用于鑒定患者特定驅(qū)動突變物的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】用于鑒定患者特定驅(qū)動突變物的方法和系統(tǒng) 發(fā)明領域
[0001] 提供了用于鑒定患者特定驅(qū)動突變物（driver mutation)的方法。所提供的方法 在癌癥患者的生物樣品中鑒定特定患者來源的與異常信號轉(zhuǎn)導通路相關的標志物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 取決于根本的分子機制的準確診斷以及全部驅(qū)動突變物的鑒定和自分泌及旁分 泌作用，被診斷為患各種疾病狀況，諸如癌癥的患者的臨床治療方案和預后可極為不同。此 外，可能表型上（病理上）相似的許多疾病可具有非常不同的潛在病因。例如，癌癥是極為 多樣性的；因此，準確診斷和分級治療方法對于有效的治療至關重要。在被診斷為患癌癥的 患者中，許多控制細胞生長和分化之間，特別是細胞增殖和細胞死亡之間的平衡的信號轉(zhuǎn) 導通路以異常的方式被調(diào)控。這些通路中的許多通路的激活是由稱為"驅(qū)動突變物"的關 鍵蛋白中的突變的積累引起的，驅(qū)動突變物或由腫瘤細胞或基質(zhì)細胞分泌的生長因子和細 胞因子及腫瘤質(zhì)膜上激活這些信號轉(zhuǎn)導通路的受體的再激活引起的。這些突變覆蓋大量的 程序，但全都具有賦予細胞癌變活性的能力。因此，用特異性的抑制性藥物靶向此類驅(qū)動突 變物（"靶向治療"）是癌癥治療的主要目標。例如，肺癌可能具有各自需要不同的治療方 法的許多潛在的參與因子（例如EGFR突變和ALK-ELM4易位）。同樣地，乳腺癌的治療受潛 在的分子特征譜（諸如ER/PR的表達或HER2的擴增）指令。不同通路之間的相互作用是 非常復雜的并且是腫瘤特異性的，并且在大多數(shù)病例中是患者特異性的。需要對患者特異 性的腫瘤潛在信號機制的充分理解以確定靶向治療藥物的最佳組合，所述靶向治療藥物可 能通過中斷異常信號轉(zhuǎn)導通路來抑制細胞分裂并誘導細胞死亡而起效。腫瘤在個體間的異 質(zhì)性（基因多態(tài)性）對藥物效力以及不希望的脫靶副作用的可能性和最終的存活率具有深 遠的影響。
[0004] 在人類的約320個已知的信號轉(zhuǎn)導通路中，約50個信號轉(zhuǎn)導通路直接或間接地參 與腫瘤生長和進展。對這樣的平臺的需要未被滿足，所述平臺使得通過在活的受試細胞中 監(jiān)測各種信號轉(zhuǎn)導蛋白（諸如，例如，膜定位和/或細胞內(nèi)受體及信號轉(zhuǎn)導蛋白）的激活而 確立患者腫瘤的激活的信號轉(zhuǎn)導通路的特征成為可能。
[0005] 癌癥的復雜性和異質(zhì)性要求更靈敏和識別能力更強的診斷方法，所述診斷方法以 定性和定量的方式映射腫瘤信號轉(zhuǎn)導通路并使得分級治療的精準選擇成為可能。目前的技 術(shù)狀態(tài)是，極少的單個標志物可用于預測藥物的效力和毒性。此外，由于腫瘤內(nèi)積累的大量 突變和有限的已鑒定的驅(qū)動突變物的庫（repertoire)，用于選擇靶向治療的全基因組測序 (下一代測序）的適用性受到限制。此外，全基因組測序沒有揭示出自分泌和旁分泌刺激， 它們是腫瘤增殖的主要驅(qū)動因素。
[0006]因此，本領域存在對為患者提供特異性診斷平臺的方法和系統(tǒng)的未被滿足的 需要，所述診斷平臺是有成本和時間效益的，并且具有基于患者特定驅(qū)動突變物和自分 泌-旁分泌突變的異?；钚远鴮ｉT識別這些驅(qū)動突變物突變的能力，并因此可預測特異 性、個性化和優(yōu)化的治療。
[0007]發(fā)明概沐
