本發(fā)明涉及使用基因修飾的微生物生產(chǎn)木糖醇的方法、以及制備能夠?qū)⒁椎锰荚?如D-葡萄糖)一步轉(zhuǎn)化為木糖醇的基因修飾的微生物的方法。發(fā)明背景木糖醇是具有化學(xué)式(CHOH)3(CH2OH)2的在保健學(xué)與營(yíng)養(yǎng)配制品和產(chǎn)品中具有應(yīng)用的多元醇或糖醇(醛糖醇)。木糖醇被用作大致像蔗糖一樣甜、少33％卡路里的糖尿病甜味劑。不像其他天然或合成甜味劑，木糖醇通過在規(guī)律使用中將齲齒減少至三分之一而對(duì)牙齒健康有積極益處并且有助于再礦化。木糖醇以低濃度天然存在于許多水果和蔬菜的纖維中，并且可以從各種漿果、燕麥、和蘑菇、以及纖維材料(如玉米殼和甘蔗渣)與樺木中提取。然而，工業(yè)生產(chǎn)以從硬木或玉米芯中提取的木聚糖(一種半纖維素)開始，木聚糖被水解成木糖并被催化氫化成木糖醇。因此，木糖以及還有木糖醇的純化呈現(xiàn)顯著問題。許多這種類型的工藝是已知的。美國(guó)專利4,075,406和4,008,285可以作為實(shí)例提及。D-木糖還原為木糖醇也可以在微生物過程中使用從自然界中分離的酵母菌株(野生型菌株)或基因工程化的菌株來實(shí)現(xiàn)。然而，獲得呈適于酵母發(fā)酵形式的底物D-木糖是個(gè)問題，因?yàn)榱畠r(jià)的木糖來源(如來自制漿和造紙工藝的亞硫酸鹽溶液)含有抑制酵母生長(zhǎng)的雜質(zhì)。生產(chǎn)木糖醇的有吸引力的替代方法是通過發(fā)酵便宜且易得的底物(如D-葡萄糖)來獲得它。在現(xiàn)有技術(shù)中，存在一些被描述為能夠在不同于D-木糖和D-木酮糖的任何常見碳源的一步發(fā)酵期間產(chǎn)生一定量木糖醇的重組微生物。這些重組微生物(尤其是嗜滲酵母)是例如魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、多形假絲酵母(Candidapolymorpha)、和念珠球擬酵母(Torulopsiscandida)，它們最初作為從D-葡萄糖生產(chǎn)顯著量的木糖醇密切相關(guān)戊糖醇(其是D-阿糖醇)的生產(chǎn)者而已知(路易斯(Lewis)D.H.&史密斯(Smith)D.C.，1967，新植物學(xué)家(NewPhytol.)66:143-184)。因此，國(guó)際專利申請(qǐng)WO94/10325提供了用于構(gòu)建這樣的當(dāng)在不同于D-木酮糖或D-木糖且不同于其聚合物或寡聚物或混合物的碳源上生長(zhǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生木糖醇的重組宿主的方法。在當(dāng)前專利申請(qǐng)中，這個(gè)目標(biāo)是通過引入并表達(dá)希望的異源基因而對(duì)希望的微生物(優(yōu)選天然存在的酵母微生物)的代謝進(jìn)行修飾來實(shí)現(xiàn)的。這個(gè)目標(biāo)還通過以下方式來實(shí)現(xiàn)：進(jìn)一步修飾這樣的希望的微生物的代謝，以便過表達(dá)某些對(duì)處于其天然狀態(tài)的這樣的微生物而言同源的基因和/或使其活性或表達(dá)失活。在這個(gè)專利申請(qǐng)中提供的用于生產(chǎn)木糖醇的方法利用改變的D-阿糖醇生物合成途徑，并且這樣的途徑尤其通過向D-阿糖醇生產(chǎn)微生物中引入編碼D-木酮糖形成型D-阿糖醇脫氫酶(EC1.1.1.11)和木糖醇脫氫酶(EC1.1.1.9)的基因并使其過表達(dá)來延伸預(yù)先存在的D-阿糖醇途徑而進(jìn)行改變。然而，描述于WO94/10325中的試驗(yàn)中的木糖醇產(chǎn)率在具有酵母提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)之后僅為大約7.7g/l。為了嘗試優(yōu)化這個(gè)第一結(jié)果，在WO94/10325中進(jìn)一步提出使用誘變或基因破壞使編碼轉(zhuǎn)酮醇酶(EC2.2.1.1)的基因和/或編碼D-木酮糖激酶(EC2.7.1.17)的基因失活，并且還在此類微生物中過表達(dá)編碼戊糖磷酸途徑的氧化分支的酶的基因并且具體是D-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC1.1.1.49)和/或6-磷酸-D-葡糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)和/或D-核酮糖-5-磷酸差向異構(gòu)酶(EC5.1.3.1)基因。但是，無論使用什么遺傳組合，木糖醇滴度從未多于9g/l。因此對(duì)木糖醇生產(chǎn)菌株進(jìn)行更好遺傳操縱以便優(yōu)化其生產(chǎn)并且因此使得它具備商業(yè)利潤(rùn)仍存在未滿足的需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠產(chǎn)生木糖醇的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含：編碼使用D-阿糖醇作為底物并且產(chǎn)生D-木酮糖作為產(chǎn)物的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(EC1.1.1.11)的異源核酸序列；和，編碼使用D-木酮糖作為底物并且產(chǎn)生木糖醇作為產(chǎn)物的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的異源核酸序列。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞不消耗作為唯一碳源的D-阿糖醇。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、真菌和酵母。在優(yōu)選實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是嗜滲的或耐滲的酵母，特別是奧默畢赤酵母(Pichiaohmeri)。優(yōu)選地，NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(EC1.1.1.11)來自大腸桿菌或青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)。更優(yōu)選地，NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(EC1.1.1.11)包含SEQIDNo2或43的序列或具有1-3個(gè)氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其組成。在優(yōu)選實(shí)施例中，編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(EC1.1.1.11)的序列包含SEQIDNo3或42的序列或由其組成。優(yōu)選地，NADPH特異性木糖醇脫氫酶是來自被突變以改變從NADH到NADPH的輔因子特異性的樹干畢赤酵母或氧化葡糖桿菌(Gluconobacteroxydans)的木糖醇脫氫酶。更優(yōu)選地，NADPH特異性木糖醇脫氫酶包含SEQIDNo5或8的序列或具有1-3個(gè)氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其組成。在優(yōu)選實(shí)施例中，編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的序列包含SEQIDNo6或9的序列或由其組成。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞能夠在48h培養(yǎng)之后在上清液中產(chǎn)生至少15g/l的木糖醇滴度。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是選自保藏在CNCM的菌株I-4982、I-4960和I-4981的菌株。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞包含編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的序列的若干拷貝和/或編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的序列的若干拷貝。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)木糖醇的方法，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，并且回收木糖醇。本發(fā)明另外涉及包含選自由SEQIDNo1、3、7和9組成的組的核酸序列或由其組成的核酸，包含所述核酸的表達(dá)盒或載體。最后，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)木糖醇的用途。發(fā)明詳細(xì)說明定義如在此使用的，“不同于D-木糖和D-木酮糖的碳源”意指不同于D-木糖和D-木酮糖或其聚合物或寡聚物或混合物(如木聚糖和半纖維素)的用于木糖醇生產(chǎn)的碳底物。碳源優(yōu)選地包括D-葡萄糖、以及各種含有D-葡萄糖的糖漿和D-葡萄糖與其他糖的混合物。如在此使用的，“基因”意指可以編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，特別是DNA序列。如在此使用的，“載體”意指能夠?qū)⑦z傳信息(確切地是DNA)帶進(jìn)宿主細(xì)胞的質(zhì)?；蛉魏纹渌鸇NA序列。載體可以進(jìn)一步含有適于在鑒定用該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中使用的標(biāo)記或報(bào)告子、以及允許在一個(gè)或多個(gè)原核或真核宿主中維持并復(fù)制該載體的復(fù)制起點(diǎn)?！百|(zhì)?！笔窃谥辽僖粋€(gè)宿主細(xì)胞中維持并自主復(fù)制的載體，通常是環(huán)狀DNA。如在此使用的，“表達(dá)載體”意指類似于載體但在轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主之后支持已經(jīng)被克隆進(jìn)其中的基因或編碼核酸的表達(dá)的載體。經(jīng)克隆的基因或編碼核酸通常被置于某些控制序列(如啟動(dòng)子序列)的控制之下(即，與其可操作地連接)，這些控制序列可以由載體或通過經(jīng)克隆的基因的重組構(gòu)建來提供。表達(dá)控制序列將取決于載體是否被設(shè)計(jì)成在原核或真核宿主中表達(dá)可操作地連接的基因而變化，并且可以另外含有轉(zhuǎn)錄元件如增強(qiáng)子元件(上游激活序列)和終止序列、和/或翻譯起始和終止位點(diǎn)。如在此使用的，“宿主”意指被用作重組材料的受體和載體的原核的或真核的細(xì)胞。如在此使用的，“戊糖磷酸途徑的氧化分支”意在包括催化氧化反應(yīng)(如由D-葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(EC1.1.1.49)、葡糖酸內(nèi)酯酶(EC3.1.1.17)、和6-磷酸-D-葡糖酸脫氫酶(EC1.1.1.44)催化的反應(yīng))，且利用己糖底物形成戊糖磷酸的戊糖磷酸旁路部分。戊糖磷酸途徑的“非氧化”部分(其也催化從D-葡萄糖凈形成核糖)由非氧化異構(gòu)化(如由轉(zhuǎn)酮醇酶(EC2.2.1.1)、核糖-5-磷酸異構(gòu)酶(EC5.3.1.6)、D-核酮糖-5-磷酸-3-差向異構(gòu)酶(EC5.1.3.1)和轉(zhuǎn)醛醇酶(EC2.2.1.2)催化的反應(yīng))表征。參見生物化學(xué)(BiologicalChemistry)，H.R.馬勒(Mahler)&E.H.科德斯(Cordes)，哈珀與羅出版公司(Harper&Row,publishers)，紐約，1966，第448-454頁。如在此使用的，“編碼核酸”意指核酸分子(優(yōu)選DNA)。編碼核酸能夠編碼蛋白質(zhì)并且可以制備自多種來源。這些來源包括基因組DNA、cDNA、合成DNA、及其組合。如在此使用的，“異源的”被理解為意指基因或編碼序列已經(jīng)通過基因工程被引入細(xì)胞中。它能以附加體或染色體形式存在?；蚧蚓幋a序列可以源于與它所引入的宿主細(xì)胞不同的來源。然而，它也可以來自與它所引入的宿主細(xì)胞相同的物種，但是由于其非天然的環(huán)境它被認(rèn)為是異源的。例如，基因或編碼序列被稱為異源的，因?yàn)樗幱谧鳛槠浞翘烊粏?dòng)子的啟動(dòng)子的控制之下，它被引入在不同于其天然位置的位置處。宿主細(xì)胞在引入異源基因之前可以含有該基因的內(nèi)源拷貝，或者它可以不含有內(nèi)源拷貝。發(fā)明目的根據(jù)本發(fā)明，操縱具體微生物宿主的天然代謝途徑，以便降低或消除用于不同于木糖醇生產(chǎn)目的的碳利用。這樣一種基因修飾的宿主菌株因此能夠在一個(gè)發(fā)酵步驟中以高產(chǎn)率產(chǎn)生木糖醇。例如，在48h培養(yǎng)之后上清液中的木糖醇滴度多于15g/l，優(yōu)選地多于25g/l，仍更優(yōu)選地多于50、60、70、80、90或100g/l。在本發(fā)明的實(shí)際實(shí)現(xiàn)中，本發(fā)明的基因修飾的宿主還由其從結(jié)構(gòu)無關(guān)的碳源(如D-葡萄糖)而非僅從D-木糖和/或D-木酮糖合成木糖醇的能力表征。優(yōu)選地，本發(fā)明的基因修飾的宿主還能夠?qū)⒑铣傻哪咎谴挤置诘脚囵B(yǎng)基中。具體地，在示例且優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的基因修飾的宿主由其中阿糖醇作為木糖醇形成中的中間體的途徑表征。因此，本發(fā)明的重組宿主菌株由以下遺傳改變表征：(1)編碼具有NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(D-木酮糖形成)活性的蛋白質(zhì)的異源核酸已被引入該宿主細(xì)胞中-因此提供D-阿糖醇向D-木酮糖的轉(zhuǎn)化；和(2)編碼具有NADPH特異性木糖醇脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的異源核酸已被引入該宿主細(xì)胞中-因此提供D-木酮糖向木糖醇的轉(zhuǎn)化。微生物的選擇適于本發(fā)明的微生物或宿主菌株能夠從葡萄糖生產(chǎn)D-阿糖醇。更具體地，它們能夠在高滲透壓培養(yǎng)基下從葡萄糖生產(chǎn)顯著量的D-阿糖醇?！案邼B透壓培養(yǎng)基”在此旨在指代含有10％-60％D-葡萄糖、優(yōu)選約25％D-葡萄糖的培養(yǎng)基。“顯著量的D-阿糖醇”旨在是至少100g/L的D-阿糖醇。具體而言，當(dāng)微生物或宿主菌株在分批條件下在含有25％D-葡萄糖的培養(yǎng)基中產(chǎn)生100g/LD-阿糖醇時(shí)，該微生物或宿主菌株被認(rèn)為產(chǎn)生顯著量的D-阿糖醇。能夠從葡萄糖生產(chǎn)顯著量的D-阿糖醇的宿主菌株的實(shí)例包括嗜滲的或耐滲的酵母，特別是屬于畢赤酵母屬、柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、假絲酵母屬、接合酵母屬、德巴利酵母屬(Debaromyces)、梅奇酵母屬(Metschnikowia)和漢遜酵母屬的種的那些；或D-阿糖醇生產(chǎn)真菌，特別是屬于小樹狀霉屬(Dendryphiella)和裂褶菌屬的種的那些，特別是鹽沼小樹狀霉(Dendryphiellasalina)和裂褶菌(Schizophyllumcommune)。畢赤酵母屬的微生物的實(shí)例包括奧默畢赤酵母、樹干畢赤酵母、粉狀畢赤酵母(Pichiafarinosa)、嗜鹽畢赤酵母(Pichiahaplophila)。假絲酵母屬的微生物的實(shí)例包括多形假絲酵母和熱帶假絲酵母。接合酵母屬的微生物的實(shí)例包括魯氏接合酵母。其他實(shí)例包括念珠球擬酵母和漢遜有孢圓酵母(Torulasporahansenii)。梅奇酵母屬的微生物的實(shí)例包括美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、魯考弗梅奇酵母(Metschnikowiareukaufii)、二尖梅奇酵母(Metschnikowiabicuspidata)、新月梅奇酵母(Metschnikowialunata)和佐貝爾梅奇酵母(Metschnikowiazobellii)。作為具體菌株，可以提及美極梅奇酵母ATCC18406、魯考弗梅奇酵母ATCC18407、二尖梅奇酵母ATCC24179、新月梅奇酵母ATCC22033、佐貝爾梅奇酵母ATCC22302和美極梅奇酵母FERMBP-7161。這些菌株可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得，地址：12301ParklawnDrive，羅克維爾市，馬里蘭州20852，美國(guó)。美極梅奇酵母FERNBP-7161最初在1998年1月16日在FERMP-16592保藏號(hào)下保藏在國(guó)際貿(mào)易與工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)院的國(guó)家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(NationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology,MinistryofInternationalTradeandIndustry)(郵政編碼：305-8566，1-3東村(Higashi)1-丁目(Chome)，筑波(Tsukuba-shi)，茨城縣(Ibaraki-ken)，日本)并且在2000年5月15日基于布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)從原始保藏中心轉(zhuǎn)移到國(guó)際保藏中心，并且已經(jīng)作為FERMBP-7161的保藏號(hào)進(jìn)行保藏。在具體方面中，該微生物具有登錄號(hào)FERMBP-7161。關(guān)于更多信息，參考EP1065276。該微生物可以被基因工程化，以便改進(jìn)其產(chǎn)生D-阿糖醇的能力和/或?qū)τ诓煌谀咎谴忌a(chǎn)的目的而言降低其使用D-阿糖醇的能力。對(duì)于本發(fā)明，通過其具體代謝屬性來有利地對(duì)宿主菌株進(jìn)行選擇：-它可以是如上詳細(xì)描述的特別是在高滲透壓培養(yǎng)基例如含有10％-60％D-葡萄糖且優(yōu)選25％D-葡萄糖的培養(yǎng)基(“正常”培養(yǎng)基通常僅含有2％-3％葡萄糖)下從葡萄糖生產(chǎn)顯著量的D-阿糖醇的生產(chǎn)者。-它可以不消耗作為唯一碳源的D-阿糖醇；-其氧化還原平衡允許生成對(duì)應(yīng)的戊酮糖/戊糖醇轉(zhuǎn)化所需的輔因子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，嗜滲酵母奧默畢赤酵母(及其經(jīng)誘變的衍生物)已被用作模型并被用作優(yōu)選宿主。奧默畢赤酵母最初已從黃瓜鹽水中分離并且在食品工業(yè)中常用于泡菜、外皮、和水果中的發(fā)酵。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，與釀酒酵母相反，酵母種(如畢赤酵母屬、接合酵母屬、德巴利酵母屬和漢遜酵母屬)能夠在低水活度環(huán)境中生長(zhǎng)。這些耐滲的或嗜滲的酵母積累保護(hù)并使酶穩(wěn)定化的相容性溶質(zhì)(像甘油、D-阿糖醇、赤蘚醇和甘露醇)，從而允許在滲透生長(zhǎng)條件下的細(xì)胞功能。產(chǎn)生的多元醇在氧化還原平衡中也發(fā)揮作用。在優(yōu)選方面中，微生物是奧默畢赤酵母。確實(shí)，宿主菌株奧默畢赤酵母的主要特征在于與產(chǎn)生甘油和D-阿糖醇的魯氏接合酵母相反，僅產(chǎn)生D-阿糖醇作為相容性溶質(zhì)。另外，從葡萄糖到D-阿糖醇的代謝途徑在奧默畢赤酵母中是熟知的。如在魯氏接合酵母中描述的(J.M.英格拉姆(INGRAM)和W.A.伍德(WOOD)，1965，細(xì)菌學(xué)雜志(JournalofBacteriology)，第89卷，第5期，1186-1194)，奧默畢赤酵母中的碳通量經(jīng)過戊糖磷酸途徑(PPP)的氧化部分，以將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-核酮糖-5-P，同時(shí)伴隨兩個(gè)分子的NADPH的產(chǎn)生。D-核酮糖-5-P脫磷酸成D-核酮糖并且然后還原成D-阿糖醇。在奧默畢赤酵母宿主菌株中，戊糖磷酸途徑(PPP)非常具活性并且已被確定為高于50％。在優(yōu)選實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是在2012年3月7日在編號(hào)I-4605下保藏在巴斯德研究所(InstitutPasteur)的國(guó)家微生物培養(yǎng)物保藏中心[CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes，NationalCollectionofMicroorganismCultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex15)的突變型奧默畢赤酵母。氧化還原反應(yīng)和酶輔因子NADH和NADPH是眾多生物功能所必需的，在所謂的氧化還原反應(yīng)中作為從一個(gè)反應(yīng)到另一個(gè)反應(yīng)的電子載體起作用。細(xì)胞需要維持兩個(gè)氧化還原對(duì)NADH/NAD+和NADPH/NADP+的代謝平衡，已知NADPH/NADP+對(duì)被維持為比NADH/NAD+對(duì)更具還原態(tài)，以提供熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力。主要以氧化形式NAD+存在的NADH是分解代謝反應(yīng)中的主要輔因子，在分解代謝反應(yīng)中它參與從營(yíng)養(yǎng)素氧化釋放能量。與NADH相比之下，NADPH在合成代謝反應(yīng)中或在氧化應(yīng)激的時(shí)間期間被排他地再氧化。涉及氧化還原反應(yīng)的任何代謝工程策略都必須在這些細(xì)胞約束下發(fā)揮作用。它已經(jīng)在作為本發(fā)明的目的的基因修飾的菌株中進(jìn)行。如本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的，尤其是在標(biāo)題為“對(duì)奧默畢赤酵母中戊糖醇代謝研究的貢獻(xiàn)(Contributionàl’étudedumetabolismedespentitolschezPichiaohmeri)”的博士論文(蘇菲·胡謝(SophieHuchette)，里爾科技大學(xué)(UniversityofSciencesandTechnicsofLille)，1992)中所描述的，已經(jīng)證明戊酮糖的氧化還原中所涉及的反應(yīng)由兩種不同的酶催化。因此，宿主菌株具有從D-核酮糖形成D-阿糖醇和從D-木酮糖形成木糖醇的被定義為NADPH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶的酶。宿主菌株還具有分別從D-核酮糖和D-木酮糖形成核糖醇和木糖醇的NADH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶。這種酶接近于熟知的來自樹干畢赤酵母(XYL2)的NAD+特異性木糖醇脫氫酶E.C1.1.1.9。由于與D-木酮糖形成對(duì)照，僅細(xì)胞內(nèi)D-核酮糖可用，宿主菌株通過從D-核酮糖在胞質(zhì)形成D-阿糖醇，通過NADPH的再氧化直接地平衡NADPH/NADP+氧化還原對(duì)。然后，D-阿糖醇經(jīng)由被動(dòng)擴(kuò)散分泌到培養(yǎng)液中。諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)D-木酮糖的缺乏應(yīng)是宿主菌株不產(chǎn)生木糖醇的主要原因，即使奧默畢赤酵母具有經(jīng)由NADH或NADPH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶生產(chǎn)這種多元醇的所有酶工具。確實(shí)，選擇將編碼具有NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(D-木酮糖形成)活性的蛋白質(zhì)(E.C.1.1.1.11)的基因克隆進(jìn)野生型宿主菌株奧默畢赤酵母中允許將胞質(zhì)D-阿糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖和NADH。所以，細(xì)胞內(nèi)D-木酮糖變得在基因修飾的菌株中可用并且可以被固有NADH和NADPH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶還原。然而，菌株缺乏能夠?qū)-木酮糖有效地轉(zhuǎn)化成木糖醇的內(nèi)源酶。因此，有必要遺傳改造菌株，以便引入異源木糖醇脫氫酶。在專利WO94/10325中，選擇從樹干畢赤酵母(XYL2)克隆NAD+特異性木糖醇脫氫酶(E.C1.1.1.9)允許生產(chǎn)木糖醇并且通過氧化由先前的代謝步驟產(chǎn)生的NADH平衡NADH/NAD+氧化還原對(duì)。但是如前面所提及的，結(jié)果不是真正令人信服的。諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過克隆編碼具有NADPH特異性木糖醇脫氫酶的經(jīng)突變的蛋白質(zhì)的基因，D-木酮糖被轉(zhuǎn)化為木糖醇以平衡NADPH/NADP+氧化還原對(duì)，如通過從D-核酮糖固有地生產(chǎn)D-阿糖醇所進(jìn)行的。由于NADPH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶對(duì)D-阿糖醇的親和力較低，奧默畢赤酵母野生型宿主菌株不消耗細(xì)胞外D-阿糖醇。由于向基因修飾的菌株中引入NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(D-木酮糖形成)活性，產(chǎn)生進(jìn)培養(yǎng)液中的D-阿糖醇可以被修飾的菌株按照與胞質(zhì)D-阿糖醇相同的方式很好地消耗。因此，木糖醇同時(shí)地從細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外D-阿糖醇產(chǎn)生。其生產(chǎn)可以通過增強(qiáng)木糖醇途徑延伸的效率以完全避免中間D-阿糖醇的輸出來改進(jìn)。因此，僅從D-葡萄糖生產(chǎn)具有與D-阿糖醇相同的生理效應(yīng)的木糖醇。這種改進(jìn)可能是遺傳修飾的結(jié)果，但也可能是適應(yīng)培養(yǎng)條件的結(jié)果。有待克隆進(jìn)宿主菌株中的兩種酶活性的選擇這兩種酶活性的選擇得到其輔因子特異性的支持，如上文所描述的。第一種酶將D-阿糖醇氧化成D-木酮糖。已知兩種類型的D-阿糖醇脫氫酶：D-木酮糖形成型(EC1.1.1.11)(D-阿拉伯糖醇NAD+4-氧化還原酶)和D-核酮糖形成型(EC1.1.1.250)。除非另有說明，否則它是D-木酮糖形成型阿糖醇脫氫酶，它是本文的意圖所在并且在此稱為阿糖醇脫氫酶。D-核酮糖形成型脫氫酶存在于野生型酵母和真菌中。D-木酮糖形成型阿糖醇脫氫酶主要在細(xì)菌中已知。例如，已經(jīng)在腸桿菌科(特別是大腸桿菌)、產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)、和產(chǎn)氣氣桿菌菌株P(guān)RL-R3中，在氧化葡糖桿菌，并且另外還在樹干畢赤酵母中鑒定了它們。具體而言，在UniprotKB數(shù)據(jù)庫中提及了若干種酶，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(#O52720)、青枯雷爾氏菌(#P58708)、鼠疫耶爾森菌(#P58709)、產(chǎn)氣氣桿菌(#L8BEF0)、大腸桿菌(#K3EX35、I2ZSJ5、W1BYD6、W1H8N7、E7U4R7)。出于本發(fā)明的目的，大腸桿菌是NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(D-木酮糖形成型)基因的優(yōu)選來源。更確切地，其氨基酸序列披露于SEQIDNo2中。具體而言，SEQIDNo1和3披露了編碼大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的核酸。