zhǎng)量達(dá)到最大時(shí)，其發(fā)酵液的抗稻瘟病菌能力也基本達(dá)到最強(qiáng)，其后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，抗性也能保持穩(wěn)定。發(fā)酵液用蛋白酶K、低溫、強(qiáng)光照和紫外處理一個(gè)小時(shí)仍然保持完整的活性；100℃處理一個(gè)小時(shí)仍然保留了大部分的活性；強(qiáng)酸和強(qiáng)堿處理一個(gè)小時(shí)，也能保持較好的抗菌活性。上述特征表明本發(fā)明提供的內(nèi)生放線菌OsiLf-2，具有較強(qiáng)的抗真菌活性，且其抗菌成分藥效持久、穩(wěn)定，在生物防治水稻稻瘟病和開發(fā)新型、高效的農(nóng)用新藥物等方面具有較大的開發(fā)潛力。附圖說(shuō)明圖1：本發(fā)明菌株OsiLf-2的菌落形態(tài)圖（A）及掃描電子顯微鏡觀察圖（B）；圖2：本發(fā)明菌株OsiLf-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖3：本發(fā)明菌株OsiLf-2對(duì)5種不同生理小種稻瘟病菌的抑制情況，A-E.稻瘟病菌對(duì)照；F-J.OsiLf-2對(duì)5種不同生理小種的稻瘟病菌的抑制；圖4：稻瘟病菌RB3在掃描電子顯微鏡下，未經(jīng)OsiLf-2處理（A）和經(jīng)OsiLf-2處理的（B）菌絲體形態(tài)；圖5：本發(fā)明菌株OsiLf-2在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)量及抗稻瘟病菌活性（A.不同培養(yǎng)時(shí)間；B.不同培養(yǎng)基pH；C.不同培養(yǎng)溫度）。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：OsiLf-2菌株的分離、純化和篩選取湖南亞華種業(yè)科學(xué)研究院瀏陽(yáng)大圍山基地易感秈稻品種，將發(fā)病不嚴(yán)重的葉片洗凈，植物表面消毒，干燥后置于甘露醇大豆瓊脂培養(yǎng)基（MS）上，置于27℃培養(yǎng)，待內(nèi)生放線菌長(zhǎng)出，再結(jié)合劃線分離法在固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上獲得其純培養(yǎng)物。采用平板對(duì)峙法，將分離得到的菌株與稻瘟病菌同時(shí)接種到PDA固體平板上，放入霉菌培養(yǎng)箱中28℃倒置培養(yǎng)，每天觀察，篩選出拮抗真菌效果最明顯的菌株OsiLf-2，其對(duì)稻瘟病菌菌絲抑制率最高達(dá)83%，見附圖3。實(shí)施例2：OsiLf-2菌株的生物學(xué)鑒定1．菌株形態(tài)特征（1）菌落形態(tài)特征：將OsiLf-2單菌落劃線接種至PDA固體培養(yǎng)基中，將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱，28℃培養(yǎng)，3天以內(nèi)長(zhǎng)出無(wú)色基生菌絲和氣生菌絲，菌落表面平滑、邊緣呈褶皺。3天后長(zhǎng)出黃白色白色孢子覆蓋在菌落上。見附圖1A。（2）菌體形態(tài)特征：用插片法培養(yǎng)該菌，在電子顯微鏡下觀察其氣生菌絲及孢子情況，見附圖1B。2.OsiLf-2菌株16SrRNA分析采用革蘭氏陽(yáng)性菌基因組DNA提取試劑盒（ShanghaiGenerayBiotechCo.,Ltd）的方法，抽提菌株基因組DNA，以該DNA為模板，采用放線菌16SrRNA基因引物（27F-765R及704F-1492R），擴(kuò)增出菌株的16SrRNA片段并測(cè)序，將得到的16SrRNA序列與Eztaxon的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast同源性比對(duì)(http://www.ezbiocloud.net)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知放線菌Streptomyceshydrogenans的16SrRNA全長(zhǎng)序列的相似性達(dá)到了100%，保守區(qū)序列的相似性達(dá)到100%，將該菌株鑒定為鏈霉菌屬，命名為產(chǎn)水鏈霉菌StreptomyceshydrogenansOsiLf-2。使用軟件MEGA5.0采用鄰近結(jié)合法（neighbor-joiningmethod）制作OsiLf-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹，見附圖2。