[0008] 本發(fā)明提供了，通過鑒定受試細胞中信號轉(zhuǎn)導通路活性的改變鑒定患者特定驅(qū)動 突變物的方法和系統(tǒng)，所述信號轉(zhuǎn)導通路活性的改變與驅(qū)動突變物的功能相關。根據(jù)一些 實施方案，信號轉(zhuǎn)導通路活性的改變通過鑒定與驅(qū)動突變物的功能相關的報告物基因的亞 細胞定位的變化來確定。在一些實施方案中，從生物樣品中獲得特定患者來源的標志物 (PDM)的基因，并在活的受試細胞中測試它們對相應熒光易位報告物（FTR)基因的亞細胞 易位的影響以確定所測試的PDM是否突變。在一些實施方案中，獲得特定患者來源的標志 物并將其融合至熒光報告物以創(chuàng)建患者來源的報告物（PDR)，其中在活的受試細胞中測試 PDR的亞細胞易位以確定所測試的PDR是否突變。
[0009] 本文公開的方法和系統(tǒng)通常還允許確定與疾病相關的細胞內(nèi)通路以及受到異常 影響的信號轉(zhuǎn)導通路的特定組分。本文公開的方法和系統(tǒng)提供的分析還允許確定和/或調(diào) 整適應對由此鑒定的患者特定驅(qū)動突變物的最佳個性化治療。
[0010] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于確定參與癌癥的患者特定驅(qū)動突變物的方 法和系統(tǒng)。在一些實施方案中，驅(qū)動突變物是致癌性驅(qū)動突變物。在一些實施方案中，所述 方法和系統(tǒng)提供了測試各種旁分泌和自分泌因子對特定癌癥及其進展的影響的預測平臺。 在一些實施方案中，所述方法和系統(tǒng)提供了確定所測試的藥物或藥物組合對患者的特定細 胞通路的影響的預測平臺。在一些實施方案中，所述方法和系統(tǒng)提供了確定特別適合患者 的優(yōu)化治療的預測平臺。在一些實施方案中，本文所公開的方法能夠確定自分泌和旁分泌 對細胞和細胞間的信號轉(zhuǎn)導通路的影響。在一些實施方案中，本文公開的方法能夠檢測和 /或預測固有的耐藥機制和獲得性的耐藥機制。
[0011] 根據(jù)一些實施方案，提供了通過鑒定報告標志物基因的亞細胞定位的變化鑒定患 者特定驅(qū)動突變物的方法，其中報告標志物基因的亞細胞定位的變化受到驅(qū)動突變物的影 響。在一些實施方案中，患者來源的標志物（PDM)從該患者的生物樣品中獲得，并被操作 (構(gòu)建）以在報告物嵌合基因（熒光易位報告物（FTR)，包含報告物基因部分和靶基因部分 的嵌合產(chǎn)物）的存在下在活的受試細胞中表達。然后確定FTR在受試細胞中的亞細胞定 位。如果，與FTR在正常條件下（即，在相應的WT PDM的存在下）的亞細胞定位相比和/ 或與其他已知的參考相比，F(xiàn)TR在所測試的PDM的存在下的亞細胞定位不同，則指示所測試 的PDM發(fā)生突變。因此，使用本文公開的方法，可將患者的特定PDM鑒定/表征為驅(qū)動突變 物?？蛇x擇地或另外，在一些實施方案中，可通過創(chuàng)建TOR (即，連接/附接/融合至報告物 基因的PDM)，并跟蹤其亞細胞定位直接測試PDM，而無需使用FTR。此外，通過確定此類驅(qū)動 突變物，可確定患者腫瘤內(nèi)運行的已激活的信號轉(zhuǎn)導通路。此外，這促進精確并針對性地選 擇根除腫瘤并避免特定患者的抗性機制所需要的必需的靶向療法治療。
[0012] 根據(jù)一些實施方案，有利地提供了基于從腫瘤組織獲得的生物樣品的用于個性化 癌癥治療的新型診斷平臺。在一些實施方案中，所述方法是基于細胞的測定，所述基于細胞 的測定能夠通過此類監(jiān)測激活型驅(qū)動突變物對固定在基底上的存活的（活的）細胞中FTR 的影響，并且特別是監(jiān)測此類激活型驅(qū)動突變物激活已知的參與腫瘤發(fā)展的信號轉(zhuǎn)導通路 的能力來感知此類激活型驅(qū)動突變物。在一些實施方案中，這可通過檢測涉及熒光報告蛋 白（FTR)的細胞內(nèi)易位事件（即，易位到多個亞細胞位置，諸如質(zhì)膜、細胞溶質(zhì)、核內(nèi)體、核 仁等/在多個亞細胞位置，諸如質(zhì)膜、細胞溶質(zhì)、核內(nèi)體、核仁等之間易位）和蛋白-蛋白的 相互作用進行。因此，本文公開的方法和系統(tǒng)可允許在一線治療之前鑒定此類細胞事件，從 而啟動有效的治療方案。此外，可防止藥物治療刺激的腫瘤抗性細胞的過度生長。