通過考慮其密碼子特異性已經(jīng)針對(duì)奧默畢赤酵母對(duì)編碼序列進(jìn)行了優(yōu)化。另外，青枯雷爾氏菌也是NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(D-木酮糖形成型)基因的優(yōu)選來源。更確切地，其氨基酸序列披露于SEQIDNo43中。具體而言，SEQIDNo42披露了編碼青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的核酸。通過考慮其密碼子特異性已經(jīng)針對(duì)奧默畢赤酵母對(duì)編碼序列進(jìn)行了優(yōu)化。第二種酶將D-木酮糖轉(zhuǎn)化成木糖醇。盡管大多數(shù)酵母和真菌具有內(nèi)源木糖醇脫氫酶(EC1.1.1.9)基因，但是將其輔因子特異性從NADH變?yōu)镹ADPH是實(shí)施本發(fā)明所必需的。確實(shí)，本發(fā)明的關(guān)鍵方面在于使用NADPH特異性木糖醇脫氫酶。另外，這種酶優(yōu)選地在宿主中過表達(dá)。已知許多木糖醇脫氫酶并且若干科學(xué)論文教導(dǎo)了如何將輔因子特異性從NADH變?yōu)镹ADPH。渡邊(Watanabe)等人(生物化學(xué)雜志(J；Biol.Chem.)，2005，280，10340-10345)披露了樹干畢赤酵母的具有修飾的輔因子特異性的經(jīng)突變的木糖醇脫氫酶，尤其是三重突變體(D207A/I208R/F209S)和四重突變體(D207A/I208R/F209S/N211R)。四重突變體的氨基酸序列披露于SEQIDNo5中。具有NADPH輔因子特異性的氧化葡糖桿菌的木糖醇脫氫酶的雙重突變體(D38S/M39R)披露于埃倫斯伯格(Ehrensberger)等人(2006，結(jié)構(gòu)(Structure)，14，567-575)中。雙重突變體的氨基酸序列披露于SEQIDNo8中。編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的樹干畢赤酵母XYL2核酸序列的突變和克隆已經(jīng)由諸位發(fā)明人進(jìn)行了制備。具體而言，SEQIDNo4和6披露了編碼樹干畢赤酵母的特異性NADPH木糖醇脫氫酶的核酸。可替代地，諸位發(fā)明人還已經(jīng)對(duì)編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的氧化葡糖桿菌核酸序列進(jìn)行了突變和克隆。具體而言，SEQIDNo7和9披露了編碼氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的核酸。通過考慮其密碼子特異性已經(jīng)針對(duì)奧默畢赤酵母對(duì)編碼序列進(jìn)行了優(yōu)化。表達(dá)盒、載體和重組宿主細(xì)胞在具體方面中，本發(fā)明涉及包含選自下組的針對(duì)奧默畢赤酵母進(jìn)行優(yōu)化的編碼序列的核酸，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNo1、3、7、9和42。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含以下核酸的表達(dá)盒，該核酸包含選自下組的針對(duì)奧默畢赤酵母進(jìn)行優(yōu)化的編碼序列，該組由以下各項(xiàng)組成：SEQIDNo1、3、7、9和42。本發(fā)明還涉及SEQIDNo4的核酸構(gòu)建體和包含所述核酸構(gòu)建體的核酸。另外，本發(fā)明涉及包含所述核酸或表達(dá)盒的重組載體，特別是表達(dá)載體。通常，表達(dá)盒包含將基因轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)所需的所有元件。具體而言，它包含啟動(dòng)子、任選地增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子和用于翻譯的元件。更具體地，對(duì)用于控制NADPH特異性木糖醇脫氫酶表達(dá)的啟動(dòng)子進(jìn)行選擇，以便驅(qū)動(dòng)強(qiáng)表達(dá)。確實(shí)，這種酶優(yōu)選地在宿主細(xì)胞中過表達(dá)。此類啟動(dòng)子在本領(lǐng)域是熟知的。例如，啟動(dòng)子可以是奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子(poRR)或奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)。本發(fā)明涉及包含編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的核酸和編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的核酸的重組載體，特別是表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及包含含有編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的核酸的重組載體(特別是表達(dá)載體)、和含有編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的核酸的重組載體(特別是表達(dá)載體)的試劑盒。優(yōu)選地，所述NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和NADPH特異性木糖醇脫氫酶選自上文披露的酶。具體而言，所述NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶包含SEQIDNo2或42的氨基酸序列或具有1-3個(gè)氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其組成。具體而言，所述NADPH特異性木糖醇脫氫酶包含SEQIDNo5或8的氨基酸序列或具有1-3個(gè)氨基酸添加、取代或缺失的序列，或由其組成。優(yōu)選載體是質(zhì)粒。適合的質(zhì)粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且可以例如選自在實(shí)例中具體披露的那些。首先通過將處于適合啟動(dòng)子的控制之下的編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的基因克隆進(jìn)重組載體中并且通過轉(zhuǎn)化引入D-阿糖醇生產(chǎn)有機(jī)體的宿主細(xì)胞中來產(chǎn)生本發(fā)明的基因修飾的宿主。本發(fā)明涉及重組的或基因工程化的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(EC1.1.1.11)的異源核酸序列和編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的異源核酸序列。NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶使用D-阿糖醇作為底物并且產(chǎn)生D-木酮糖作為產(chǎn)物。NADPH特異性木糖醇脫氫酶使用D-木酮糖作為底物并且產(chǎn)生木糖醇。編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶和NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的序列可以是附加型的或可以整合到宿主細(xì)胞的染色體中。確實(shí)，優(yōu)選地使用載體通過轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，由此將希望的DNA整合到宿主染色體中。這樣的整合從頭在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生或可以通過用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化來協(xié)助，該載體在功能上將其自身連同促進(jìn)DNA序列整合到染色體中的DNA元件插入到宿主染色體中。重組的或基因工程化的宿主細(xì)胞可以包含編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的序列的若干拷貝和/或編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的序列的若干拷貝，這些拷貝優(yōu)選地整合到宿主細(xì)胞染色體中。具體而言，重組的或基因工程化的宿主細(xì)胞可以包含兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)編碼NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的序列和/或兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的序列。例如，宿主細(xì)胞可以包含兩種或三種來自大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和/或一種或兩種來自青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，更具體地兩種或三種來自大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和/或一種來自青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶。NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶可以來自相同有機(jī)體或來自不同有機(jī)體。NADPH特異性木糖醇脫氫酶可以來自相同有機(jī)體或來自不同有機(jī)體。例如，宿主細(xì)胞可以包含一種、兩種或三種來自樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和/或一種、兩種或三種來自氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶，更具體地一種來自樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和/或三種來自氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶。在本發(fā)明的具體方面中，重組的或基因工程化的宿主細(xì)胞是包含以下項(xiàng)的奧默畢赤酵母菌株：-兩種NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和兩種NADPH特異性木糖醇脫氫酶；或-兩種來自大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和兩種NADPH特異性木糖醇脫氫酶(一種來自樹干畢赤酵母且另一種來自氧化葡糖桿菌)；或-兩種NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和三種NADPH特異性木糖醇脫氫酶；或-兩種來自大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和三種NADPH特異性木糖醇脫氫酶(一種來自樹干畢赤酵母且兩種來自氧化葡糖桿菌)；或-三種NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和三種NADPH特異性木糖醇脫氫酶；或-三種NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(兩種來自大腸桿菌且一種來自青枯雷爾氏菌)和三種NADPH特異性木糖醇脫氫酶(一種來自樹干畢赤酵母且兩種來自氧化葡糖桿菌)；或-四種NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和四種NADPH特異性木糖醇脫氫酶；或-四種NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(三種來自大腸桿菌且一種來自青枯雷爾氏菌)和四種NADPH特異性木糖醇脫氫酶(一種來自樹干畢赤酵母且三種來自氧化葡糖桿菌)。宿主細(xì)胞選自上文詳細(xì)描述的微生物。在優(yōu)選實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是奧默畢赤酵母。起始宿主細(xì)胞優(yōu)選地是在編號(hào)I-4605下保藏在CNCM的突變型奧默畢赤酵母。在本發(fā)明的具體方面中，宿主細(xì)胞是選自保藏在CNCM的菌株I-4982、I-4960和I-4981的菌株。本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)木糖醇的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組的或基因工程化的宿主細(xì)胞并且回收產(chǎn)生的木糖醇。優(yōu)選地，培養(yǎng)基為微生物提供了便利的碳源。碳源優(yōu)選地包括D-葡萄糖、以及各種含有D-葡萄糖的糖漿和D-葡萄糖與其他糖的混合物。該方法可以進(jìn)一步包括純化木糖醇的步驟。本發(fā)明涉及如在此披露的重組的或基因工程化的宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)木糖醇的用途。由此類基因修飾的菌株產(chǎn)生的木糖醇可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)從本發(fā)明的宿主的培養(yǎng)基中純化。例如，US5,081,026(通過引用結(jié)合在此)描述了從酵母培養(yǎng)物中層析分離木糖醇。因此，從發(fā)酵步驟，可以使用如描述于US5,081,026中的層析步驟、隨后結(jié)晶來從培養(yǎng)基中純化木糖醇。本發(fā)明的其他特征特色和優(yōu)點(diǎn)在閱讀下面的實(shí)例時(shí)將清楚。然而，在此給出這些實(shí)例僅用于說明而非限定。附圖與序列圖1：12ABYWMP：來自大腸桿菌的側(cè)翼為AscI和SphI限制位點(diǎn)的所合成的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的限制性圖譜。圖2a：lig7.78：來自樹干畢赤酵母的NADH特異性木糖醇脫氫酶的限制性圖譜。圖2b：12AALQTP：來自樹干畢赤酵母的側(cè)翼為HindIII和SacII限制位點(diǎn)的所合成的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的限制性圖譜。圖3：13AAYSYP：來自氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為AscI和SphI限制位點(diǎn)的所合成的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的限制性圖譜。圖4：使用重疊PCR構(gòu)建由側(cè)翼為poRR啟動(dòng)子和終止子的開放閱讀框組成的表達(dá)盒。圖5：12AAMCJP：菊苣假單胞菌(Pseudomonascichorii)的側(cè)翼為HindIII和SacII限制位點(diǎn)的所合成的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的限制性圖譜。圖6：具有poLEU2和poURA3選擇標(biāo)記的奧默畢赤酵母穿梭載體的構(gòu)建。圖7：pEVE2523：奧默畢赤酵母poURA3表達(dá)載體pEVE2523的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有菊苣假單胞菌的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的開放閱讀框。圖8：pEVE2560：奧默畢赤酵母poLEU2表達(dá)載體pEVE2560的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有菊苣假單胞菌的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的開放閱讀框。圖9：用于過表達(dá)氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶的奧默畢赤酵母載體的構(gòu)建。圖10：pEVE3284：奧默畢赤酵母pEVE3284表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶。圖11：用于過表達(dá)樹干畢赤酵母NADPH特異性木糖醇脫氫酶的奧默畢赤酵母載體的構(gòu)建。圖12：pEVE2562/pEVE2564：分別具有poURA3或poLEU2選擇標(biāo)記的奧默畢赤酵母pEVE2562/pEVE2564表達(dá)載體的限制性圖譜，這些表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶。圖13：用于過表達(dá)樹干畢赤酵母NADH特異性木糖醇脫氫酶的奧默畢赤酵母載體的構(gòu)建。圖14：pEVE2563：奧默畢赤酵母pEVE2563表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的樹干畢赤酵母的NADH特異性木糖醇脫氫酶。圖15：使用poURA3選擇標(biāo)記構(gòu)建用于在奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的控制之下過表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的奧默畢赤酵母載體。圖16：pEVE2839：奧默畢赤酵母pEVE2839表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶。圖17：使用poURA3選擇標(biāo)記構(gòu)建用于在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下過表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的奧默畢赤酵母載體。圖18：pEVE3102：奧默畢赤酵母pEVE3102表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和核酮糖還原酶(poRR)終止子的大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶。圖19：pEVE3123：奧默畢赤酵母pEVE3123表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子及poURA3選擇標(biāo)記的大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶。圖20：使用poLEU2選擇標(biāo)記構(gòu)建用于在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下過表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的奧默畢赤酵母載體。圖21：pEVE3157：奧默畢赤酵母pEVE3157表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子及poLEU2選擇標(biāo)記的大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶。圖22：具有poLEU2選擇標(biāo)記的奧默畢赤酵母loxP載體的構(gòu)建。圖23：pEVE2787：奧默畢赤酵母pEVE2787整合載體的限制性圖譜，該整合載體具有在內(nèi)源啟動(dòng)子和終止子的控制之下的側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的經(jīng)克隆的奧默畢赤酵母LEU2選擇標(biāo)記。圖24：12ABTV4P：來自諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)的側(cè)翼為AscI和SphI限制位點(diǎn)的所合成的nat1基因的限制性圖譜。圖25：pEVE2798：奧默畢赤酵母pEVE2798表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有在核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子的控制之下的經(jīng)克隆的nat1標(biāo)記。圖26：具有nat1選擇標(biāo)記的奧默畢赤酵母loxP載體的構(gòu)建。圖27：pEVE2852：奧默畢赤酵母pEVE2852整合載體的限制性圖譜，該整合載體具有在核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子的控制之下的側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的經(jīng)克隆的nat1標(biāo)記。圖28：pEVE2855：奧默畢赤酵母pEVE2855整合載體的限制性圖譜，該整合載體具有與LEU2開放閱讀框上游的5’區(qū)域同源的經(jīng)克隆的片段和側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的nat1選擇標(biāo)記。圖29：用于缺失LEU2開放閱讀框的奧默畢赤酵母loxP載體的構(gòu)建。圖30：pEVE2864：奧默畢赤酵母pEVE2864整合載體的限制性圖譜，該整合載體具有與LEU2開放閱讀框上游的5’區(qū)域同源的經(jīng)克隆的片段和與LEU2開放閱讀框下游的3’區(qū)域同源的片段、及側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的nat1選擇標(biāo)記。圖31：包含樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。圖32：pEVE3318：奧默畢赤酵母pEVE3318表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體含有樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體。圖33：pEVE2862：奧默畢赤酵母pEVE2862表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子的奧默畢赤酵母LEU2標(biāo)記。圖34：用于在奧默畢赤酵母中基因組表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和樹干畢赤酵母NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的整合型載體的構(gòu)建。圖35：pEVE2865：奧默畢赤酵母pEVE2865整合載體的限制性圖譜，該整合載體含有側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2標(biāo)記。圖36：pEVE3387：奧默畢赤酵母pEVE3387整合載體的限制性圖譜，該整合載體含有樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體與側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2選擇標(biāo)記。圖37：包含氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙/三表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。圖38：pEVE3322/pEVE3324：奧默畢赤酵母pEVE3322/pEVE3324表達(dá)載體的限制性圖譜，這些表達(dá)載體含有氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體或氧化葡糖桿菌的兩個(gè)NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因和大腸桿菌的一個(gè)NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的三表達(dá)構(gòu)建體。圖39：用于在奧默畢赤酵母中基因組表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的整合型載體的構(gòu)建。圖40：pEVE3390/pEVE3392：奧默畢赤酵母pEVE3390/pEVE3392整合載體的限制性圖譜，這些整合載體含有氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體或氧化葡糖桿菌的兩個(gè)NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因和大腸桿菌的一個(gè)NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的三表達(dá)構(gòu)建體與側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2選擇標(biāo)記。圖41：用于在奧默畢赤酵母中基因組表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的整合型載體的構(gòu)建。圖42：pEVE4390：奧默畢赤酵母pEVE4390表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體含有大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的雙表達(dá)構(gòu)建體與側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2選擇標(biāo)記。圖43：13AB2EGF：來自青枯雷爾氏菌的側(cè)翼為AscI和SphI限制位點(diǎn)的所合成的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的限制性圖譜。圖44：用于在奧默畢赤酵母中基因組表達(dá)青枯雷爾氏菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的整合型載體的構(gòu)建。圖45：pEVE3898：奧默畢赤酵母pEVE3898表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有經(jīng)克隆的表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶。圖46：pEVE4077：奧默畢赤酵母pEVE4077表達(dá)載體的限制性圖譜，該表達(dá)載體具有氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體。圖47：pEVE4377：奧默畢赤酵母pEVE4377整合載體的限制性圖譜，該整合載體具有氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體及側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的poLEU2選擇標(biāo)記。序列表實(shí)例實(shí)例1.選擇奧默畢赤酵母菌株作為用于基因工程化的優(yōu)選宿主作為所選擇的宿主菌株，奧默畢赤酵母：-是在高滲透壓培養(yǎng)基例如含有10％-60％D-葡萄糖，且優(yōu)選25％D-葡萄糖的培養(yǎng)基(“正?！迸囵B(yǎng)基通常僅含有2％-3％葡萄糖)下從葡萄糖生產(chǎn)顯著量的阿糖醇的生產(chǎn)者。-具有允許生成所需的輔因子的氧化還原平衡。作為其性能的說明，以下表格指示了在奧默畢赤酵母的阿糖醇代謝途徑中所涉及的酶活性(蘇菲·胡謝論文(SophieHUCHETTEThesis)，1992)己糖單磷酸途徑：從葡萄糖-6-P到D-核酮糖-5-P和D-木酮糖-5-PPPP的氧化部分(亦稱己糖單磷酸途徑(HMP))是NADPH生產(chǎn)途徑。作為葡萄糖-6-P脫氫酶(E.C.1.1.1.49)和6-P-葡糖酸脫氫酶(E.C.1.1.1.44)的兩種NADP+依賴性酶在1摩爾的D-核酮糖-5-P中參與1摩爾的葡萄糖-6-P的氧化并生成2摩爾的NADPH。表1一個(gè)單位的酶活性被定義為每mL的粗提取物每分鐘消耗1微摩爾的NAD(P)H或NAD(P)+。一個(gè)單位的比活性被定義為在粗提取物中每mg的蛋白質(zhì)的一個(gè)單位的酶活性。