實(shí)施例3：OsiLf-2菌株對(duì)不同生理小種稻瘟病菌的抑制采用平板對(duì)峙法，在直徑為90mm的培養(yǎng)皿中心接種不同生理小種稻瘟病菌。其中RB3，61，62，SO7來(lái)自湖南亞華種子有限公司，Guy11來(lái)自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。刮取活化好的OsiLf-2在距離病原真菌30mm的位置上劃一直線。28℃倒置培養(yǎng)7天以上，結(jié)果見附圖3，OsiLf-2對(duì)稻瘟病菌RB3、61、62、Guy11、SO7的抑制率分別為74.1%、74.6%、82.9%、83.0%、80.6%。實(shí)施例4：OsiLf-2菌株對(duì)稻瘟病菌RB3菌絲體的影響取平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中接近放線菌邊緣和對(duì)照組中相對(duì)應(yīng)位置的稻瘟病菌RB3菌塊，經(jīng)過(guò)戊二醛和鋨酸固定后，洗脫干燥處理并噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)變化，結(jié)果見附圖4，可見經(jīng)OsiLf-2處理后的稻瘟病菌RB3的菌絲體出現(xiàn)了明顯的畸形和菌絲斷裂。實(shí)施例5：OsiLf-2菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況及其發(fā)酵液抗稻瘟病活性采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定菌株的生長(zhǎng)情況。將OsiLf-2接種至酵母麥芽提取物液體培養(yǎng)基（ISP2）中，在28℃，150r/min震蕩培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10天，每天取出一定量的菌液，8000rpm離心10min取出上清液，菌體烘干至恒重并稱重。上清液經(jīng)0.22um無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾后按10%的比例加入PDA培養(yǎng)基中，混合均勻倒置平板并接種稻瘟病真菌，28℃倒置培養(yǎng)7天以上。檢測(cè)不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵液的抗稻瘟病活性的影響，皆采用ISP2液體培養(yǎng)基，150r/min震蕩培養(yǎng)。溫度梯度選擇20℃-40℃，pH=7；pH梯度選擇pH=6-pH=12，28℃。其結(jié)果見附圖5，可見本發(fā)明菌株OsiLf-2在不同的培養(yǎng)條件下均表現(xiàn)出一定的抗稻瘟病菌活性，且培養(yǎng)溫度為35℃或培養(yǎng)基pH為7的時(shí)候發(fā)酵液抗稻瘟病菌活性較大。實(shí)施例6：OsiLf-2菌株發(fā)酵液抗菌活力穩(wěn)定性研究將OsiLf-2接種至ISP2液體培養(yǎng)基中，在28℃，150r/min震蕩培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，菌液經(jīng)8000rpm離心10min得到上清液，將上清液分別置于1）-20℃、37℃、70℃、100℃、121℃條件下分別處理1小時(shí)；2）pH=2、pH=14條件下處理1小時(shí)，3）分別用1mg/ml的蛋白酶K、8000lx的強(qiáng)光照射、70uW/cm2的紫外照射處理1小時(shí)。將處理過(guò)后的上清液按實(shí)施例5的方法檢測(cè)其稻瘟病活性。其結(jié)果見表1，可見經(jīng)不同物理化學(xué)法處理后的OsiLf-2發(fā)酵液依然保持了較好的抗稻瘟病活性，具備良好的穩(wěn)定性。表1本發(fā)明所述內(nèi)生放線菌OsiLf-2的發(fā)酵液抗真菌物質(zhì)的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果：處理方式菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)未處理63熱處理37℃，1h6250℃，1h6370℃，1h61100℃，1h49121℃，1h20低溫處理-20℃,1h64酶處理蛋白酶K61光處理強(qiáng)光照,1h63紫外照射,1h62酸堿處理pH=21h58pH=141h30當(dāng)前第1頁(yè)1 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