[0013] 因此，根據(jù)一些實施方案，提供了鑒定癌癥患者的生物樣品中的一種或更多種患 者特定驅(qū)動突變物的方法，所述方法包括以下步驟：
[0014] a)從所述生物樣品獲得多種mRNA ;
[0015] b)由所述多種mRNA產(chǎn)生cDNA文庫；
[0016] c)使用與編碼已知的信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸互補的一組引物擴增所述cDNA文 庫中的特定cDNA ;
[0017] d)形成所擴增的cDNA的單獨的表達構(gòu)建體，其中所述cDNA被可操作地連接至啟 動子；
[0018] e)形成攜帶來自腫瘤的擴增的cDNA的第一組表達構(gòu)建體及相應的野生型cDNA的 第二組表達構(gòu)建體的可尋址陣列；
[0019] 從而提供在編碼所述信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸中攜帶候選突變的表達構(gòu)建體的 可尋址陣列，所述可尋址陣列適于在所述癌癥患者的生物樣品中鑒定患者的特定驅(qū)動突變 物。
[0020] 在一些實施方案中，所述方法還包括步驟（f):對于陣列中的每個位點，加入編碼 熒光易位報告物（FTR)基因的表達載體，所述熒光易位報告物（FTR)包含連接至特定報告 物基因部分的靶基因部分。
[0021] 在另外的實施方案中，所述方法還包括以下步驟：(g)在促使DNA構(gòu)建體和載體轉(zhuǎn) 染進入受試細胞的條件下，將活的測定細胞加至每個位點；以及（h)比較表達來自腫瘤的 cDNA與表達其相應的野生型表達的cDNA的測定細胞中表達的FTR的至少一個屬性；其中， 表達源自癌癥患者的生物樣品的cDNA與表達相應的野生型cDNA的測定細胞之間的不同的 結(jié)果，用于鑒定該生物樣品中作為候選的患者特定驅(qū)動突變物的cDNA。
[0022] 在一些實施方案中，F(xiàn)TR的屬性選自熒光蛋白的定位及熒光蛋白的易位。在一些實 施方案中，定位包括選自以下的亞細胞定位：細胞溶質(zhì)、細胞核、核仁、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)、 線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、內(nèi)體區(qū)室（endosomal compartment)和細胞骨 架。
[0023] 在一些實施方案中，F(xiàn)TR的靶基因部分編碼選自以下的蛋白：腫瘤抑制因子、細 胞骨架蛋白、生長因子受體、G-蛋白偶聯(lián)受體、細胞粘附蛋白、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、銜接蛋 白和交換因子。在另外的實施方案中，F(xiàn)TR的報告物基因部分編碼：綠色熒光蛋白（GFP)、 mCherry、mApple、DsRed、紅色熒光蛋白（RFP)、藍色熒光蛋白（BFP)、EGFP、CFP、YFP、 AmCyanl、ZsGreenl、ZsYellowl、DsRed2、AsRed2、和 HcRedl〇
[0024] 在一些實施方案中，生物樣品選自腫瘤細胞、腫瘤活檢物、腫瘤組織和體液。
[0025] 在一些實施方案中，第一和/或第二組表達構(gòu)建體包含雙鏈線性DNA。在其他實施 方案中，第一和/或第二組表達構(gòu)建體的啟動子是誘導型啟動子。在一些實施方案中，第一 和/或第二組表達構(gòu)建體的啟動子是組成型啟動子。