測(cè)定了以下酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)：D-核酮糖-5-P3-差向異構(gòu)酶(E.C5.1.3.1)、D-核糖-5-P酮基-異構(gòu)酶(E.C.5.3.1.6)、轉(zhuǎn)酮醇酶(E.C.2.2.1.1)和酸性磷酸酶(E.C.3.1.3.2)。表2一個(gè)單位的酶活性被定義為每mL的粗提取物每分鐘消耗1微摩爾的NAD(P)H或NAD(P)+。一個(gè)單位的比活性被定義為在粗提取物中每mg的蛋白質(zhì)的一個(gè)單位的酶活性。表3一個(gè)單位的酶活性被定義為每mL的粗提取物每分鐘消耗1微摩爾的NAD(P)H或NAD(P)+。一個(gè)單位的比活性被定義為在粗提取物中每mg的蛋白質(zhì)的一個(gè)單位的酶活性。在體內(nèi)，通過D-核酮糖-5-P的差向異構(gòu)化合成的D-木酮糖-5-P經(jīng)由轉(zhuǎn)酮醇作用(transketolization)有效地進(jìn)入PPP的非氧化部分。因此，D-木酮糖-5-P因其脫磷酸成D-木酮糖而不可用。NADH和NADPH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶D-核酮糖和D-木酮糖通過D-核酮糖-5-P和D-木酮糖-5-P的脫磷酸化來產(chǎn)生。米氏常數(shù)突出了NADH和NADPH-D-戊酮糖-氧化還原酶對(duì)每種底物的親和力和對(duì)應(yīng)的最大速度。表4一個(gè)單位的酶活性被定義為每mL的粗提取物每分鐘消耗1微摩爾的NAD(P)H或NAD(P)+。一個(gè)單位的比活性被定義為在粗提取物中每mg的蛋白質(zhì)的一個(gè)單位的酶活性。分別從D-核酮糖和D-木酮糖形成核糖醇和木糖醇的NADH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶對(duì)D-木酮糖顯示出比D-核酮糖高的親和力。逆反應(yīng)顯示出對(duì)木糖醇和核糖醇的良好的親和力，解釋了宿主菌株在這兩種多元醇上生長(zhǎng)良好。表5一個(gè)單位的酶活性被定義為每mL的粗提取物每分鐘消耗1微摩爾的NAD(P)H或NAD(P)+。一個(gè)單位的比活性被定義為在粗提取物中每mg的蛋白質(zhì)的一個(gè)單位的酶活性。從D-核酮糖形成D-阿糖醇且從D-木酮糖形成木糖醇的NADPH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶對(duì)D-核酮糖顯示出比D-木酮糖高的親和力。逆反應(yīng)顯示出對(duì)D-阿糖醇非常低的親和力，解釋了宿主菌株在這種多元醇上不生長(zhǎng)。來自宿主菌株的這兩種戊酮糖-氧化還原酶被表征為不同于由英格拉姆(Ingram)和伍德(Wood)在1965年描述于魯氏酵母(Saccharomycesrouxii)中的先前的酶(細(xì)菌學(xué)雜志(JournalofBacteriology)，第89卷，第5期，1186-1194)。確實(shí)，在魯氏酵母中，在D-核酮糖和NADH上沒有檢測(cè)到正向反應(yīng)，并且在D-阿糖醇與NADPH上檢測(cè)到了逆向反應(yīng)?；魻柕?Haldane)關(guān)系預(yù)測(cè)了體內(nèi)酶動(dòng)力學(xué)行為。表6這兩種酶相對(duì)于逆向反應(yīng)(戊糖醇還原)更有利于正向反應(yīng)(D-戊酮糖氧化)。宿主菌株中的PPP極其高效，并且從1摩爾消耗的葡萄糖生成2摩爾的NADPH。因此，NADPH對(duì)于合成代謝反應(yīng)和維持反應(yīng)兩者而言過量地可用。宿主菌株必須從D-核酮糖生產(chǎn)D-阿糖醇或從D-木酮糖生產(chǎn)木糖醇，以平衡NADPH/NADP+氧化還原對(duì)。已經(jīng)在體外確定了NADP+對(duì)NADPH特異性D-戊酮糖-氧化還原酶的抑制作用。當(dāng)過量地添加NADP+時(shí)，活性少80％。即使這個(gè)濃度與細(xì)胞內(nèi)NADP+濃度不相配，這個(gè)結(jié)果仍給出NADPH特異性D-戊酮糖氧化還原酶在NADPH/NADP+氧化還原對(duì)平衡中的作用的一些概述。宿主菌株僅從D-核酮糖生產(chǎn)D-阿糖醇，因?yàn)镈-木酮糖不可用，這是由于D-木酮糖-5-P進(jìn)入了PPP的非氧化部分。D-阿糖醇生產(chǎn)與NADPH/NADP+氧化還原平衡之間的聯(lián)系已經(jīng)通過評(píng)價(jià)葡萄糖-6-P脫氫酶的過表達(dá)對(duì)D-阿糖醇生產(chǎn)的影響在宿主菌株中進(jìn)行了證明。所以，與宿主菌株(FR2772788)相比，所獲得的菌株具有高1.5倍的G6PDH活性且產(chǎn)生了多10％的D-阿糖醇。實(shí)例2.奧默畢赤酵母密碼子使用從五個(gè)奧默畢赤酵母基因的可用DNA和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列確定了奧默畢赤酵母的密碼子使用：轉(zhuǎn)酮醇酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(FR2772788)、核酮糖還原酶、β-異丙基蘋果酸脫氫酶-LEU2(佩里達(dá)(Piredda)和蓋拉丁(Gaillardin)，酵母(Yeast)，第10卷:1601-1612(1994))和乳清苷-5'-磷酸脫羧酶-URA3(佩里達(dá)(Piredda)和蓋拉丁(Gaillardin)，1994，同上)。將每個(gè)單獨(dú)的基因分為編碼單個(gè)氨基酸的核苷酸三聯(lián)體。這五個(gè)基因由總共2091個(gè)密碼子組成。對(duì)于每個(gè)氨基酸，對(duì)存在于這五個(gè)基因中的每個(gè)密碼子的數(shù)目計(jì)數(shù)，除以2091并乘以1000。以此方式，估計(jì)出特定密碼子在1000個(gè)密碼子中的頻率。奧默畢赤酵母的初步密碼子使用描繪于表7中。使用這個(gè)表和從http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/獲得的Optimizer程序?qū)W默畢赤酵母中表達(dá)的所有異源基因(來自樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶除外)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。在編碼酶的序列的對(duì)應(yīng)的5’和3’端手動(dòng)添加限制酶的識(shí)別位點(diǎn)之后，將所獲得的序列用于基因合成。表7.奧默畢赤酵母的來源于5個(gè)編碼序列(CDS)的密碼子使用表奧默畢赤酵母[gbpln]：5個(gè)CDS(2091個(gè)密碼子)字段：[三字母][頻率：每千]([數(shù)目])實(shí)例3.大腸桿菌細(xì)菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶(D-木酮糖形成型)基因的克隆根據(jù)SEQIDNO:1的提交序列，用化學(xué)方法合成編碼來自大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶altD的DNA片段(GeneSynthesis，生命科技公司(LifeTechnologies)，雷根斯堡，德國(guó))。編碼altD基因的序列AF378082.1(從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF378082獲得)的核苷酸1441至2808被用作模板并且根據(jù)實(shí)例2的表7，使用從http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/獲得的Optimizer程序使其經(jīng)受密碼子優(yōu)化用于在奧默畢赤酵母ATCC20209中使用。在所得序列的5’和3’端，添加分別編碼限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸，以便有助于進(jìn)一步克隆。另外，腺苷三聯(lián)體被包括在起始ATG之前，以將酵母的Kozak樣序列的-3位處的腺苷考慮在內(nèi)。然后提交最終序列(SEQIDNO:1)進(jìn)行合成(GeneArt，雷根斯堡，德國(guó))。將所合成的編碼來自大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的DNA片段作為5μg凍干的質(zhì)粒DNA在pMK-RQ衍生的載體(12ABYWMP，圖1)中遞送。為了進(jìn)一步亞克隆，將基因通過用AscI和SphI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(NewEnglandBiolabs)，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)限制性切割來釋放。實(shí)例4.樹干畢赤酵母NADH和NADPH特異性木糖醇脫氫酶的誘變和克隆樹干畢赤酵母NADH特異性木糖醇脫氫酶基因的克隆遵循FR2765589(參見這個(gè)專利的實(shí)例4和圖7)的教導(dǎo)，將編碼木糖醇脫氫酶(科特等人，當(dāng)代遺傳學(xué)(Curr.Genet.)18:493-500(1990))的酵母(樹干畢赤酵母)基因XYL2的已知核苷酸序列克隆進(jìn)質(zhì)粒載體lig7.78中。載體的限制性圖譜呈現(xiàn)在圖2a中。樹干畢赤酵母NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的誘變和克隆根據(jù)SEQIDNO:4的序列，用化學(xué)方法合成編碼來自樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶XYL2的DNA片段(GeneSynthesis，生命科技公司，雷根斯堡，德國(guó))。編碼XYL2基因的序列X55392.1(從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X55392.1獲得)的核苷酸319至1410被用作模板。根據(jù)來自渡邊(Watanabe)等人(生物化學(xué)雜志(J；Biol.Chem.)，2005，280，10340-10345)的論文，可以通過引入四個(gè)公開的氨基酸突變D207A/I208R/F209S/N211R(基于從http://www.uniprot.org/uniprot/P22144獲得的P22144蛋白質(zhì)序列進(jìn)行編號(hào))將木糖醇脫氫酶的輔因子偏好從NADH變?yōu)镹ADPH。因此，編碼D207、I208、F209和N211的密碼子在對(duì)應(yīng)的序列中分別被GCT、AGA、TCA和AGA手動(dòng)替換。另外，在對(duì)應(yīng)的5’和3’端手動(dòng)地包括編碼限制酶HindIII(AAGCTT)和SacII(CCGCGG)的識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸，以便有助于進(jìn)一步克隆。此外，腺苷三聯(lián)體被包括在起始ATG之前，以將酵母的Kozak樣序列的-3位處的腺苷考慮在內(nèi)。提交最終序列(SEQIDNO:4)進(jìn)行合成(GeneArt，雷根斯堡，德國(guó))。將所合成的編碼來自樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的DNA片段作為5μg凍干的質(zhì)粒DNA在pMA-T衍生的載體(12AALQTP，圖2b)中遞送。實(shí)例5.氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的誘變和克隆根據(jù)SEQIDNO:7的提交序列，用化學(xué)方法合成編碼來自氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶Xdh的DNA片段(GeneSynthesis，生命科技公司，雷根斯堡，德國(guó))。編碼Xdh基因的序列AB091690.1(從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB091690.1獲得)的核苷酸1063至1851被用作模板并且根據(jù)表7(實(shí)例2)，使用從http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/獲得的Optimizer程序使其經(jīng)受密碼子優(yōu)化用于在奧默畢赤酵母ATCC20209中使用?；诎愃共?Ehrensberger)等人(結(jié)構(gòu)(Structure)，2006，14，567-575)的公開，可以通過引入兩個(gè)公開的氨基酸突變D38S/M39R(基于從http://www.uniprot.org/uniprot/Q8GR61獲得的Q8GR61蛋白質(zhì)序列進(jìn)行編號(hào))將酶的輔因子特異性從NADH變?yōu)镹ADPH。因此，編碼D38和M39的密碼子在對(duì)應(yīng)的序列中分別被TCT和AGA手動(dòng)替換。另外，在對(duì)應(yīng)的5’和3’端手動(dòng)地包括編碼限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸，以便允許進(jìn)一步克隆。此外，腺苷三聯(lián)體被包括在起始ATG之前，以將酵母的Kozak樣序列的-3位處的腺苷考慮在內(nèi)。提交最終序列(SEQIDNO:7)進(jìn)行合成(GeneArt，雷根斯堡，德國(guó))。將所合成的編碼來自氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的DNA片段作為5μg凍干的質(zhì)粒DNA在pMA-T衍生的載體(13AAYSYP，圖3)中遞送。為了進(jìn)一步亞克隆，將基因通過用AscI和SphI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)限制性切割來釋放。實(shí)例6.使用poURA3選擇標(biāo)記構(gòu)建用于異源基因表達(dá)的奧默畢赤酵母載體具有可替換的以下項(xiàng)的載體的克隆：-啟動(dòng)子，-開放閱讀框，和-終止子元件通過三個(gè)單獨(dú)片段的兩次連續(xù)重疊PCR來進(jìn)行(圖4)。載體最初被計(jì)劃為表達(dá)模型，以測(cè)試塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因在重組奧默畢赤酵母菌株中的克隆和過表達(dá)。如將在下文描述的，塔格糖3-差向異構(gòu)酶基因已經(jīng)克隆進(jìn)特定AscI–SphI限制位點(diǎn)盒中，允許通過使用這些相同的插入位點(diǎn)來克隆任何感興趣的基因。通過以下方式設(shè)想克隆。在第一次PCR(PCR1)中，使用以下項(xiàng)擴(kuò)增奧默畢赤酵母的側(cè)翼為SpeI和AscI位點(diǎn)(在引物序列中加下劃線)的490bp長(zhǎng)的核酮糖還原酶啟動(dòng)子片段：-引物EV2960：GAACTAGTGGATCCGTAGAAATCTTG(SEQIDNo12)和-引物EV2961：CTTTGTTCATTTTGGCGCGCCTTTTAGTTTAATAAGGGTCCGTG(SEQIDNo13)另外，在反向引物EV2961的5’端，添加代表塔格糖-3-差向異構(gòu)酶基因的5’端的13個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。需要這個(gè)片段連同AscI位點(diǎn)的8個(gè)核苷酸和核酮糖還原酶啟動(dòng)子的3’端的10個(gè)后續(xù)核苷酸作為重疊物，以便使PCR1的片段與下文描述的PCR2的片段融合。奧默畢赤酵母ATCC20209的基因組DNA被用作模板。為此目的，將剛劃出的奧默畢赤酵母菌落重懸于30μl的0.2％SDS中并在95℃下加熱4min。全速離心之后，將0.5μl的上清液用于PCR。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司(BIO-RAD)，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/50℃下20sec/72℃下15sec的25個(gè)循環(huán)，和72℃下10分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。在第二次PCR(PCR2)中，使用以下項(xiàng)擴(kuò)增菊苣假單胞菌ST24的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的側(cè)翼為AscI和SphI位點(diǎn)(在引物序列中加下劃線)的911bp長(zhǎng)的片段：-引物EV2962：AAACTAAAAGGCGCGCCAAAATGAACAAAGTTGGCATG(SEQIDNo14)和-引物EV2963：TTCTCTTCGAGAGCATGCTCAGGCCAGCTTGTCACG(SEQIDNo15)。引物EV2962的5’端含有代表核酮糖還原酶啟動(dòng)子的3’的9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。將這個(gè)片段連同AscI位點(diǎn)的8個(gè)核苷酸和塔格糖-3-差向異構(gòu)酶開放閱讀框的后續(xù)12個(gè)核苷酸用于重疊PCR，以將PCR2產(chǎn)物融合到先前描述的PCR1產(chǎn)物上。另外，反向引物EV2963的5’端含有代表奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶終止子的5’端的12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段。需要這個(gè)片段連同SphI位點(diǎn)的6個(gè)核苷酸和塔格糖-3-差向異構(gòu)酶開放閱讀框的3’端的后續(xù)12個(gè)核苷酸作為重疊物，以便使PCR2與下文描述的PCR3的PCR片段融合。作為模板，使用25ng含有所合成的菊苣假單胞菌ST24的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶基因拷貝的載體12AAMCJP(圖5)(GeneArt，雷根斯堡，德國(guó))(AB000361.1的核苷酸719至1591，來自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB000361)–SEQIDNo:11。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司(BIO-RAD)，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/48℃下20sec/72℃下30sec的25個(gè)循環(huán)，和72℃下10分鐘的最終延伸步驟。在第三次PCR(PCR3)中，使用以下項(xiàng)擴(kuò)增奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶終止子的側(cè)翼為SphI和SacII位點(diǎn)(在引物序列中加下劃線)的380bp長(zhǎng)的片段：-引物EV2964AAGCTGGCCTGAGCATGCTCTCGAAGAGAATCTAG(SEQIDNo16)和-引物EV2965GTTCCGCGGAGAATGACACGGCCGAC(SEQIDNo17)引物EV2964的5’端含有塔格糖-3-差向異構(gòu)酶開放閱讀框的3’端的12個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段，該開放閱讀框連同SphI位點(diǎn)的6個(gè)核苷酸和奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶終止子的后續(xù)12個(gè)核苷酸用于使PCR3融合到先前描述的PCR2上。奧默畢赤酵母ATCC20209的基因組DNA被用作模板。全速離心之后，將0.5μl的上清液用于PCR中。為此目的，將剛劃出的奧默畢赤酵母菌落重懸于30μl的0.2％SDS中并在95℃下加熱4min。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP、0.5μM的每種引物和0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/50℃下20sec/72℃下15sec的25個(gè)循環(huán)，和72℃下10分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。如下進(jìn)行這三個(gè)單獨(dú)PCR片段的融合：PCR1和PCR2的50ng的每種凝膠純化產(chǎn)物在用EV2960和EV2963進(jìn)行的PCR反應(yīng)中被用作模板。由上文描述的引物設(shè)計(jì)得到的這兩個(gè)片段中的30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的同源區(qū)段在融合反應(yīng)中被用作重疊物。以此方式，使1.4kb長(zhǎng)的片段(由奧默畢赤酵母的側(cè)翼為SpeI和AscI位點(diǎn)的核酮糖還原酶啟動(dòng)子組成)融合到菊苣假單胞菌ST24的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的開放閱讀框上。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP、0.5μM的每種引物和0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/62℃下20sec/72℃下45sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下10分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。使第二次重疊PCR中的經(jīng)純化的片段融合到PCR3的產(chǎn)物上。40ng的每種片段被用作模板并用EV2960和EV2965進(jìn)行擴(kuò)增。由上文描述的引物設(shè)計(jì)得到的這兩個(gè)片段中的30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的同源區(qū)段在融合中被用作重疊物。以此方式，使1.8kb長(zhǎng)的片段(由奧默畢赤酵母的側(cè)翼為SpeI和AscI的核酮糖還原酶啟動(dòng)子和菊苣假單胞菌ST24的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的側(cè)翼為AscI和SphI位點(diǎn)的開放閱讀框組成)融合到奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶終止子上。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP、0.5μM的每種引物和0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/65℃下20sec/72℃下55sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下10分鐘的最終延伸步驟。在瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將最終PCR產(chǎn)物(由菊苣假單胞菌ST24的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的側(cè)翼為核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子的1.7kb長(zhǎng)的片段組成)用限制酶SpeI和SacII(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)消化，凝膠純化，并且在16℃下使用T4DNA連接酶(英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)與lig7.78載體骨架的9.8kb長(zhǎng)的分離的SpeI/SacII片段連接過夜(圖6)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司(AgilentTechnologies)，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(ZyppyTMPlasmidMiniprepKit)(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA。將經(jīng)純化的質(zhì)粒DNA用于通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)行的進(jìn)一步表征。新克隆的表達(dá)質(zhì)粒pEVE2523(圖7)是由細(xì)菌(大腸桿菌)復(fù)制起點(diǎn)和氨比西林抗性基因、酵母(奧默畢赤酵母)自主復(fù)制序列、和用于在酵母中進(jìn)行選擇的poURA3(奧默畢赤酵母)基因組成的穿梭大腸桿菌-奧默畢赤酵母載體。此外，它含有可交換的側(cè)翼于菊苣假單胞菌的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的開放閱讀框(經(jīng)由AscI和SphI酶切可交換的)的奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子元件(經(jīng)由SpeI和AscI限制性酶切)和終止子元件(經(jīng)由SphI和SacII限制性酶切)。實(shí)例7.使用poLEU2選擇標(biāo)記構(gòu)建用于異源基因表達(dá)的奧默畢赤酵母載體為了構(gòu)建第二奧默畢赤酵母表達(dá)載體，將先前在實(shí)例6中描述的質(zhì)粒pEVE2523(圖7)的表達(dá)盒克隆進(jìn)含有奧默畢赤酵母poLEU2選擇標(biāo)記的載體(圖6)中。用SpeI和SacII(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)切割的載體pEVE2523(圖7)的平端的1.7kb片段被用作插入物。用平端化酶混合物(BluntingEnzymeMix)(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行15min的平端化，隨后使酶在70℃下熱失活10min。載體骨架獲得自用SalI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)線性化的poARS載體(plig3–FR2772788)，將其平端化并使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下脫磷酸1h。使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)，將使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)凝膠純化的插入物和載體骨架在室溫下連接1h。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且將其用于通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)行的進(jìn)一步表征。新克隆的表達(dá)質(zhì)粒pEVE2560(圖8)是含有細(xì)菌(大腸桿菌)復(fù)制起點(diǎn)和氨比西林抗性基因、酵母(奧默畢赤酵母)自主復(fù)制序列、和用于在酵母中進(jìn)行選擇的poLEU2(奧默畢赤酵母)基因的穿梭大腸桿菌-奧默畢赤酵母載體。此外，菊苣假單胞菌的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子的開放閱讀框是經(jīng)由AscI和SphI酶切可交換的。實(shí)例8.用于過表達(dá)氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶的奧默畢赤酵母載體的構(gòu)建構(gòu)建了用于過表達(dá)氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶的奧默畢赤酵母載體。為了克隆進(jìn)表達(dá)載體中，將編碼氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶的DNA片段通過用AscI和SphI限制酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)切割而從載體13AAYSYP(圖3)中釋放。將803bp片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至pEVE2523(圖7)的9.8kbAscI/SphI消化且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖9)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3284(圖10)含有氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的NADPH特異性木糖醇脫氫酶，以及poURA3選擇標(biāo)記。實(shí)例9.用于過表達(dá)樹干畢赤酵母NADPH特異性木糖醇脫氫酶的奧默畢赤酵母載體的構(gòu)建為了亞克隆進(jìn)表達(dá)載體中，編碼來自樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的DNA片段的側(cè)翼必須為AscI和SphI限制位點(diǎn)。為此目的：-EV3101引物AAGGCGCGCCAAAATGACTGCTAACCCTTCC(SEQIDNo18)，含有AscI位點(diǎn)(加下劃線的)和-EV3102引物GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG(SEQIDNo19)，含有SphI(加下劃線的)用于使用30ng的載體12AALQTP(圖2b)作為模板的PCR反應(yīng)中。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/55℃下20sec/72℃下30sec的25個(gè)循環(huán)，和72℃下10分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離1.1kbPCR產(chǎn)物，提取，使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化并用AscI和SphI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切。用DNAClean&ConcentratorTM-5試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)柱純化之后，將它在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)分別連接至pEVE2523(圖7)的10.6kbAscI/SphI消化且凝膠純化的載體骨架和pEVE2560(圖8)的11.8kbAscI/SphI消化且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖11)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，分離質(zhì)粒DNA并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2562和pEVE2564(圖12)含有樹干畢赤酵母的側(cè)翼為奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的NADPH特異性木糖醇脫氫酶，以及對(duì)應(yīng)的poURA3或poLEU2選擇標(biāo)記。實(shí)例10.用于過表達(dá)樹干畢赤酵母NADH特異性木糖醇脫氫酶的奧默畢赤酵母載體的構(gòu)建為了亞克隆進(jìn)表達(dá)載體中，編碼來自樹干畢赤酵母的NADH特異性木糖醇脫氫酶的DNA片段的側(cè)翼必須為AscI和SphI限制位點(diǎn)。為此目的：-EV3101(AAGGCGCGCCAAAATGACTGCTAACCCTTCC)(SEQIDNo18)，含有AscI位點(diǎn)(加下劃線的)和-EV3102(GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG)(SEQIDNo19)，含有SphI(加下劃線的)用于使用30ng的載體lig7.78(圖2a)作為模板的PCR反應(yīng)中。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/55℃下20sec/72℃下30sec的25個(gè)循環(huán)，和72℃下10分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離1.1kbPCR產(chǎn)物，提取，使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化并用AscI和SphI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切。用DNAClean&ConcentratorTM-5試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)柱純化之后，將它在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至pEVE2560(圖8)的10.5kbAscI/SphI消化且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖13)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，分離質(zhì)粒DNA并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2563(圖14)含有樹干畢赤酵母的側(cè)翼為奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的NADH特異性木糖醇脫氫酶，以及poLEU2選擇標(biāo)記。實(shí)例11.用于過表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的奧默畢赤酵母載體的構(gòu)建構(gòu)建了用于過表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的奧默畢赤酵母載體。為了克隆進(jìn)表達(dá)載體中，將編碼經(jīng)密碼子優(yōu)化的大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的DNA片段通過用AscI和SphI限制酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)切割而從載體12ABYWMP(圖1)中釋放。將1.4kb片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至pEVE2523(圖7)的9.8kbAscI/SphI消化且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖15)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2839(圖16)含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，以及poURA3選擇標(biāo)記。除奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子之外，還克隆了來自大腸桿菌的在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶。通過以下方式以兩個(gè)連續(xù)步驟進(jìn)行克隆：首先用poPGK1啟動(dòng)子替換核酮糖還原酶啟動(dòng)子，隨后用poTKL終止子交換核酮糖還原酶終止子。使用以下項(xiàng)從奧默畢赤酵母的基因組DNA擴(kuò)增奧默畢赤酵母poPGK1啟動(dòng)子的611bp長(zhǎng)的片段：-引物EV3177(GAAGACTAGTTCACGTGATCTC)(SEQIDNo20)，含有SpeI位點(diǎn)(加下劃線的)和-引物EV3178(CACTGGCGCGCCTTTTGTGTGGTGGTGTCC)(SEQIDNo21)，含有AscI位點(diǎn)(加下劃線的)。通過將剛劃出的奧默畢赤酵母菌落重懸于30μl的0.2％SDS中并在95℃下加熱4min來制備基因組DNA模板。全速離心之后，將0.5μl的上清液用于PCR。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：96℃下2min的預(yù)變性步驟，隨后是96℃下10sec/58℃下10sec/72℃下30sec的25個(gè)循環(huán)，和72℃下2分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將擴(kuò)增的610bp長(zhǎng)的poPGK1啟動(dòng)子片段用SpeI和AscI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至pEVE2839(圖16)的11.5kbSpeI/AscI消化且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖17)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3102(圖18)含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母的磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和核酮糖還原酶終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，以及poURA3選擇標(biāo)記。在下一步驟中，用奧默畢赤酵母的轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子交換pEVE3102的核酮糖還原酶終止子。使用以下項(xiàng)從奧默畢赤酵母的基因組DNA擴(kuò)增奧默畢赤酵母poTKL終止子的213bp長(zhǎng)的片段：-引物EV3817(TAGCAGCATGCATAGGTTAGTGAATGAGGTATG)(SEQIDNo22)，含有SphI位點(diǎn)(加下劃線的)和-引物EV3818(TAGGTCCGCGGGAGCTTCGTTAAAGGGC)(SEQIDNo23)，含有SacII位點(diǎn)(加下劃線的)。如上文描述的制備基因組DNA模板。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：96℃下2min的預(yù)變性步驟，隨后是96℃下10sec/57℃下10sec/72℃下30sec的25個(gè)循環(huán)，和72℃下2分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將擴(kuò)增的213bp長(zhǎng)的poTKL終止子片段用SphI和SacII(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至pEVE3102(圖18)的11.5kbSphI/SacII消化且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖17)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3123(圖19)含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母的磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，以及poURA3選擇標(biāo)記。為了能夠使用另一選擇從質(zhì)粒表達(dá)大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，用poLEU2標(biāo)記交換pEVE3123的poURA3標(biāo)記。為此目的，將poURA3標(biāo)記通過用PsiI和AfeI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切而從載體pEVE3123(圖19)中釋放。將9.1kb載體骨架使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化，用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min并使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下脫磷酸1h。作為插入物，使用通過AseI和AfeI進(jìn)行限制性酶切而從載體pEVE2560(圖8)中釋放的poLEU2標(biāo)記的3kb平端的且凝膠純化的片段。使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行2h的片段連接(圖20)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3157(圖21)含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母的磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，以及poLEU2選擇標(biāo)記。實(shí)例12.質(zhì)粒大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和質(zhì)粒樹干畢赤酵母NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因在奧默畢赤酵母菌株ATCC20209中的表達(dá)為了將阿糖醇生物合成地轉(zhuǎn)化成木糖醇，需要同時(shí)表達(dá)NAD+特異性大腸桿菌D-阿糖醇4-氧化還原酶和樹干畢赤酵母的NADP特異性木糖醇脫氫酶。第一種酶導(dǎo)致木酮糖的形成并且第二種酶將木酮糖轉(zhuǎn)化成木糖醇。衍生自ATCC20209并且是亮氨酸和尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型的奧默畢赤酵母菌株SRLU(MATh-leu2ura3)(佩里達(dá)(Piredda)和蓋拉丁(Gaillardin)，1994，同上)被用作用于通過用以下質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化來構(gòu)建分泌木糖醇的酵母菌株的宿主：-pEVE2839(大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶)和-pEVE2564(樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶)得到菌株EYS2755另外，作為對(duì)照(遵循WO94/10325的傳授)，還通過以下方式構(gòu)建了表達(dá)樹干畢赤酵母的NADH特異性野生型木糖醇脫氫酶的菌株：用以下質(zhì)粒-pEVE2839(大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶)和-pEVE2563(樹干畢赤酵母的NADH特異性木糖醇脫氫酶)轉(zhuǎn)化到SRLU宿主中，得到菌株EYS2962。作為對(duì)照，還產(chǎn)生了用以下單個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株：-pEVE2839(大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶)，-pEVE2563(樹干畢赤酵母的NADH特異性木糖醇脫氫酶)，和-pEVE2564(樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶)分別得到EYS2943、EYS2696和EYS2697。酵母轉(zhuǎn)化基本上通過進(jìn)行具有以下修改的格林(Green)等人(格林(Green)E.D.、希特爾(Hieter)，P.和斯彭切爾(Spencer)F.A，基因組分析：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(GenomeAnalysis:ALaboratoryManual)中的第5章，第3卷，克隆系統(tǒng)(CloningSystems)，比倫(Birren)等人(編輯)，冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)，紐約，1999)的原生質(zhì)球法來進(jìn)行：取代Lyticase，使用Zymolyase100T以產(chǎn)生原生質(zhì)球，并且在Zymolyase處理之前在37℃下用酶進(jìn)行孵育直到細(xì)胞懸浮液的OD達(dá)到原始OD的20％-30％。簡(jiǎn)言之，使奧默畢赤酵母細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基(酵母提取物1％(w/v)，蛋白胨2％(w/v)，右旋糖2％(w/v))中在30℃下生長(zhǎng)過夜，至最終OD600為3-5。通過離心收獲200個(gè)OD600單位，用水和1M山梨醇洗滌一次，并重懸于SCE緩沖液(1M山梨醇，100mM檸檬酸三鈉鹽二水合物，10mMEDTA)中，至最終濃度為70OD/ml。添加DTT和Zymolase(LuBioScience，盧塞恩，瑞士)至最終濃度分別為10mM和0.5U/OD，并且將混合物伴隨緩慢振蕩在37℃下進(jìn)行孵育。細(xì)胞壁消化之后測(cè)量稀釋于水中的溶液的光密度。當(dāng)此值降至原始值的80％時(shí)，通過小心離心并用1M山梨醇和STC緩沖液(0.98M山梨醇，10mMTrispH7.5，10mMCaCl2)洗滌來使消化終止。將原生質(zhì)球小心地重懸于含有50μg/ml小牛胸腺DNA(Calbiochem/VWR，迪蒂孔，瑞士)的STC緩沖液中，至最終濃度為200OD/ml。將100μl的等分部分與100-200ng的質(zhì)粒DNA混合并在室溫下孵育10min。向懸浮液中添加1mlPEG溶液(19.6％PEG8000w/v，10mMTrispH7.5，10mMCaCl2)，孵育10分鐘并沉淀。使原生質(zhì)球在1ml含有25％YPD和7mMCaCl2的1M山梨醇溶液中在30℃下再生1-2h。向再生的細(xì)胞中添加7ml的50℃的溫頂層瓊脂(0.67％酵母氮基w/o氨基酸，0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/組氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉(drop-outpowder)，0.086‰的必需缺失氨基酸，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH5.8和2.5％諾布爾瓊脂)，并且將混合物均勻地倒在預(yù)溫的含有山梨醇的選擇板(0.67％酵母氮基w/o氨基酸，0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/組氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉，0.086‰的必需缺失氨基酸，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH5.8)上。將板在30℃下孵育3-5天。在適當(dāng)?shù)倪x擇板上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行重新選擇。針對(duì)阿糖醇、木糖醇和核糖醇生產(chǎn)對(duì)每個(gè)產(chǎn)生的菌株一式三份地進(jìn)行測(cè)試。為此目的，使克隆首先在種子培養(yǎng)基(0.67％不含氨基酸的酵母氮源；0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/組氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉；0.086‰的必需缺失氨基酸；5％葡萄糖；pH5.7)中在30℃下生長(zhǎng)過夜。將來自這種過夜培養(yǎng)物的主培養(yǎng)物以0.2的起始OD600接種在生產(chǎn)培養(yǎng)基(0.67％不含氨基酸的酵母氮源；0.13％不含亮氨酸/尿嘧啶/組氨酸/色氨酸/甲硫氨酸的漏失型粉；0.086‰的必需缺失氨基酸；15％葡萄糖；pH5.7)中。使這種培養(yǎng)物在37℃下生長(zhǎng)48小時(shí)，并且使用HPX-87柱(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)和TQ-檢測(cè)器(連接至三重四極桿檢測(cè)器上的UPLC，沃特斯公司(Waters)，米爾福德市，馬薩諸塞州)及用100％水作為流動(dòng)相的等度條件通過HPLC/MS測(cè)定上清液的阿糖醇、木糖醇和核糖醇濃度。所有測(cè)試的菌株的多元醇滴度描繪于表8中。表8nd–未檢測(cè)到與野生型NADH特異性酶相比，樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的使用使得木糖醇滴度顯著增加。實(shí)例13.質(zhì)粒氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因在奧默畢赤酵母中的表達(dá)除使用樹干畢赤酵母的NADP特異性木糖醇脫氫酶的木糖醇生產(chǎn)菌株之外，還對(duì)表達(dá)氧化葡糖桿菌的NADP特異性木糖醇脫氫酶的第二菌株進(jìn)行了工程化。衍生自ATCC20209并且是亮氨酸和尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型的奧默畢赤酵母菌株SRLU(MATh-leu2ura3)(佩里達(dá)(Piredda)和蓋拉丁(Gaillardin)，1994，同上)被用作用于通過用質(zhì)粒pEVE3157(大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶)和pEVE3284(氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶)進(jìn)行轉(zhuǎn)化來構(gòu)建分泌木糖醇的酵母菌株的宿主，得到菌株EYS3324。作為對(duì)照，還產(chǎn)生了用以下單個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株：-pEVE3157(大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶)和-pEVE3284(氧化葡糖桿菌的NADH特異性木糖醇脫氫酶)，分別得到EYS3067和EYS3323。與在表達(dá)樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶的菌株中使用的poRR啟動(dòng)子形成對(duì)照，用于構(gòu)建以上菌株的大腸桿菌D-阿糖醇4-氧化還原酶受poPGK1啟動(dòng)子的控制。然而，為了排除啟動(dòng)子影響并且因此能夠?qū)⒈磉_(dá)來自氧化葡糖桿菌的木糖醇脫氫酶的菌株中的多元醇水平與表達(dá)來自樹干畢赤酵母的對(duì)應(yīng)酶的那些進(jìn)行比較，已經(jīng)產(chǎn)生了另外的菌株。通過用以下項(xiàng)轉(zhuǎn)化SRLU宿主來獲得這個(gè)菌株EYS2963-pEVE3123(大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶)和-pEVE2564(樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶)。酵母轉(zhuǎn)化如在實(shí)例12中所描述的進(jìn)行。如在實(shí)例12中所描述的，針對(duì)阿糖醇、木糖醇和核糖醇生產(chǎn)對(duì)每個(gè)產(chǎn)生的菌株一式三份地進(jìn)行測(cè)試。所有測(cè)試的菌株的多元醇滴度描繪于表9中。表9nd–未檢測(cè)到表達(dá)來自氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的菌株(EYS3324)中的木糖醇滴度類似于表達(dá)來自樹干畢赤酵母的對(duì)應(yīng)酶的菌株(EYS2963)的那些。然而，氧化葡糖桿菌酶導(dǎo)致低得多的核糖醇滴度，因而顯示出對(duì)木酮糖較高的底物特異性。實(shí)例14.具有增加的阿糖醇分泌的突變型奧默畢赤酵母菌株的產(chǎn)生已經(jīng)從奧默畢赤酵母ATCC20209的UV輻射的懸浮液中選擇了較高阿糖醇生產(chǎn)者突變體。UV輻射系統(tǒng)(VilberLourmat，法國(guó))配備有微處理器控制的RMX-3W輻射計(jì)。使奧默畢赤酵母在YPD瓊脂(右旋糖20g/L)上在37℃下生長(zhǎng)過夜。制備懸浮液達(dá)到106cfu/mL(OD620＝0.4)并且將5mL放入無菌培養(yǎng)皿中。將蓋從培養(yǎng)皿取下之后，對(duì)懸浮液進(jìn)行輻射處理。UV波長(zhǎng)是254nm并且輻射能是1.810-2J/cm2。獲得90％死亡率的酵母細(xì)胞。停止輻射并且替換培養(yǎng)皿上的蓋子之后，將懸浮液轉(zhuǎn)移到位于冰浴中的無菌管中。用經(jīng)突變的懸浮液接種20mL的YPD液體培養(yǎng)基并在37℃、250rpm下孵育12小時(shí)。孵育之后，將經(jīng)突變的培養(yǎng)物用無菌40％甘油(V/V)稀釋。將等分部分分配到5mL小瓶中并在-80℃下冷凍。篩選是基于奧默畢赤酵母能夠在非常高濃度的右旋糖(高達(dá)600g/L)上生長(zhǎng)的嗜滲特性。我們的目的在于選擇能夠在含有600g/L或700g/L右旋糖的YPD瓊脂上生長(zhǎng)地比母株快的突變體。將除霜的等分部分涂布在YPD600和YPD700上，并且選擇首先出現(xiàn)的菌落并針對(duì)在搖瓶中的阿糖醇生產(chǎn)對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。繼代培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基由葡萄糖(分別為50g/L或100g/L)、酵母提取物3g/L、MgSO41g/L和KH2PO42g/L(pH5.7)制成。將繼代培養(yǎng)物(10mL，在100mL燒瓶中)在37℃、250rpm下孵育24h。將生產(chǎn)培養(yǎng)基(40mL，在500mL燒瓶中)用5mL的繼代培養(yǎng)物接種并在37℃、250rpm下孵育64小時(shí)。葡萄糖g/L64h阿糖醇g/L64h奧默畢赤酵母ATCC202096.052.7奧默畢赤酵母CNCMI-4605058.6針對(duì)其較快地消耗葡萄糖及其較高的阿糖醇產(chǎn)量對(duì)突變型奧默畢赤酵母菌株進(jìn)行選擇并且將其在2012年3月7日在編號(hào)I-4605下保藏在法國(guó)的巴斯德研究所的國(guó)家微生物培養(yǎng)物保藏中心[NationalCollectionofMicroorganismCultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex15)。實(shí)例15.LEU2缺失質(zhì)粒的構(gòu)建為了能夠使用新產(chǎn)生的CNCMI-4605菌株進(jìn)行質(zhì)粒選擇和基因整合，構(gòu)建了用于缺失LEU2開放閱讀框的質(zhì)粒。在第一步中，根據(jù)釀酒酵母CRE/loxP系統(tǒng)對(duì)可以用于奧默畢赤酵母中的通用整合載體進(jìn)行改變。將載體骨架通過用PstI和EcoRV酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性切割而從pUG73(蓋爾德內(nèi)爾(Gueldener)等人，2002，核酸研究(NucleicAcidRes)，30，e23)中分離。用以下引物對(duì)產(chǎn)生了充當(dāng)含有奧默畢赤酵母的側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的LEU2選擇標(biāo)記的PCR片段的插入物：-EV3043(CACTGGCGCGCCCACTGCATGCGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGACACATCGTGGATCCAAGCTATCAACGAGAGAGTC)(SEQIDNo24)和-EV3044(AGTGGCTAGCAGTGCCATGGCCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATATTAAGGGTTCTCGAGACGCGTCATCTAGCATCTCATCTACCAACTC)(SEQIDNo25)和-作為模板的poARS(plig3-FR2772788-參見圖6)。