[0026] 在一些實施方案中，所述方法還包括對于陣列中的每個位點，誘導表達構(gòu)建體和/ 或表達載體在轉(zhuǎn)染細胞中表達，以獲得第一組來自腫瘤的cDNA和FTR的基因產(chǎn)物。
[0027] 在另外的實施方案中，擴增的cDNA的表達構(gòu)建體還包含IRES和第二報告物基因。
[0028] 在一些實施方案中，所述方法還包括在轉(zhuǎn)染試劑的存在下在固體支持體上干燥 DNA構(gòu)建體。
[0029] 根據(jù)一些實施方案，提供了確定腫瘤細胞中異常信號轉(zhuǎn)導通路的方法，包括以下 步驟：
[0030] a)從所述腫瘤細胞獲得多種mRNA;
[0031] b)由所述多種mRNA產(chǎn)生cDNA文庫；
[0032] c)使用與編碼已知的信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸互補的一組引物擴增所述cDNA文 庫中的特定cDNA;
[0033] d)形成步驟（c)的擴增的cDNA的單獨的表達構(gòu)建體，其中所述cDNA被可操作地 連接至啟動子；
[0034] e)形成攜帶來自腫瘤的擴增的cDNA的第一組表達構(gòu)建體及相應的野生型cDNA的 第二組表達構(gòu)建體的可尋址陣列；
[0035] 從而提供在編碼所述信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸中攜帶候選突變的表達構(gòu)建體的 可尋址陣列，所述可尋址陣列適于確定所述腫瘤細胞中異常的信號轉(zhuǎn)導通路。
[0036] 在一些實施方案中，所述方法還包括步驟（f):對于陣列中的每個位點，加入編碼 熒光易位報告物（FTR)基因的表達載體，所述熒光易位報告物（FTR)基因包含連接至報告 物基因部分的靶基因部分。
[0037] 在另外的實施方案中，所述方法還包括以下步驟：g)在促進DNA構(gòu)建體被共轉(zhuǎn)染 到測定細胞中的條件下，將活的測定細胞加至每個位點；以及h)比較表達來自腫瘤的cDNA 與表達其相應的野生型表達的cDNA的測定細胞中表達的FTR的至少一個屬性；其中，表達 源自腫瘤細胞的cDNA的測定細胞和表達相應的野生型cDNA的測定細胞之間的不同的結(jié) 果，用于鑒定腫瘤細胞中作為候選的異常信號轉(zhuǎn)導蛋白的cDNA。
[0038] 在一些實施方案中，腫瘤細胞源自癌癥患者的腫瘤樣品，所述腫瘤樣品選自：活檢 物、手術(shù)后的腫瘤切除物、血液樣品、支氣管肺泡灌洗液和骨髓。
[0039] 在另外的實施方案中，通過該方法鑒定的候選的異常信號轉(zhuǎn)導蛋白是患者的特定 驅(qū)動突變物。
[0040] 根據(jù)一些實施方案，提供了在癌癥患者的生物樣品中鑒定一種或更多種患者特定 驅(qū)動突變物的方法，包括以下步驟：
[0041] a)從所述生物樣品獲得多種mRNA;
[0042] b)由所述多種mRNA產(chǎn)生cDNA文庫；
[0043] c)使用與編碼已知的信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸互補的一組引物擴增所述cDNA文 庫中的特定cDNA;
[0044] d)形成所擴增的cDNA的單獨的表達構(gòu)建體，其中所述cDNA被可操作地連接至啟 動子；
[0045] e)在可尋址陣列中，將活的測定細胞添加至基底；
[0046] f)向所述測定細胞加入攜帶來自腫瘤的擴增的cDNA的第一組表達構(gòu)建體和相應 的野生型cDNA的第二組表達構(gòu)建體；其中在促使表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進入所述測定細胞的條 件下，將每種表達構(gòu)建體加至位于不同的可尋址位點處的測定細胞；