正向引物EV3043含有在SphI位點(diǎn)(加下劃線的)之前的AscI(加下劃線的)位點(diǎn)，后面是48bp長(zhǎng)的loxP片段(粗體)和DraIII位點(diǎn)(加下劃線的)。EV3043的3’端含有另外的25bp長(zhǎng)的用于擴(kuò)增奧默畢赤酵母LEU2基因的片段。另一方面，反向引物EV3044含有在NcoI位點(diǎn)(加下劃線的)之前的NheI(加下劃線的)位點(diǎn)，后面是48bp長(zhǎng)的loxP片段(粗體)和MluI位點(diǎn)(加下劃線的)。EV3044的3’端含有另外的25bp長(zhǎng)的用于擴(kuò)增奧默畢赤酵母LEU2基因的片段。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中擴(kuò)增模板。這樣進(jìn)行PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/65℃下10sec/72℃下50sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下7分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。第二次PCR反應(yīng)中的經(jīng)擴(kuò)增的片段的側(cè)翼為用于進(jìn)一步亞克隆的PstI和EcoRV位點(diǎn)。用以下項(xiàng)：-引物EV3056(CACTCTGCAGCACTGGCGCGCCCACTGCAT)(SEQIDNo26)，含有PstI位點(diǎn)(加下劃線的)和-引物EV3057(CACTGATATCAGTGGCTAGCAGTGCCATGG)(SEQIDNo27)，含有EcoRV位點(diǎn)(加下劃線的)在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/72℃下45sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下7分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將經(jīng)擴(kuò)增的2.5kbLEU2標(biāo)記用PstI和EcoRV酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)凝膠純化并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至載體pUG73(蓋爾德內(nèi)爾(Gueldener)等人，2002，核酸研究(NucleicAcidRes)，30，e23)的2.4kbPstI/EcoRV(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)、凝膠純化的(ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒-Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)的骨架上持續(xù)2h–(圖22)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2787(圖23)含有在內(nèi)源啟動(dòng)子和終止子的控制之下、側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2選擇標(biāo)記。另外，已經(jīng)在第一個(gè)loxP的上游引入了AscI和SphI位點(diǎn)并且在第二個(gè)loxP的下游引入了NheI和NcoI位點(diǎn)，以便幫助與基因組中的整合位點(diǎn)同源的區(qū)域的克隆。然后，在第二克隆步驟中，用諾爾斯鏈霉菌的nat1抗性基因替換整合載體的LEU2標(biāo)記，因?yàn)槟康氖鞘箖?nèi)源LEU2開放閱讀框缺失。根據(jù)SEQIDNo28的提交序列，用化學(xué)方法由GeneSynthesis(生命科技公司，雷根斯堡，德國(guó))合成編碼諾爾斯鏈霉菌的nat1基因的DNA片段。編碼nat1基因的序列S60706.1(從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/S60706.1獲得)的核苷酸204至776被用作模板并且根據(jù)表7(上文)，使用從http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/獲得的Optimizer程序使其經(jīng)受密碼子優(yōu)化以用于在奧默畢赤酵母ATCC20209中使用。在所得序列的5’和3’端，在文本文件中手動(dòng)添加分別編碼限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸，以便有助于進(jìn)一步克隆。另外，腺苷三聯(lián)體被包括在起始ATG之前，以將酵母的Kozak樣序列的-3位處的腺苷考慮在內(nèi)。然后將最終序列(SEQIDNo28)提交給GeneArt(雷根斯堡，德國(guó))進(jìn)行合成。將所合成的編碼nat1基因的DNA片段作為5μg凍干的質(zhì)粒DNA在pMA-T衍生的載體(12ABTV4P，圖24)中遞送。為了克隆nat1基因，使用含有核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和終止子的載體。用乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子交換該終止子，并且在啟動(dòng)子與終止子序列之間引入nat1基因。為此目的，通過用以下項(xiàng)進(jìn)行的PCR產(chǎn)生乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子：-引物EV3393(CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG)(SEQIDNo29)，含有SphI位點(diǎn)(加下劃線的)和-引物EV3394(GGACCGCGGAAAGGTGAGGAAGTATATGAAC)(SEQIDNo30)，含有SacII位點(diǎn)(加下劃線的)和-作為模板的pEVE2523(圖7)。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/59℃下10sec/72℃下10sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將239bppoURA3終止子用SphI和SacII酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至用SphI和SacII限制酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)線性化且用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)凝膠純化的pEVE2681的11kb載體骨架上持續(xù)2h。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。在第二克隆步驟中，將nat1基因通過用SphI和AscI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性切割而從12ABTV4P(圖24)中釋放。另外，在SphI與AscI消化之間，用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)將SphI位點(diǎn)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min。然后將587bp凝膠純化的片段(ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒-Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)連接至上文描述的用SphI和AscI限制酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)切割的載體的凝膠純化的10.5kb載體骨架上。并且在室溫下用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)將載體的SphI位點(diǎn)平端化15min，隨后在用AscI消化之前在70℃下進(jìn)行10min的熱失活步驟。另外，使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)使載體在37℃下脫磷酸1h。使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行2h的連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2798(圖25)含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子的nat1抗藥標(biāo)記。nat1表達(dá)盒用于替換整合型載體中的奧默畢赤酵母LEU2選擇標(biāo)記。為了有助于進(jìn)一步克隆，通過用以下項(xiàng)進(jìn)行的PCR，nat1盒的側(cè)翼必須為XbaI(在引物EV3643中加下劃線的)和MluI(在引物EV3644中加下劃線的)位點(diǎn)：-引物EV3643(CACTTCTAGACACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG)(SEQIDNo31)和-引物EV3644(CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG)(SEQIDNo32)。引物EV3643在XbaI位點(diǎn)之后含有另外的ClaI位點(diǎn)(點(diǎn)劃線)。pEVE2798充當(dāng)模板(圖25)。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/54℃下10sec/72℃下25sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將1.3kbnat1表達(dá)盒用MluI和XbaI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至用MluI和XbaI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)線性化且用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)凝膠純化的pEVE2787(圖23)的2.6kb載體骨架上持續(xù)2h(圖26)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2852(圖27)含有在核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子的控制之下且側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的nat1選擇標(biāo)記。到目前為止，整合質(zhì)粒不含有位點(diǎn)特異性整合進(jìn)基因組中所需的任何奧默畢赤酵母同源片段。在下一步驟中附接上這些位點(diǎn)。用以下項(xiàng)從50ngpoARS載體(圖6)擴(kuò)增LEU2開放閱讀框上游的5’同源區(qū)域：-引物EV3548(CACTCTGCAGGATCCAAGCTATCAACGAGA)(SEQIDNo33)，含有PstI位點(diǎn)(加下劃線的)和-引物EV3549(CACTGCATGCGTTGCGGAAAAAACAGCC)(SEQIDNo34)，含有SphI位點(diǎn)(加下劃線的)。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR。這樣完成擴(kuò)增：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/61℃下10sec/72℃下15sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將567bp片段用PstI和SphI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至用PstI和SphI限制酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)線性化且用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)凝膠純化的pEVE2852(圖27)的3.9kb載體骨架上持續(xù)2h(圖29)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2855(圖28)含有與LEU2開放閱讀框上游的5’區(qū)域同源的片段和側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的nat1標(biāo)記。用以下項(xiàng)從50ngpoARS載體(圖6)擴(kuò)增LEU2開放閱讀框下游的3’同源區(qū)域：-引物EV3550(CACTCCATGGAGTAGGTATATAAAAATATAAGAG)(SEQIDNo35)，含有NcoI位點(diǎn)(加下劃線的)和-引物EV3551(CACTGCTAGCGTCGACAACAGCAACTAG)(SEQIDNo36)，含有NheI位點(diǎn)(加下劃線的)。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行PCR。這樣完成擴(kuò)增：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/51℃下10sec/72℃下25sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將1.3kb片段用NcoI和NheI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至用NcoI和NheI限制酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)線性化且用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)凝膠純化的pEVE2855(圖28)的4.4kb載體骨架上持續(xù)2h(圖29)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得最終LEU2缺失質(zhì)粒pEVE2864(圖30)含有與LEU2開放閱讀框上游的5’區(qū)域同源的片段和與LEU2開放閱讀框下游的3’區(qū)域同源的片段及側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的nat1標(biāo)記。實(shí)例16.亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的突變型奧默畢赤酵母菌株的產(chǎn)生由于到目前為止所產(chǎn)生的奧默畢赤酵母CNCMI-4605菌株并未展示出任何營(yíng)養(yǎng)缺陷現(xiàn)象，進(jìn)行LEU2開放閱讀框缺失，以便能夠使用LEU2選擇標(biāo)記進(jìn)行基因整合。為此目的，將質(zhì)粒pEVE2864(圖30)用EcoRV和PstI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下進(jìn)行限制性酶切2.5h，并且根據(jù)實(shí)例12中描述的程序?qū)⒒旌衔镉糜谵D(zhuǎn)化Mut165菌株。向再生的細(xì)胞中添加7ml具有25μg/ml納他霉素的50℃的溫頂層瓊脂(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH5.8和2.5％諾布爾瓊脂)，并且將混合物均勻地倒在具有25μg/ml納他霉素的預(yù)溫的含有山梨醇的選擇板(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，1M山梨醇，pH5.8和2％瓊脂)上。將板在30℃下孵育4天。通過在不含亮氨酸的選擇板上的不生長(zhǎng)，對(duì)LEU2開放閱讀框的缺失進(jìn)行驗(yàn)證并且通過使用以下項(xiàng)的菌落PCR進(jìn)行證實(shí)：-引物EV3393(CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG)(SEQIDNo29)和-引物EV3795(CAAGTCGTGGAGATTCTGC)(SEQIDNo37)。這樣擴(kuò)增1.6kb片段：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/51℃下10sec/72℃下25sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。所得菌株含有CNCMI-4605背景下的LEU2基因的完全開放閱讀框缺失并且將其在2015年2月5日在編號(hào)I-4955下保藏在法國(guó)的巴斯德研究所的國(guó)家微生物培養(yǎng)物保藏中心[NationalCollectionofMicroorganismCultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724巴黎(PARIS)cedex15)。實(shí)例17.包含樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了能夠在僅是亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的突變型奧默畢赤酵母菌株中表達(dá)樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，需要構(gòu)建雙表達(dá)質(zhì)粒。將含有樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的表達(dá)盒通過用SpeI和SacII酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性切割而從pEVE2562(圖12)中釋放。將1.9kb片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min。然后使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)將插入物在室溫下連接至含有大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的12.1kbSpeI線性化、平端化、脫磷酸(在37℃下1h，使用南極磷酸酶-新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)且凝膠純化的pEVE3157骨架(圖21)上持續(xù)2h(圖31)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3318(圖32)含有樹干畢赤酵母的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子(poRR)的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和核酮糖還原酶(poRR)終止子的控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體,以及poLEU2選擇標(biāo)記。實(shí)例18.用于在奧默畢赤酵母中表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和樹干畢赤酵母NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的整合型載體的構(gòu)建大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因應(yīng)該最終成為奧默畢赤酵母基因組的組成部分。因此，必須通過替換pEVE2852的nat1選擇標(biāo)記并摻入阿糖醇氧化還原酶和木糖醇脫氫酶的雙表達(dá)構(gòu)建體來構(gòu)建具有LEU2選擇標(biāo)記的整合型載體。為此目的，通過用以下項(xiàng)進(jìn)行的PCR產(chǎn)生側(cè)翼為AscI和SphI位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2開放閱讀框：-引物EV3645(CAAGGCGCGCCAAAATGTCTACCAAAACCATTAC)(SEQIDNo38)和-引物EV3646(GGAGCATGCCTACTTTCCCTCAGCCAAG)(SEQIDNo39)。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中用50ng的poARS(圖6)模板進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/57℃下10sec/72℃下20sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。隨后將經(jīng)擴(kuò)增的LEU2開放閱讀框用AscI和SphI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切。另外，在SphI與AscI消化之間，用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)將SphI位點(diǎn)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min。然后將1.1kb凝膠純化的片段連接至用SphI和AscI限制酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)切割的pEVE2811的凝膠純化的11kb載體骨架上。并且在室溫下用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)將載體的SphI位點(diǎn)平端化15min，隨后在用AscI消化之前在70℃下進(jìn)行10min的熱失活步驟。另外，使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)使載體在37℃下脫磷酸1h。使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行2h的LEU2開放閱讀框和載體骨架的連接。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2862(圖33)含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶(poRR)啟動(dòng)子和乳清苷-5'-磷酸脫羧酶(poURA3)終止子的奧默畢赤酵母LEU2標(biāo)記。隨后，通過使用以下項(xiàng)進(jìn)行的PCR來擴(kuò)增LEU2標(biāo)記：-引物EV3643(CACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG)(SEQIDNo31)，含有ClaI位點(diǎn)，和-引物EV3644(CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG)(SEQIDNo32)，含有MluI位點(diǎn)(加下劃線)，以及作為模板的pEVE2862(圖33)。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/54℃下10sec/72℃下30sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將擴(kuò)增的1.8kb長(zhǎng)的LEU2片段用ClaI和MluI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至pEVE2852(圖27)的2.6kbClaI和MluI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)限制性酶切的且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖34)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE2865(圖35)含有側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2標(biāo)記。為了克隆整合載體，將pEVE2865用SalI酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min并使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下脫磷酸1h。載體骨架的4.5kb凝膠純化的片段用于連接。通過用NdeI和SacII酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性切割而從pEVE3318(圖32)中釋放的樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體充當(dāng)插入物。將4.4kb片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min，隨后是另外的凝膠純化。將pEVE2865的載體骨架和pEVE3318的插入物在室溫下使用T4DNA連接酶(英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接2h(圖34)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3387(圖36)含有樹干畢赤酵母的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子(poRR)的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因和大腸桿菌的在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體。側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2基因充當(dāng)選擇標(biāo)記。實(shí)例19.將木糖醇分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的第一代整合型奧默畢赤酵母菌株的構(gòu)建先前描述的載體用于將大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因隨機(jī)整合到奧默畢赤酵母的基因組中。為此目的，根據(jù)實(shí)例12中描述的程序，將亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株CNCMI-4955(實(shí)例16)用被NotI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)限制性酶切的pEVE3387(圖36)在37℃下轉(zhuǎn)化3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。所得菌株含有隨機(jī)整合到奧默畢赤酵母基因組中的大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因，并且將其在2015年5月20日在編號(hào)I-4982下保藏在法國(guó)的巴斯德研究所的國(guó)家微生物培養(yǎng)物保藏中心[NationalCollectionofMicroorganismCultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724Cedex15)。實(shí)例20.包含氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙/三表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了能夠在僅是亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的突變型奧默畢赤酵母菌株中表達(dá)氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，需要構(gòu)建雙表達(dá)質(zhì)粒。將含有氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的表達(dá)盒通過用SpeI和SacII酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)限制性切割而從pEVE3284(圖10)中釋放。將1.6kb片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min。所使用的載體骨架由含有大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的12.1kbSpeI線性化(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)且凝膠純化的(ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒-Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)pEVE3157骨架(圖21)組成。骨架另外已經(jīng)在室溫下用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min并使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下脫磷酸1h。使用T4DNA連接酶(英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行2h的連接(圖37)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3322和pEVE3324(圖38)含有氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子(poRR)的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體，或氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子(poRR)的兩個(gè)NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因和大腸桿菌的在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的三表達(dá)構(gòu)建體，并且均含poLEU2選擇標(biāo)記。實(shí)例21.用于在奧默畢赤酵母中表達(dá)大腸桿菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和氧化葡糖桿菌NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的整合型載體的構(gòu)建除含有樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因的整合型載體之外，還產(chǎn)生了含有氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的質(zhì)粒。為此目的，將含有氧化葡糖桿菌的一種或兩種NADPH特異性木糖醇脫氫酶和大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)盒和三表達(dá)盒通過用NdeI和SacII酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性切割而分別從pEVE3322和pEVE3324(圖38)中釋放。將4.1kb和5.7kb片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min。凝膠純化的(ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒-Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)5.7kbSalI線性化的pEVE2865(圖35)充當(dāng)載體。載體骨架另外已經(jīng)在室溫下用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min并使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下脫磷酸1h。使用T4DNA連接酶(英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行2h的載體和插入物的連接(圖39)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3390和pEVE3392(圖40)含有氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子(poRR)的一個(gè)或兩個(gè)NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因和大腸桿菌的在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體或三表達(dá)構(gòu)建體。側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2基因充當(dāng)選擇標(biāo)記。實(shí)例22.能夠分泌多于100g/L木糖醇的第二代整合型菌株的構(gòu)建含有大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和樹干畢赤酵母的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的隨機(jī)整合拷貝的第一代菌株CNCMI-4982用于進(jìn)一步整合這兩種異源酶的另外拷貝。然而，為了能夠整合以上構(gòu)建體，必須去除LEU2選擇標(biāo)記。為此目的，根據(jù)實(shí)例12中描述的程序，用載體pEVE3163轉(zhuǎn)化第一代菌株CNCMI-4982。載體pEVE3163含有噬菌體P1的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子(poRR)的CRE重組酶(根據(jù)表7進(jìn)行密碼子優(yōu)化)。通過在不含亮氨酸的板上克隆的不生長(zhǎng)來證實(shí)去除了LEU2選擇標(biāo)記。根據(jù)實(shí)例12中描述的程序，將所得菌株EYS3842用被NotI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)限制性酶切的pEVE3390或pEVE3392(圖40)在37℃下轉(zhuǎn)化3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。所得第二代菌株EYS3929含有隨機(jī)整合到基因組中的大腸桿菌的兩個(gè)NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和兩個(gè)NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因(一個(gè)來自氧化葡糖桿菌且另一個(gè)來自樹干畢赤酵母)。另一方面，菌株EYS3930含有氧化葡糖桿菌的另外的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因。實(shí)例23.用于整合大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的另外基因拷貝的另外載體的構(gòu)建為了構(gòu)建另外的整合載體，通過使用以下項(xiàng)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的雙表達(dá)盒：-引物EV4904(ATATCCCGGGCACCGTCATCACCGAAACGC)(SEQIDNo40)，含有SmaI位點(diǎn)，和-引物EV4905(ATATCCCGGGCACGACCACGCTGATGAGC)(SEQIDNo41)，含有SmaI位點(diǎn)(加下劃線的)和作為模板的pEVE3321。在適當(dāng)?shù)?X緩沖液中，在由200μM的每種dNTP和0.5μM的每種引物與0.02U/μl的iProofTM聚合酶(伯樂公司，赫拉克勒斯，加利福尼亞州)組成的反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增。這樣完成PCR：98℃下30sec的預(yù)變性步驟，隨后是98℃下10sec/68℃下10sec/72℃下75sec的30個(gè)循環(huán)，和72℃下5分鐘的最終延伸步驟。在1％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物，提取并使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)純化。將擴(kuò)增的3.9kb長(zhǎng)的片段用SmaI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切，并在室溫下使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)連接至pEVE2865(圖35)的4.4kbPvuII(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)線性化、南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)脫磷酸且凝膠純化的載體骨架上持續(xù)2h(圖41)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE4390(圖42)含有大腸桿菌的在奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶(poPGK1)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)酮醇酶(poTKL)終止子的控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶和氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子(poRR)的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因的雙表達(dá)構(gòu)建體。側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的奧默畢赤酵母LEU2基因充當(dāng)選擇標(biāo)記。實(shí)例24.用于整合氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的載體的構(gòu)建如下構(gòu)建用于表達(dá)氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的另外的整合型載體：在第一步中，產(chǎn)生了含有以上兩個(gè)基因的雙表達(dá)載體。將這個(gè)雙表達(dá)盒克隆進(jìn)整合型loxP載體中。根據(jù)序列SEQIDNo42的提交序列，由GeneSynthesis(生命科技公司，雷根斯堡，德國(guó))用化學(xué)方法合成編碼青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因的DNA片段。編碼dalD基因的序列AL646052.1(從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL646052獲得)的核苷酸2310548至2309151被用作模板并且根據(jù)表7(上文)，使用從http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/獲得的Optimizer程序使其經(jīng)受密碼子優(yōu)化以用于在奧默畢赤酵母ATCC20209中使用。在所得序列的5’和3’端，在文本文件中手動(dòng)添加分別編碼限制酶AscI(GGCGCGCC)和SphI(GCATGC)的識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸，以便有助于進(jìn)一步克隆。另外，腺苷三聯(lián)體被包括在起始ATG之前，以將酵母的Kozak樣序列的-3位處的腺苷考慮在內(nèi)。然后將最終序列(SEQIDNo42)提交給GeneArt(雷根斯堡，德國(guó))進(jìn)行合成。將所合成的編碼dalD基因的DNA片段作為5μg凍干的質(zhì)粒DNA在pMA-RQ衍生的載體(13AB2EGP，圖43)中遞送。將來自青枯雷爾氏菌的D-阿糖醇4-氧化還原酶的1.4kb片段通過用AscI和SphI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切而從載體13AB2EGP(圖43)中釋放，并用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化。然后使用T4DNA連接酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)將插入物與用AscI和SphI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)線性化且凝膠純化的pEVE2560(圖8)的11.8kb骨架連接(圖44)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE3898(圖45)含有側(cè)翼為奧默畢赤酵母的核酮糖還原酶啟動(dòng)子和終止子的經(jīng)密碼子優(yōu)化的青枯雷爾氏菌NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶，以及poLEU2選擇標(biāo)記。在下一步驟中，將含有氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(poPGK)和核酮糖還原酶終止子(poRR)的NADPH特異性木糖醇脫氫酶的表達(dá)盒通過用SpeI和SacII(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性酶切而從pEVE3960中釋放。將1.8kb片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min。凝膠純化的(ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒-Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)13.2kbSalI線性化的pEVE3898充當(dāng)載體。載體骨架另外已經(jīng)在室溫下用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min并使用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下脫磷酸1h。使用T4DNA連接酶(英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行2h的載體和插入物的連接(圖44)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE4077(圖46)含有氧化葡糖桿菌的側(cè)翼為奧默畢赤酵母磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子(poPGK)和核酮糖還原酶終止子(poRR)的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和青枯雷爾氏菌的在奧默畢赤酵母核酮糖還原酶啟動(dòng)子和(poRR)終止子控制之下的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體，以及poLEU2選擇標(biāo)記。最后，將氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)盒通過用SapI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)進(jìn)行限制性切割而從pEVE4077(圖46)中釋放。將5.9kb片段使用ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)進(jìn)行凝膠純化并用平端化酶混合物試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下平端化15min，隨后使酶在70℃下熱失活10min。用南極磷酸酶(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下脫磷酸1h的凝膠純化的(ZymocleanTM凝膠DNA回收試劑盒-Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)4.4kbEcoRV線性化的pEVE2865(圖35)充當(dāng)載體。使用T4DNA連接酶(英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在室溫下進(jìn)行2h的載體和插入物的連接(圖44)。用連接混合物轉(zhuǎn)化XL10Gold超感受態(tài)細(xì)胞(安捷倫科技公司，圣克拉拉，加利福尼亞州)之后，使用ZyppyTM質(zhì)粒小量制備試劑盒(Zymo研究公司，歐文市，加利福尼亞州)分離質(zhì)粒DNA，并且通過限制性酶切和測(cè)序(Microsynth，巴爾加赫，瑞士)進(jìn)一步表征。所得質(zhì)粒pEVE4377(圖47)含有氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的雙表達(dá)構(gòu)建體及側(cè)翼為兩個(gè)loxP位點(diǎn)的poLEU2選擇標(biāo)記。實(shí)例25.具有增加的木糖醇生產(chǎn)力的第三代整合型菌株的構(gòu)建如在實(shí)例18中所描述的，使用載體pEVE3163以lox方式剔除第二代菌株EYS3929和EYS3930(實(shí)例22)的LEU2標(biāo)記。用pEVE4377(圖47)和pEVE4390(圖42)分別轉(zhuǎn)化所得菌株EYS4118和EYS4119。根據(jù)實(shí)例12中描述的程序，將載體用NotI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)在37℃下限制性酶切3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。所得第三代菌株EYS4353含有隨機(jī)整合到基因組中的三個(gè)NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因(兩個(gè)來自大腸桿菌且一個(gè)來自青枯雷爾氏菌)和三個(gè)NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因(兩個(gè)來自氧化葡糖桿菌且一個(gè)來自樹干畢赤酵母)。另一方面，第二種第三代菌株含有三個(gè)拷貝的大腸桿菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶、三個(gè)拷貝的氧化葡糖桿菌的NADPH特異性木糖醇脫氫酶和一個(gè)來自樹干畢赤酵母的拷貝背景，并且將其在2015年3月5日在編號(hào)I-4960下保藏在法國(guó)的巴斯德研究所的國(guó)家微生物培養(yǎng)物保藏中心[NationalCollectionofMicroorganismCultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex15)。實(shí)例26.第四代整合型菌株的構(gòu)建如在實(shí)例18中所描述的，使用載體pEVE3163以lox方式剔除第三代菌株CNCMI-4960(實(shí)例25)的LEU2標(biāo)記。根據(jù)實(shí)例12中描述的程序，將所得菌株EYS4955用被NotI(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室，伊普斯維奇，馬薩諸塞州)限制性酶切的pEVE4377(圖47)在37℃下轉(zhuǎn)化3h。在不含任何亮氨酸的山梨醇板上對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。所得第四代菌株含有隨機(jī)整合到基因組中的四個(gè)NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶基因(三個(gè)來自大腸桿菌且一個(gè)來自青枯雷爾氏菌)和四個(gè)NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因(三個(gè)來自氧化葡糖桿菌且一個(gè)來自樹干畢赤酵母)，并且將其在2015年5月20日在編號(hào)I-4981下保藏在法國(guó)的巴斯德研究所的國(guó)家微生物培養(yǎng)物保藏中心[NationalCollectionofMicroorganismCultures](CNCM)(多科特路科斯(DocteurRoux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex15)。實(shí)例27.用奧默畢赤酵母菌株進(jìn)行的多元醇生產(chǎn)(合成培養(yǎng)基)根據(jù)以下方案發(fā)酵如上文所述構(gòu)建的酵母菌株CNCMI-4605、CNCMI-4982、CNCMI-4960和CNCMI-4981。發(fā)酵過程在限氮下運(yùn)行且可以分為生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期。在生長(zhǎng)期過程中，培養(yǎng)基中的氨被完全消耗以產(chǎn)生生物質(zhì)，一旦生物質(zhì)形成停止，則生產(chǎn)期開始且多元醇水平增加。用于所描述發(fā)酵過程的平臺(tái)是來自INFORSHT的使用具有1L工作體積的容器的Multifors2。發(fā)酵罐配備有兩個(gè)Rushton六葉片圓盤渦輪。使用空氣以便為發(fā)酵罐鼓泡。在整個(gè)培養(yǎng)過程中控制溫度、pH、攪拌和通氣速率。將溫度維持在36℃。將pH通過自動(dòng)添加5MKOH保持在3。通氣速率保持在1.0vvm并且將初始攪拌器速度設(shè)為300rpm。為了防止溶解氧(DO)降至低于20％，應(yīng)用自動(dòng)攪拌級(jí)聯(lián)。在發(fā)酵過程中使用的操作條件總結(jié)于表10中。表10：用于多元醇生產(chǎn)發(fā)酵的操作條件為了接種發(fā)酵罐，使用1階段繁殖培養(yǎng)物。所使用的繁殖培養(yǎng)基的組成描述于表11中。通過接種具有4個(gè)擋板(鋸齒形缺口)的500-ml搖瓶中的100ml培養(yǎng)基來制備繁殖培養(yǎng)物。將搖瓶在搖床上在30℃和150rpm下進(jìn)行孵育。使細(xì)胞生長(zhǎng)約24小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期。表11：繁殖培養(yǎng)基組成。接種之前，去除發(fā)酵罐中的等于接種物量的培養(yǎng)基量并且將繁殖培養(yǎng)物的等分部分用于接種發(fā)酵罐，至最終體積為1L且初始OD600為大約0.2(CDW大約0.03g/L)。發(fā)酵罐中使用的培養(yǎng)基的組成描述于表12中。表12：發(fā)酵培養(yǎng)基組成。定期取樣并且針對(duì)葡萄糖消耗和細(xì)胞外多元醇(木糖醇、阿糖醇和核糖醇)形成對(duì)總發(fā)酵液進(jìn)行分析。此外，對(duì)常見發(fā)酵代謝物(甘油、乙酸鹽、乙醇、丙酮酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽和琥珀酸鹽)進(jìn)行了測(cè)定。生物質(zhì)增加之后一方面是OD600測(cè)定并且另一方面是細(xì)胞干重(CDW)測(cè)定。上文提及的測(cè)量值用于確定多元醇生產(chǎn)、阿糖醇或木糖醇產(chǎn)率和生產(chǎn)力；結(jié)果示于表13中。表13：用奧默畢赤酵母菌株進(jìn)行的多元醇生產(chǎn)(合成培養(yǎng)基)。奧默畢赤酵母CNCMI-4605僅產(chǎn)生阿糖醇。奧默畢赤酵母CNCMI-4982產(chǎn)生阿糖醇、木糖醇和核糖醇。在這個(gè)菌株中，已經(jīng)整合了一個(gè)拷貝的NAD+-D-阿糖醇4-氧化還原酶基因和一個(gè)拷貝的NADPH特異性木糖醇脫氫酶基因。經(jīng)修飾的菌株現(xiàn)在能夠消耗阿糖醇。因此，在完全消耗葡萄糖之后，CNCMI-4982再消耗阿糖醇和核糖醇從而產(chǎn)生更多的木糖醇。奧默畢赤酵母CNCMI-4960(第三代)和CNCMI-4981(第四代)產(chǎn)生木糖醇和核糖醇，但是不產(chǎn)生更多的阿糖醇。阿糖醇向木酮糖和木糖醇的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化足夠有效以避免阿糖醇分泌到培養(yǎng)液中。向奧默畢赤酵母中引入越多拷貝的編碼NAD+特異性D-阿糖醇氧化還原酶和NADPH特異性木糖醇脫氫酶的基因，木糖醇的滴度、產(chǎn)率和生產(chǎn)力越高。序列表<110>羅蓋特兄弟公司（ROQUETTEFRERES）<120>通過重組菌株從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇<130>SCT166540-20<160>43<170>PatentIn3.5版<210>1<211>1385<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼NAD特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的側(cè)翼為限制位點(diǎn)的序列<220><221>尚未歸類的特征<222>(1)..(8)<223>AscI識(shí)別位點(diǎn)<220><221>CDS<222>(12)..(1379)<220><221>尚未歸類的特征<222>(1380)..