[0047] 從而產(chǎn)生包含在編碼所述信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸中攜帶候選突變的表達構(gòu)建 體的測定細胞的陣列，所述陣列適于鑒定所述癌癥患者的生物樣品中的患者特定驅(qū)動突變 物。
[0048] 在一些實施方案中，所述方法還包括將熒光易位報告物（FTR)基因的表達載體加 至測定細胞的步驟，所述FTR基因包含被連接至陣列中每個位點的特定報告物基因部分的 靶基因部分。
[0049] 在一些實施方案中，所述方法還包括，比較表達來自腫瘤的cDNA與表達其相應的 野生型表達的cDNA的細胞中的FTR的至少一個屬性；其中，表達生物樣品來源的cDNA與表 達相應的野生型cDNA的測定細胞之間的不同結(jié)果，用于鑒定生物樣品中作為候選的患者 特定驅(qū)動突變物的cDNA。
[0050] 在一些實施方案中，生物樣品選自腫瘤細胞、腫瘤活檢物、腫瘤組織和體液。
[0051] 根據(jù)一些實施方案，提供了確定腫瘤細胞中異常信號轉(zhuǎn)導通路的方法，包括以下 的一個或更多個步驟：
[0052] a)從所述腫瘤樣品獲得多種mRNA;
[0053] b)由所述多種mRNA產(chǎn)生cDNA文庫；
[0054] c)使用與已知的信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸（基因或基因部分）互補的一組引物擴 增所述cDNA文庫中的特定cDNA ;
[0055] d)形成（c)的擴增的cDNA的單獨的表達構(gòu)建體，其中所述cDNA被可操作地連接 至啟動子；
[0056] e)形成攜帶來自腫瘤的擴增的cDNA的第一組表達構(gòu)建體及相應的野生型cDNA的 第二組表達構(gòu)建體的可尋址陣列；
[0057] f)對于陣列中的每個位點，加入用于共轉(zhuǎn)染熒光易位報告物（FTR)嵌合基因的表 達載體，所述FTR嵌合基因包含連接至報告物基因部分的靶基因部分；
[0058] g)在促進DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進入測定細胞的條件下，將活的測定細胞加至每個位 占.
[0059] h)比較表達來自腫瘤的cDNA的細胞中與表達其相應的野生型表達的cDNA的細胞 中表達的FTR的至少一個屬性；
[0060] 其中，表達腫瘤來源的cDNA的細胞與表達相應的野生型cDNA的細胞之間的不同 的結(jié)果，用于鑒定所述腫瘤中作為候選的異常信號轉(zhuǎn)導蛋白的cDNA。
[0061] 在一些實施方案中，報告物基因的屬性選自熒光蛋白的定位及熒光蛋白的易位。
[0062] 在一些實施方案中，F(xiàn)TR的靶基因部分編碼選自以下的蛋白：腫瘤抑制因子、細胞 骨架蛋白、生長因子受體、G-蛋白偶聯(lián)受體、細胞粘附蛋白、蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、銜接蛋白 和交換因子。
[0063] 在一些實施方案中，F(xiàn)TR的報告物基因部分編碼或選自：綠色熒光蛋白（GFP)、 mCherry、mApple、DsRed、紅色熒光蛋白（RFP)、藍色熒光蛋白（BFP)、增強型綠色熒光蛋 白（EGFP)、青色焚光蛋白（CFP)、黃色焚光蛋白（YFP)、AmCyanl、ZsGreenl、ZsYellowl、 DsRed2、AsRed2、和 HcRedl。
[0064] 根據(jù)另外的實施方案，定位包括選自以下的亞細胞定位：細胞溶質(zhì)、細胞核、核仁、 質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、內(nèi)體區(qū)室和細胞骨架。