(1385)<223>SphI識(shí)別位點(diǎn)<400>1ggcgcgccaaaatgaacgagcagttcacctggttgcacatcggtttgggt50MetAsnGluGlnPheThrTrpLeuHisIleGlyLeuGly1510tctttccacagagctcaccaggcttggtacttgcacagattgcaggtt98SerPheHisArgAlaHisGlnAlaTrpTyrLeuHisArgLeuGlnVal152025atgggtgacaagagatggtctatcgctgctggtaacatcagaaacgac146MetGlyAspLysArgTrpSerIleAlaAlaGlyAsnIleArgAsnAsp30354045gctgagcacgttgttcaggctttgtctgctcagaagggtagatacgtt194AlaGluHisValValGlnAlaLeuSerAlaGlnLysGlyArgTyrVal505560ttggagaccgtttctccagagggtgtttctgagtacgaggagatcacc242LeuGluThrValSerProGluGlyValSerGluTyrGluGluIleThr657075tctatccagaagttgatcccatggcaggctgacttgcagccattgatc290SerIleGlnLysLeuIleProTrpGlnAlaAspLeuGlnProLeuIle808590gctgagggtgctgacccaaagaccaaggttatcgctttcaccgttacc338AlaGluGlyAlaAspProLysThrLysValIleAlaPheThrValThr95100105gagggtggttactacttgaacacctctcacaagttggaggttaacaac386GluGlyGlyTyrTyrLeuAsnThrSerHisLysLeuGluValAsnAsn110115120125ccagacttggctgctgacttgaagggtggttgtaagaccatctacggt434ProAspLeuAlaAlaAspLeuLysGlyGlyCysLysThrIleTyrGly130135140gttatcaccagaatcttggaggctagaatggctaacaacgctggtcca482ValIleThrArgIleLeuGluAlaArgMetAlaAsnAsnAlaGlyPro145150155ttgaccttgttgaactgtgacaacgttagacacaacggtgagagattc530LeuThrLeuLeuAsnCysAspAsnValArgHisAsnGlyGluArgPhe160165170cacgacggtttggttgagttcttgcagttgaccggtaagcaggacgtt578HisAspGlyLeuValGluPheLeuGlnLeuThrGlyLysGlnAspVal175180185atcgactggttgtctaccaacaccacctgtccaaacaccatggttgac626IleAspTrpLeuSerThrAsnThrThrCysProAsnThrMetValAsp190195200205agaatcaccccaagaccagctgctgagttgccagctagaatcaaggct674ArgIleThrProArgProAlaAlaGluLeuProAlaArgIleLysAla210215220cagaccggtatcgctgacaaggctccagttatgggtgagaccttcatc722GlnThrGlyIleAlaAspLysAlaProValMetGlyGluThrPheIle225230235cagtgggttgttgaggacaacttcagagacgttagaccagctttggag770GlnTrpValValGluAspAsnPheArgAspValArgProAlaLeuGlu240245250aaggttggtgttgagttggttgcttctgttatcccatacgaggaggct818LysValGlyValGluLeuValAlaSerValIleProTyrGluGluAla255260265aagatcagaatcttgaactcttctcactcttgtatcgcttgggctggt866LysIleArgIleLeuAsnSerSerHisSerCysIleAlaTrpAlaGly270275280285accttgatcggtcagaagtacatccacgagtctaccatgaccgacttc914ThrLeuIleGlyGlnLysTyrIleHisGluSerThrMetThrAspPhe290295300atctaccagatcgctgacagatacgttaccgaggacgttatcccatgt962IleTyrGlnIleAlaAspArgTyrValThrGluAspValIleProCys305310315ttgggtgacaacggtatcgacttgccaacctacagagacgttgttttg1010LeuGlyAspAsnGlyIleAspLeuProThrTyrArgAspValValLeu320325330aagagattcaccaacccacacatccaggacaccaaccagagagttgct1058LysArgPheThrAsnProHisIleGlnAspThrAsnGlnArgValAla335340345gctgacggtttctctaagatcccagctatgatcgctccaaccttgaga1106AlaAspGlyPheSerLysIleProAlaMetIleAlaProThrLeuArg350355360365gagtgttaccagagaggtgttagaccaaacgctaccgctatgttgcca1154GluCysTyrGlnArgGlyValArgProAsnAlaThrAlaMetLeuPro370375380gctttgttctacgttttcatggagcagtggcaccacggtaagttgcca1202AlaLeuPheTyrValPheMetGluGlnTrpHisHisGlyLysLeuPro385390395tacgagtaccaggacggtatcttggacgctccagctgttcacgctatg1250TyrGluTyrGlnAspGlyIleLeuAspAlaProAlaValHisAlaMet400405410ttgcagtctgctgacccagttgctgtttacgcttctgacaaggctttg1298LeuGlnSerAlaAspProValAlaValTyrAlaSerAspLysAlaLeu415420425ttcggtgacttgaccgagagagaggacttcgctgctttgttgagagag1346PheGlyAspLeuThrGluArgGluAspPheAlaAlaLeuLeuArgGlu430435440445aagatcgctgacgtttacgctttgatcaactaagcatgc1385LysIleAlaAspValTyrAlaLeuIleAsn450455<210>2<211>455<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>2MetAsnGluGlnPheThrTrpLeuHisIleGlyLeuGlySerPheHis151015ArgAlaHisGlnAlaTrpTyrLeuHisArgLeuGlnValMetGlyAsp202530LysArgTrpSerIleAlaAlaGlyAsnIleArgAsnAspAlaGluHis354045ValValGlnAlaLeuSerAlaGlnLysGlyArgTyrValLeuGluThr505560ValSerProGluGlyValSerGluTyrGluGluIleThrSerIleGln65707580LysLeuIleProTrpGlnAlaAspLeuGlnProLeuIleAlaGluGly859095AlaAspProLysThrLysValIleAlaPheThrValThrGluGlyGly100105110TyrTyrLeuAsnThrSerHisLysLeuGluValAsnAsnProAspLeu115120125AlaAlaAspLeuLysGlyGlyCysLysThrIleTyrGlyValIleThr130135140ArgIleLeuGluAlaArgMetAlaAsnAsnAlaGlyProLeuThrLeu145150155160LeuAsnCysAspAsnValArgHisAsnGlyGluArgPheHisAspGly165170175LeuValGluPheLeuGlnLeuThrGlyLysGlnAspValIleAspTrp180185190LeuSerThrAsnThrThrCysProAsnThrMetValAspArgIleThr195200205ProArgProAlaAlaGluLeuProAlaArgIleLysAlaGlnThrGly210215220IleAlaAspLysAlaProValMetGlyGluThrPheIleGlnTrpVal225230235240ValGluAspAsnPheArgAspValArgProAlaLeuGluLysValGly245250255ValGluLeuValAlaSerValIleProTyrGluGluAlaLysIleArg260265270IleLeuAsnSerSerHisSerCysIleAlaTrpAlaGlyThrLeuIle275280285GlyGlnLysTyrIleHisGluSerThrMetThrAspPheIleTyrGln290295300IleAlaAspArgTyrValThrGluAspValIleProCysLeuGlyAsp305310315320AsnGlyIleAspLeuProThrTyrArgAspValValLeuLysArgPhe325330335ThrAsnProHisIleGlnAspThrAsnGlnArgValAlaAlaAspGly340345350PheSerLysIleProAlaMetIleAlaProThrLeuArgGluCysTyr355360365GlnArgGlyValArgProAsnAlaThrAlaMetLeuProAlaLeuPhe370375380TyrValPheMetGluGlnTrpHisHisGlyLysLeuProTyrGluTyr385390395400GlnAspGlyIleLeuAspAlaProAlaValHisAlaMetLeuGlnSer405410415AlaAspProValAlaValTyrAlaSerAspLysAlaLeuPheGlyAsp420425430LeuThrGluArgGluAspPheAlaAlaLeuLeuArgGluLysIleAla435440445AspValTyrAlaLeuIleAsn450455<210>3<211>1368<212>DNA<213>人工序列<220><223>NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶編碼序列<400>3atgaacgagcagttcacctggttgcacatcggtttgggttctttccacagagctcaccag60gcttggtacttgcacagattgcaggttatgggtgacaagagatggtctatcgctgctggt120aacatcagaaacgacgctgagcacgttgttcaggctttgtctgctcagaagggtagatac180gttttggagaccgtttctccagagggtgtttctgagtacgaggagatcacctctatccag240aagttgatcccatggcaggctgacttgcagccattgatcgctgagggtgctgacccaaag300accaaggttatcgctttcaccgttaccgagggtggttactacttgaacacctctcacaag360ttggaggttaacaacccagacttggctgctgacttgaagggtggttgtaagaccatctac420ggtgttatcaccagaatcttggaggctagaatggctaacaacgctggtccattgaccttg480ttgaactgtgacaacgttagacacaacggtgagagattccacgacggtttggttgagttc540ttgcagttgaccggtaagcaggacgttatcgactggttgtctaccaacaccacctgtcca600aacaccatggttgacagaatcaccccaagaccagctgctgagttgccagctagaatcaag660gctcagaccggtatcgctgacaaggctccagttatgggtgagaccttcatccagtgggtt720gttgaggacaacttcagagacgttagaccagctttggagaaggttggtgttgagttggtt780gcttctgttatcccatacgaggaggctaagatcagaatcttgaactcttctcactcttgt840atcgcttgggctggtaccttgatcggtcagaagtacatccacgagtctaccatgaccgac900ttcatctaccagatcgctgacagatacgttaccgaggacgttatcccatgtttgggtgac960aacggtatcgacttgccaacctacagagacgttgttttgaagagattcaccaacccacac1020atccaggacaccaaccagagagttgctgctgacggtttctctaagatcccagctatgatc1080gctccaaccttgagagagtgttaccagagaggtgttagaccaaacgctaccgctatgttg1140ccagctttgttctacgttttcatggagcagtggcaccacggtaagttgccatacgagtac1200caggacggtatcttggacgctccagctgttcacgctatgttgcagtctgctgacccagtt1260gctgtttacgcttctgacaaggctttgttcggtgacttgaccgagagagaggacttcgct1320gctttgttgagagagaagatcgctgacgtttacgctttgatcaactaa1368<210>4<211>1107<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的側(cè)翼為限制位點(diǎn)的序列<220><221>尚未歸類的特征<222>(1)..(6)<223>HindIII識(shí)別位點(diǎn)<220><221>CDS<222>(10)..(1101)<220><221>尚未歸類的特征<222>(1102)..(1107)<223>SacII識(shí)別位點(diǎn)<400>4aagcttaaaatgactgctaacccttccttggtgttgaacaagatcgacgac51MetThrAlaAsnProSerLeuValLeuAsnLysIleAspAsp1510atttcgttcgaaacttacgatgccccagaaatctctgaacctaccgat99IleSerPheGluThrTyrAspAlaProGluIleSerGluProThrAsp15202530gtcctcgtccaggtcaagaaaaccggtatctgtggttccgacatccac147ValLeuValGlnValLysLysThrGlyIleCysGlySerAspIleHis354045ttctacgcccatggtagaatcggtaacttcgttttgaccaagccaatg195PheTyrAlaHisGlyArgIleGlyAsnPheValLeuThrLysProMet505560gtcttgggtcacgaatccgccggtactgttgtccaggttggtaagggt243ValLeuGlyHisGluSerAlaGlyThrValValGlnValGlyLysGly657075gtcacctctcttaaggttggtgacaacgtcgctatcgaaccaggtatt291ValThrSerLeuLysValGlyAspAsnValAlaIleGluProGlyIle808590ccatccagattctccgacgaatacaagagcggtcactacaacttgtgt339ProSerArgPheSerAspGluTyrLysSerGlyHisTyrAsnLeuCys95100105110cctcacatggccttcgccgctactcctaactccaaggaaggcgaacca387ProHisMetAlaPheAlaAlaThrProAsnSerLysGluGlyGluPro115120125aacccaccaggtaccttatgtaagtacttcaagtcgccagaagacttc435AsnProProGlyThrLeuCysLysTyrPheLysSerProGluAspPhe130135140ttggtcaagttgccagaccacgtcagcttggaactcggtgctcttgtt483LeuValLysLeuProAspHisValSerLeuGluLeuGlyAlaLeuVal145150155gagccattgtctgttggtgtccacgcctccaagttgggttccgttgct531GluProLeuSerValGlyValHisAlaSerLysLeuGlySerValAla160165170ttcggcgactacgttgccgtctttggtgctggtcctgttggtcttttg579PheGlyAspTyrValAlaValPheGlyAlaGlyProValGlyLeuLeu175180185190gctgctgctgtcgccaagaccttcggtgctaagggtgtcatcgtcgtt627AlaAlaAlaValAlaLysThrPheGlyAlaLysGlyValIleValVal195200205gctagatcagacagaaagttgaagatggccaaggacattggtgctgct675AlaArgSerAspArgLysLeuLysMetAlaLysAspIleGlyAlaAla210215220actcacaccttcaactccaagaccggtggttctgaagaattgatcaag723ThrHisThrPheAsnSerLysThrGlyGlySerGluGluLeuIleLys225230235gctttcggtggtaacgtgccaaacgtcgttttggaatgtactggtgct771AlaPheGlyGlyAsnValProAsnValValLeuGluCysThrGlyAla240245250gaaccttgtatcaagttgggtgttgacgccattgccccaggtggtcgt819GluProCysIleLysLeuGlyValAspAlaIleAlaProGlyGlyArg255260265270ttcgttcaagttggtaacgctgctggtccagtcagcttcccaatcacc867PheValGlnValGlyAsnAlaAlaGlyProValSerPheProIleThr275280285gttttcgccatgaaggaattgactttgttcggttctttcagatacgga915ValPheAlaMetLysGluLeuThrLeuPheGlySerPheArgTyrGly290295300ttcaacgactacaagactgctgttggaatctttgacactaactaccaa963PheAsnAspTyrLysThrAlaValGlyIlePheAspThrAsnTyrGln305310315aacggtagagaaaatgctccaattgactttgaacaattgatcacccac1011AsnGlyArgGluAsnAlaProIleAspPheGluGlnLeuIleThrHis320325330agatacaagttcaaggacgctattgaagcctacgacttggtcagagcc1059ArgTyrLysPheLysAspAlaIleGluAlaTyrAspLeuValArgAla335340345350ggtaagggtgctgtcaagtgtctcattgacggccctgagtaaccgcgg1107GlyLysGlyAlaValLysCysLeuIleAspGlyProGlu355360<210>5<211>363<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>5MetThrAlaAsnProSerLeuValLeuAsnLysIleAspAspIleSer151015PheGluThrTyrAspAlaProGluIleSerGluProThrAspValLeu202530ValGlnValLysLysThrGlyIleCysGlySerAspIleHisPheTyr354045AlaHisGlyArgIleGlyAsnPheValLeuThrLysProMetValLeu505560GlyHisGluSerAlaGlyThrValValGlnValGlyLysGlyValThr65707580SerLeuLysValGlyAspAsnValAlaIleGluProGlyIleProSer859095ArgPheSerAspGluTyrLysSerGlyHisTyrAsnLeuCysProHis100105110MetAlaPheAlaAlaThrProAsnSerLysGluGlyGluProAsnPro115120125ProGlyThrLeuCysLysTyrPheLysSerProGluAspPheLeuVal130135140LysLeuProAspHisValSerLeuGluLeuGlyAlaLeuValGluPro145150155160LeuSerValGlyValHisAlaSerLysLeuGlySerValAlaPheGly165170175AspTyrValAlaValPheGlyAlaGlyProValGlyLeuLeuAlaAla180185190AlaValAlaLysThrPheGlyAlaLysGlyValIleValValAlaArg195200205SerAspArgLysLeuLysMetAlaLysAspIleGlyAlaAlaThrHis210215220ThrPheAsnSerLysThrGlyGlySerGluGluLeuIleLysAlaPhe225230235240GlyGlyAsnValProAsnValValLeuGluCysThrGlyAlaGluPro245250255CysIleLysLeuGlyValAspAlaIleAlaProGlyGlyArgPheVal260265270GlnValGlyAsnAlaAlaGlyProValSerPheProIleThrValPhe275280285AlaMetLysGluLeuThrLeuPheGlySerPheArgTyrGlyPheAsn290295300AspTyrLysThrAlaValGlyIlePheAspThrAsnTyrGlnAsnGly305310315320ArgGluAsnAlaProIleAspPheGluGlnLeuIleThrHisArgTyr325330335LysPheLysAspAlaIleGluAlaTyrAspLeuValArgAlaGlyLys340345350GlyAlaValLysCysLeuIleAspGlyProGlu355360<210>6<211>1092<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的序列<400>6atgactgctaacccttccttggtgttgaacaagatcgacgacatttcgttcgaaacttac60gatgccccagaaatctctgaacctaccgatgtcctcgtccaggtcaagaaaaccggtatc120tgtggttccgacatccacttctacgcccatggtagaatcggtaacttcgttttgaccaag180ccaatggtcttgggtcacgaatccgccggtactgttgtccaggttggtaagggtgtcacc240tctcttaaggttggtgacaacgtcgctatcgaaccaggtattccatccagattctccgac300gaatacaagagcggtcactacaacttgtgtcctcacatggccttcgccgctactcctaac360tccaaggaaggcgaaccaaacccaccaggtaccttatgtaagtacttcaagtcgccagaa420gacttcttggtcaagttgccagaccacgtcagcttggaactcggtgctcttgttgagcca480ttgtctgttggtgtccacgcctccaagttgggttccgttgctttcggcgactacgttgcc540gtctttggtgctggtcctgttggtcttttggctgctgctgtcgccaagaccttcggtgct600aagggtgtcatcgtcgttgctagatcagacagaaagttgaagatggccaaggacattggt660gctgctactcacaccttcaactccaagaccggtggttctgaagaattgatcaaggctttc720ggtggtaacgtgccaaacgtcgttttggaatgtactggtgctgaaccttgtatcaagttg780ggtgttgacgccattgccccaggtggtcgtttcgttcaagttggtaacgctgctggtcca840gtcagcttcccaatcaccgttttcgccatgaaggaattgactttgttcggttctttcaga900tacggattcaacgactacaagactgctgttggaatctttgacactaactaccaaaacggt960agagaaaatgctccaattgactttgaacaattgatcacccacagatacaagttcaaggac1020gctattgaagcctacgacttggtcagagccggtaagggtgctgtcaagtgtctcattgac1080ggccctgagtaa1092<210>7<211>806<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的側(cè)翼為限制位點(diǎn)的序列<220><221>尚未歸類的特征<222>(1)..(8)<223>AscI識(shí)別位點(diǎn)<220><221>CDS<222>(12)..(800)<220><221>尚未歸類的特征<222>(801)..(806)<223>SphI識(shí)別位點(diǎn)<400>7ggcgcgccaaaatgtctaagaagttcaacggtaaggtttgtttggttacc50MetSerLysLysPheAsnGlyLysValCysLeuValThr1510ggtgctggtggtaacatcggtttggctaccgctttgagattggctgag98GlyAlaGlyGlyAsnIleGlyLeuAlaThrAlaLeuArgLeuAlaGlu152025gagggtaccgctatcgctttgttgtctagaaacagagaggctttggag146GluGlyThrAlaIleAlaLeuLeuSerArgAsnArgGluAlaLeuGlu30354045aaggctgaggcttctgttagagagaagggtgttgaggctagatcttac194LysAlaGluAlaSerValArgGluLysGlyValGluAlaArgSerTyr505560gtttgtgacgttacctctgaggaggctgttatcggtaccgttgactct242ValCysAspValThrSerGluGluAlaValIleGlyThrValAspSer657075gttgttagagacttcggtaagatcgacttcttgttcaacaacgctggt290ValValArgAspPheGlyLysIleAspPheLeuPheAsnAsnAlaGly808590taccagggtgctttcgctccagttcaggactacccatctgacgacttc338TyrGlnGlyAlaPheAlaProValGlnAspTyrProSerAspAspPhe95100105gctagagttttgaccatcaacgttaccggtgctttccacgttttgaag386AlaArgValLeuThrIleAsnValThrGlyAlaPheHisValLeuLys110115120125gctgtttctagacagatgatcacccagaactacggtagaatcgttaac434AlaValSerArgGlnMetIleThrGlnAsnTyrGlyArgIleValAsn130135140accgcttctatggctggtgttaagggtccaccaaacatggctgcttac482ThrAlaSerMetAlaGlyValLysGlyProProAsnMetAlaAlaTyr145150155ggtacctctaagggtgctatcatcgctttgaccgagaccgctgctttg530GlyThrSerLysGlyAlaIleIleAlaLeuThrGluThrAlaAlaLeu160165170gacttggctccatacaacatcagagttaacgctatctctccaggttac578AspLeuAlaProTyrAsnIleArgValAsnAlaIleSerProGlyTyr175180185atgggtccaggtttcatgtgggagagacaggttgagttgcaggctaag626MetGlyProGlyPheMetTrpGluArgGlnValGluLeuGlnAlaLys190195200205gttggttctcagtacttctctaccgacccaaaggttgttgctcagcag674ValGlySerGlnTyrPheSerThrAspProLysValValAlaGlnGln210215220atgatcggttctgttccaatgagaagatacggtgacatcaacgagatc722MetIleGlySerValProMetArgArgTyrGlyAspIleAsnGluIle225230235ccaggtgttgttgctttcttgttgggtgacgactcttctttcatgacc770ProGlyValValAlaPheLeuLeuGlyAspAspSerSerPheMetThr240245250ggtgttaacttgccaatcgctggtggttgagcatgc806GlyValAsnLeuProIleAlaGlyGly255260<210>8<211>262<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>8MetSerLysLysPheAsnGlyLysValCysLeuValThrGlyAlaGly151015GlyAsnIleGlyLeuAlaThrAlaLeuArgLeuAlaGluGluGlyThr202530AlaIleAlaLeuLeuSerArgAsnArgGluAlaLeuGluLysAlaGlu354045AlaSerValArgGluLysGlyValGluAlaArgSerTyrValCysAsp505560ValThrSerGluGluAlaValIleGlyThrValAspSerValValArg65707580AspPheGlyLysIleAspPheLeuPheAsnAsnAlaGlyTyrGlnGly859095AlaPheAlaProValGlnAspTyrProSerAspAspPheAlaArgVal100105110LeuThrIleAsnValThrGlyAlaPheHisValLeuLysAlaValSer115120125ArgGlnMetIleThrGlnAsnTyrGlyArgIleValAsnThrAlaSer130135140MetAlaGlyValLysGlyProProAsnMetAlaAlaTyrGlyThrSer145150155160LysGlyAlaIleIleAlaLeuThrGluThrAlaAlaLeuAspLeuAla165170175ProTyrAsnIleArgValAsnAlaIleSerProGlyTyrMetGlyPro180185190GlyPheMetTrpGluArgGlnValGluLeuGlnAlaLysValGlySer195200205GlnTyrPheSerThrAspProLysValValAlaGlnGlnMetIleGly210215220SerValProMetArgArgTyrGlyAspIleAsnGluIleProGlyVal225230235240ValAlaPheLeuLeuGlyAspAspSerSerPheMetThrGlyValAsn245250255LeuProIleAlaGlyGly260<210>9<211>789<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼NADPH特異性木糖醇脫氫酶的序列<400>9atgtctaagaagttcaacggtaaggtttgtttggttaccggtgctggtggtaacatcggt60ttggctaccgctttgagattggctgaggagggtaccgctatcgctttgttgtctagaaac120agagaggctttggagaaggctgaggcttctgttagagagaagggtgttgaggctagatct180tacgtttgtgacgttacctctgaggaggctgttatcggtaccgttgactctgttgttaga240gacttcggtaagatcgacttcttgttcaacaacgctggttaccagggtgctttcgctcca300gttcaggactacccatctgacgacttcgctagagttttgaccatcaacgttaccggtgct360ttccacgttttgaaggctgtttctagacagatgatcacccagaactacggtagaatcgtt420aacaccgcttctatggctggtgttaagggtccaccaaacatggctgcttacggtacctct480aagggtgctatcatcgctttgaccgagaccgctgctttggacttggctccatacaacatc540agagttaacgctatctctccaggttacatgggtccaggtttcatgtgggagagacaggtt600gagttgcaggctaaggttggttctcagtacttctctaccgacccaaaggttgttgctcag660cagatgatcggttctgttccaatgagaagatacggtgacatcaacgagatcccaggtgtt720gttgctttcttgttgggtgacgactcttctttcatgaccggtgttaacttgccaatcgct780ggtggttga789<210>10<211>873<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的序列<220><221>CDS<222>(1)..(873)<400>10atgaacaaagttggcatgttctacacctactggtcgactgagtggatg48MetAsnLysValGlyMetPheTyrThrTyrTrpSerThrGluTrpMet151015gtcgactttccggcgactgcgaagcgcattgccgggctcggcttcgac96ValAspPheProAlaThrAlaLysArgIleAlaGlyLeuGlyPheAsp202530ttaatggaaatctcgctcggcgagtttcacaatctttccgacgcgaag144LeuMetGluIleSerLeuGlyGluPheHisAsnLeuSerAspAlaLys354045aagcgtgagctaaaagccgtggctgatgatctggggctcacggtgatg192LysArgGluLeuLysAlaValAlaAspAspLeuGlyLeuThrValMet505560tgctgtatcggactgaagtctgagtacgactttgcctcgccggacaag240CysCysIleGlyLeuLysSerGluTyrAspPheAlaSerProAspLys65707580agcgttcgtgatgccggcacggaatatgtgaagcgcttgctcgacgac288SerValArgAspAlaGlyThrGluTyrValLysArgLeuLeuAspAsp859095tgtcacctcctcggtgcgccggtctttgctggccttacgttctgcgcg336CysHisLeuLeuGlyAlaProValPheAlaGlyLeuThrPheCysAla100105110tggccccaatctccgccgctggacatgaaggataagcgcccttacgtc384TrpProGlnSerProProLeuAspMetLysAspLysArgProTyrVal115120125gaccgtgcaatcgaaagcgttcgtcgtgttatcaaggtagctgaagac432AspArgAlaIleGluSerValArgArgValIleLysValAlaGluAsp130135140tacggcattatttatgcactggaagtggtgaaccgattcgagcagtgg480TyrGlyIleIleTyrAlaLeuGluValValAsnArgPheGluGlnTrp145150155160ctttgcaatgacgccaaggaagcaattgcgtttgccgacgcggttgac528LeuCysAsnAspAlaLysGluAlaIleAlaPheAlaAspAlaValAsp165170175agtccggcgtgcaaggtccagctcgacacattccacatgaatatcgaa576SerProAlaCysLysValGlnLeuAspThrPheHisMetAsnIleGlu180185190gagacttccttccgcgatgcaatccttgcctgcaagggcaagatgggc624GluThrSerPheArgAspAlaIleLeuAlaCysLysGlyLysMetGly195200205catttccatttgggcgaagcgaaccgtctgccgccgggcgagggtcgc672HisPheHisLeuGlyGluAlaAsnArgLeuProProGlyGluGlyArg210215220ctgccgtgggatgaaatattcggggcgctgaaggaaatcggatatgac720LeuProTrpAspGluIlePheGlyAlaLeuLysGluIleGlyTyrAsp225230235240ggcaccatcgttatggaaccgttcatgcgcaagggcggctcggtcagc768GlyThrIleValMetGluProPheMetArgLysGlyGlySerValSer245250255cgcgcggtgggcgtatggcgggatatgtcgaacggtgcgacggacgaa816ArgAlaValGlyValTrpArgAspMetSerAsnGlyAlaThrAspGlu260265270gagatggacgagcgcgctcgccgctcgttgcagtttgttcgtgacaag864GluMetAspGluArgAlaArgArgSerLeuGlnPheValArgAspLys275280285ctggcctga873LeuAla290<210>11<211>290<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>11MetAsnLysValGlyMetPheTyrThrTyrTrpSerThrGluTrpMet151015ValAspPheProAlaThrAlaLysArgIleAlaGlyLeuGlyPheAsp202530LeuMetGluIleSerLeuGlyGluPheHisAsnLeuSerAspAlaLys354045LysArgGluLeuLysAlaValAlaAspAspLeuGlyLeuThrValMet505560CysCysIleGlyLeuLysSerGluTyrAspPheAlaSerProAspLys65707580SerValArgAspAlaGlyThrGluTyrValLysArgLeuLeuAspAsp859095CysHisLeuLeuGlyAlaProValPheAlaGlyLeuThrPheCysAla100105110TrpProGlnSerProProLeuAspMetLysAspLysArgProTyrVal115120125AspArgAlaIleGluSerValArgArgValIleLysValAlaGluAsp130135140TyrGlyIleIleTyrAlaLeuGluValValAsnArgPheGluGlnTrp145150155160LeuCysAsnAspAlaLysGluAlaIleAlaPheAlaAspAlaValAsp165170175SerProAlaCysLysValGlnLeuAspThrPheHisMetAsnIleGlu180185190GluThrSerPheArgAspAlaIleLeuAlaCysLysGlyLysMetGly195200205HisPheHisLeuGlyGluAlaAsnArgLeuProProGlyGluGlyArg210215220LeuProTrpAspGluIlePheGlyAlaLeuLysGluIleGlyTyrAsp225230235240GlyThrIleValMetGluProPheMetArgLysGlyGlySerValSer245250255ArgAlaValGlyValTrpArgAspMetSerAsnGlyAlaThrAspGlu260265270GluMetAspGluArgAlaArgArgSerLeuGlnPheValArgAspLys275280285LeuAla290<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gaactagtggatccgtagaaatcttg26<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13ctttgttcattttggcgcgccttttagtttaataagggtccgtg44<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14aaactaaaaggcgcgccaaaatgaacaaagttggcatg38<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15ttctcttcgagagcatgctcaggccagcttgtcacg36<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16aagctggcctgagcatgctctcgaagagaatctag35<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17gttccgcggagaatgacacggccgac26<210>18<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18aaggcgcgccaaaatgactgctaacccttcc31<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19gagcatgcttactcagggccgtcaatg27<210>20<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20gaagactagttcacgtgatctc22<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21cactggcgcgccttttgtgtggtggtgtcc30<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22tagcagcatgcataggttagtgaatgaggtatg33<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23taggtccgcgggagcttcgttaaagggc28<210>24<211>116<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24cactggcgcgcccactgcatgcgtcgacaacccttaatataacttcgtataatgtatgct60atacgaagttattaggtctagacacatcgtggatccaagctatcaacgagagagtc116<210>25<211>105<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25agtggctagcagtgccatggcctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatat60taagggttctcgagacgcgtcatctagcatctcatctaccaactc105<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26cactctgcagcactggcgcgcccactgcat30<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27cactgatatcagtggctagcagtgccatgg30<210>28<211>590<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼諾爾斯鏈霉菌的nat1基因的序列<400>28ggcgcgccaaaatgggtaccactttggacgacactgcttacagatacagaacctctgtcc60caggtgacgccgaggccatcgaggctttggatggttccttcaccaccgacaccgtcttca120gagtcaccgccaccggtgacggtttcaccttgagagaggttccagttgacccacctttga180ccaaggttttcccagacgacgaatctgacgacgaatctgacgacggtgaggacggtgacc240cagactccagaactttcgtcgcctacggtgacgacggtgacttggctggtttcgttgtcg300tctcttactccggttggaacagaagattgaccgtcgaggacatcgaggtcgccccagagc360acagaggtcacggtgtcggtagagctttgatgggtttggctactgagttcgccagagaga420gaggtgccggtcacttgtggttggaggtcaccaacgtcaacgctccagctatccacgctt480acagaagaatgggtttcaccttgtgtggtttggacaccgccttgtacgacggtaccgcct540ccgacggtgagcaggctttgtacatgtccatgccatgtccataagcatgc590<210>29<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29caagcatgcgggaatgataagagactttg29<210>30<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30ggaccgcggaaaggtgaggaagtatatgaac31<210>31<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>31cacttctagacactatcgatggatccgtagaaatcttg38<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>32cactacgcgtaaaggtgaggaagtatatg29<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>33cactctgcaggatccaagctatcaacgaga30<210>34<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>34cactgcatgcgttgcggaaaaaacagcc28<210>35<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>35cactccatggagtaggtatataaaaatataagag34<210>36<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>36cactgctagcgtcgacaacagcaactag28<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>37caagtcgtggagattctgc19<210>38<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>38caaggcgcgccaaaatgtctaccaaaaccattac34<210>39<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>39ggagcatgcctactttccctcagccaag28<210>40<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>40atatcccgggcaccgtcatcaccgaaacgc30<210>41<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>41atatcccgggcacgaccacgctgatgagc29<210>42<211>1415<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼來自青枯雷爾氏菌的NAD+特異性D-阿糖醇4-氧化還原酶的序列<220><221>CDS<222>(12)..(1409)<400>42ggcgcgccaaaatgaccagatcttctttggctagagctccagttttgttg50MetThrArgSerSerLeuAlaArgAlaProValLeuLeu1510cacatcggtgctggttctttccacagagctcaccaggcttggtacttg98HisIleGlyAlaGlySerPheHisArgAlaHisGlnAlaTrpTyrLeu152025cacagagttaacgctgctgttccaccaggtgagagatggaccttgacc146HisArgValAsnAlaAlaValProProGlyGluArgTrpThrLeuThr30354045gttggtaacatcagagacgacatgcacgctaccttggctgctttggct194ValGlyAsnIleArgAspAspMetHisAlaThrLeuAlaAlaLeuAla505560gctcagcagggtgcttacaccttggagaccgttaccccacagggtgag242AlaGlnGlnGlyAlaTyrThrLeuGluThrValThrProGlnGlyGlu657075agagcttacgagaccatcagatctatcgctagagttttgccttggtct290ArgAlaTyrGluThrIleArgSerIleAlaArgValLeuProTrpSer808590gctgacttggctgctttgatcaacaccggtgctgacccagcttgtaga338AlaAspLeuAlaAlaLeuIleAsnThrGlyAlaAspProAlaCysArg95100105atcgtttctttcaccgttaccgagggtggttactacttggacgagcac386IleValSerPheThrValThrGluGlyGlyTyrTyrLeuAspGluHis110115120125gacagattggacgttacccacccagacttggctgctgacttgagaggt434AspArgLeuAspValThrHisProAspLeuAlaAlaAspLeuArgGly130135140gctagatctaccttgtacggtgctttggctgctttgttggctgagaga482AlaArgSerThrLeuTyrGlyAlaLeuAlaAlaLeuLeuAlaGluArg145150155agacagagaggtgctggtccattgaccttgcagtcttgtgacaacttg530ArgGlnArgGlyAlaGlyProLeuThrLeuGlnSerCysAspAsnLeu160165170agatctaacggtgctagattcagagctggtatgagagctttcttggct578ArgSerAsnGlyAlaArgPheArgAlaGlyMetArgAlaPheLeuAla175180185ttgagaggtgacgctgctttgttggcttggttcgacgctaacgtttct626LeuArgGlyAspAlaAlaLeuLeuAlaTrpPheAspAlaAsnValSer190195200205tgtccatctgctatggttgacagaatcaccccaagaccaaccgacgac674CysProSerAlaMetValAspArgIleThrProArgProThrAspAsp210215220gttagaaccagagttcacgctgctaccggtgttgacgacagatgtcca722ValArgThrArgValHisAlaAlaThrGlyValAspAspArgCysPro225230235gttatgggtgagtctttcatccagtgggttatcgaggacaacttcatc770ValMetGlyGluSerPheIleGlnTrpValIleGluAspAsnPheIle240245250gctggtagaccagcttgggagatcgctggtgctgagatcgttgctgac818AlaGlyArgProAlaTrpGluIleAlaGlyAlaGluIleValAlaAsp255260265gttcacccatacgaggaggctaagatcagaatcttgaacgctacccac866ValHisProTyrGluGluAlaLysIleArgIleLeuAsnAlaThrHis270275280285tcttgtatcgcttgggctggtaccttggctggtttgacctacatccac914SerCysIleAlaTrpAlaGlyThrLeuAlaGlyLeuThrTyrIleHis290295300gagggtatgagagacgctgctatctacagattcgcttacgactacgtt962GluGlyMetArgAspAlaAlaIleTyrArgPheAlaTyrAspTyrVal305310315accgacgacgttatcccatgtttgaccccatctccattggacttggag1010ThrAspAspValIleProCysLeuThrProSerProLeuAspLeuGlu320325330agatacagagacgttgttttggagagattcggtaacccatacgttttg1058ArgTyrArgAspValValLeuGluArgPheGlyAsnProTyrValLeu335340345gacaccaaccagagagttgctgctgacggtttctctaagatcccaggt1106AspThrAsnGlnArgValAlaAlaAspGlyPheSerLysIleProGly350355360365ttcatcgctccaaccttggctgagtgtttcgctagaggtgctgaccca1154PheIleAlaProThrLeuAlaGluCysPheAlaArgGlyAlaAspPro370375380gttgctaccgctgttttgccagctttgttcttgggtttcttggagggt1202ValAlaThrAlaValLeuProAlaLeuPheLeuGlyPheLeuGluGly385390395tgggctagaggtaccttgccatacgtttaccaggacggtgttatggac1250TrpAlaArgGlyThrLeuProTyrValTyrGlnAspGlyValMetAsp400405410ggtgctgctgctagatctatcgttgaggctccagactctgttgctgct1298GlyAlaAlaAlaArgSerIleValGluAlaProAspSerValAlaAla415420425ttctgttctgacagacagttgtggggttctttggctggtagagacgct1346PheCysSerAspArgGlnLeuTrpGlySerLeuAlaGlyArgAspAla430435440445ttggttcaggctgttagagctggtagagctagagttgaggcttggaga1394LeuValGlnAlaValArgAlaGlyArgAlaArgValGluAlaTrpArg450455460gctgctagaagatgagcatgc1415AlaAlaArgArg465<210>43<211>465<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>43MetThrArgSerSerLeuAlaArgAlaProValLeuLeuHisIleGly151015AlaGlySerPheHisArgAlaHisGlnAlaTrpTyrLeuHisArgVal202530AsnAlaAlaValProProGlyGluArgTrpThrLeuThrValGlyAsn354045IleArgAspAspMetHisAlaThrLeuAlaAlaLeuAlaAlaGlnGln505560GlyAlaTyrThrLeuGluThrValThrProGlnGlyGluArgAlaTyr65707580GluThrIleArgSerIleAlaArgValLeuProTrpSerAlaAspLeu859095AlaAlaLeuIleAsnThrGlyAlaAspProAlaCysArgIleValSer100105110PheThrValThrGluGlyGlyTyrTyrLeuAspGluHisAspArgLeu115120125AspValThrHisProAspLeuAlaAlaAspLeuArgGlyAlaArgSer130135140ThrLeuTyrGlyAlaLeuAlaAlaLeuLeuAlaGluArgArgGlnArg145150155160GlyAlaGlyProLeuThrLeuGlnSerCysAspAsnLeuArgSerAsn165170175GlyAlaArgPheArgAlaGlyMetArgAlaPheLeuAlaLeuArgGly180185190AspAlaAlaLeuLeuAlaTrpPheAspAlaAsnValSerCysProSer195200205AlaMetValAspArgIleThrProArgProThrAspAspValArgThr210215220ArgValHisAlaAlaThrGlyValAspAspArgCysProValMetGly225230235240GluSerPheIleGlnTrpValIleGluAspAsnPheIleAlaGlyArg245250255ProAlaTrpGluIleAlaGlyAlaGluIleValAlaAspValHisPro260265270TyrGluGluAlaLysIleArgIleLeuAsnAlaThrHisSerCysIle275280285AlaTrpAlaGlyThrLeuAlaGlyLeuThrTyrIleHisGluGlyMet290295300ArgAspAlaAlaIleTyrArgPheAlaTyrAspTyrValThrAspAsp305310315320ValIleProCysLeuThrProSerProLeuAspLeuGluArgTyrArg325330335AspValValLeuGluArgPheGlyAsnProTyrValLeuAspThrAsn340345350GlnArgValAlaAlaAspGlyPheSerLysIleProGlyPheIleAla355360365ProThrLeuAlaGluCysPheAlaArgGlyAlaAspProValAlaThr370375380AlaValLeuProAlaLeuPheLeuGlyPheLeuGluGlyTrpAlaArg385390395400GlyThrLeuProTyrValTyrGlnAspGlyValMetAspGlyAlaAla405410415AlaArgSerIleValGluAlaProAspSerValAlaAlaPheCysSer420425430AspArgGlnLeuTrpGlySerLeuAlaGlyArgAspAlaLeuValGln435440445AlaValArgAlaGlyArgAlaArgValGluAlaTrpArgAlaAlaArg450455460Arg465當(dāng)前第1頁1 2 3