[0065] 在一些實施方案中，第一和/或第二表達構(gòu)建體包含雙鏈線性DNA。在另外的實施 方案中，第一和/或第二表達構(gòu)建體的啟動子是誘導型啟動子。在一些實施方案中，表達構(gòu) 建體的啟動子是組成型啟動子。
[0066] 在一些實施方案中，所擴增的cDNA的表達構(gòu)建體還包含IRES和第二報告物基因。
[0067] 在一些實施方案中，F(xiàn)TR的表達載體是環(huán)狀的表達載體。在另外的實施方案中，表 達載體包含組成型或誘導型啟動子。
[0068] 在一些實施方案中，步驟g)在步驟e)和/或f)之前，在這些個例中，測定細胞在 添加表達構(gòu)建體和/或表達載體之前被添加至每個位點。
[0069] 在一些實施方案中，所述方法還包括在轉(zhuǎn)染試劑的存在下在固體支持體上干燥 DNA構(gòu)建體。
[0070] 根據(jù)一些實施方案，測定細胞選自HeLa細胞、HEK293細胞、U20S、PC12、A549、 EKVX、T47D、HT29和患者的細胞。
[0071] 根據(jù)另外的實施方案，通過該方法鑒定的候選的異常蛋白是患者的特定驅(qū)動突變 物。
[0072] 在另外的實施方案中，細胞從癌癥患者的生物樣品中獲得。在一些實施方案中，月中 瘤樣品選自活檢物、手術(shù)后的腫瘤切除物、血液樣品、支氣管肺泡灌洗液和骨髓。
[0073] 在一些實施方案中，所述方法還包括，對于陣列中的每個位點，使構(gòu)建體和/或表 達載體在轉(zhuǎn)染的細胞中表達，以獲得第一組來自腫瘤的cDNA和FTR的基因產(chǎn)物。
[0074] 根據(jù)一些實施方案，提供了在癌癥患者的生物樣品中鑒定患者特定驅(qū)動突變物的 方法，包括以下步驟：
[0075] a.從所述生物樣品獲得多種mRNA的樣品；
[0076] b?由所述多種mRNA產(chǎn)生cDNA文庫；
[0077] c.使用與編碼已知的信號轉(zhuǎn)導蛋白的多核苷酸互補的一組引物擴增所述cDNA文 庫中的單獨的cDNA樣品；
[0078] d.形成所擴增的cDNA的單獨的表達構(gòu)建體，其中所述cDNA被可操作地連接至啟 動子；
[0079] e.形成攜帶來自腫瘤的擴增的cDNA的第一組表達構(gòu)建體及平行的相應的野生型 cDNA的第二組表達構(gòu)建體的可尋址陣列；
[0080] f.針對陣列中的每個位點，加入用于共轉(zhuǎn)染熒光易位報告物（FTR)基因的表達載 體，所述FTR基因包含連接至特定報告物基因的靶基因；
[0081] g.在促進DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進入測定細胞的條件下，將活的測定細胞添加至每個位 占.
[0082] h.比較表達來自腫瘤的cDNA與表達其相應野生型表達的cDNA的細胞中的報告物 基因的至少一個屬性；
[0083] 其中，表達所述生物樣品來源的cDNA的細胞與表達相應的野生型cDNA的細胞之 間的不同的結(jié)果，用于鑒定所述生物樣品中作為含候選的患者特定驅(qū)動突變物的cDNA。
[0084] 在一些實施方案中，生物樣品選自腫瘤細胞、組織、活檢物和體液。
[0085] 在一些實施方案中，細胞蛋白可以是可與癌癥狀況相關的任何類型的細胞蛋白。 在一些實施方案中，細胞蛋白可參與各種細胞程序。在一些實施方案中，細胞蛋白可選自， 但不限于：參與信號轉(zhuǎn)導通路的蛋白、細胞骨架蛋白、酶、參與翻譯的蛋白、參與細胞周期調(diào) 控的蛋白、參與轉(zhuǎn)錄的蛋白、參與代謝的蛋白等，或其組合。
[0086] 根據(jù)一些實施方案，還提供了用于在癌癥患者的生物樣品中鑒定患者的特定驅(qū)動 突變物的試劑盒。在另外的實施方案中，提供了用于確定患者腫瘤細胞中的異常信號轉(zhuǎn)導 通路的試劑盒