專利名稱：一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
:纖維素是世界上最多的可再生生物質(zhì)資源。每年由植物體光合作用生成的生物質(zhì)高達(dá)1500億噸，但是由于纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前這一巨大資源的絕大部分還不能被人類所綜合利用。纖維素是以葡萄糖為單元通過3-1，4-糖苷鍵連接而成的大分子。纖維素酶能將纖維素降解并最終轉(zhuǎn)化成葡萄糖的一類酶的總稱，包括內(nèi)切纖維素B|(endo-l, 4- ^ -D-glucanase, EC3.2.1.4，簡稱EG)；外切纖維素酶(exo-1, 4_ P -D-glucanase, EC3.2.1.91,簡稱 CBH) -葡糖苷酶(P -D-glucosidase,EC3.2.1.21，簡稱86)。內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶系中最重要的酶，其作用于纖維素分子內(nèi)的無定形區(qū)，隨機(jī)水解￠-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生大量的短鏈的小分子纖維素物質(zhì)，即纖維素末端，可為外切葡聚糖酶提供大量的反應(yīng)末端，同時(shí)它也能水解小分子的纖維素寡糖；外切纖維素酶作用于纖維素分子的末端，以兩個(gè)葡萄糖殘基為單位依次從纖維素分子的末端切下，生成纖維二糖；3 -葡糖苷酶作用于纖維二糖，將其水解成葡萄糖，葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵很容易就可以轉(zhuǎn)化成各種有用的化工產(chǎn)品。纖維素的轉(zhuǎn)化利用對(duì)解決世界能源危機(jī)、糧食問題、環(huán)境污染等有著重要的意義。獲取纖維素酶的傳統(tǒng)方法是從純培養(yǎng)微生物出發(fā)，篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株，通過發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)酶，這在工業(yè)中獲得了重要的應(yīng)用，但是嚴(yán)峻的能源危機(jī)使得對(duì)新型工業(yè)用酶的需求日益旺盛。自然環(huán)境中99%的 微生物在目前的實(shí)驗(yàn)條件下不易獲得純培養(yǎng)，未培養(yǎng)微生物也是地球上最大的尚未開發(fā)的生物資源。近年來出現(xiàn)的宏基因組學(xué)不依賴于微生物培養(yǎng)，以特定環(huán)境中微生物總DNA為對(duì)象，增加了獲得新的生物活性物質(zhì)的機(jī)會(huì)，是一條找尋新基因及新酶的新途徑。紅樹林處于周期性遭受海水浸淹的環(huán)境，兼有陸地和海洋的性質(zhì)但又與二者不同，具有沼澤化和鹽潰化等特征，其植物凋落物非常豐富，纖維素、木質(zhì)素等有機(jī)質(zhì)含量高，造就豐富又不失特色的微生物資源，通過構(gòu)建宏基因文庫，可以從中篩選到新穎的性質(zhì)優(yōu)良的纖維素酶基因
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的是提供一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建紅樹林宏基因組文庫，利用纖維素酶活性平板篩選方法，獲得了新的纖維素酶MgCel44及其編碼基因mgcel44，該編碼基因mgcel44可在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)以生產(chǎn)纖維素酶MgCel44，用于纖維素的降解，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶的編碼基因mgCel44，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其由1947個(gè)堿基組成。本發(fā)明的新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其由648個(gè)氨基酸組成，自N端的第33-87位氨基酸為多配體聚糖區(qū)域，自N端的第147-399位氨基酸為家族44糖基水解酶功能域。纖維素酶MgCel44與其它內(nèi)切葡聚糖酶具有一定的相似性，與Micromonospora lupini str.Lupac08的胞外纖維素酶、Streptomyces bingchenggensis BCff-1 的內(nèi)切葡聚糖酶、Amycolatopsismediterranei U32的內(nèi)切葡聚糖酶有最高一致性，一致性為48%，所以纖維素酶MgCel44是一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，其特征在于，含有上述新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶的編碼基因mgcel44。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，含有上述表達(dá)載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。所述的原核細(xì)胞可以為各種細(xì)菌，如大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明還提供·了上述新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44在纖維素降解中的應(yīng)用。本發(fā)明得到了一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44及其編碼基因mgCel44，該新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44能夠水解纖維素，因此本發(fā)明的新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44可以在纖維素的水解中具有廣泛的用途。


:圖1為從紅樹林土壤中提取的總DNA，I =AMix (片段從大到小依次為48.5kb, 38.4kb, 33.5kb, 29.9kb, 24.5kb, 24.0kb, 19.4kb, 17.lkb, 15.0kb, 12.2kb, 10.lkb, 8.6kb, 8.3kb) ；2:入-Hind III digest (片段從大到小依次為23.lkb, 9.4kb, 6.6kb) ；3:紅樹林土壤總DNA。圖2為用限制性內(nèi)切酶BamH I對(duì)紅樹林土壤微生物宏基因文庫克隆進(jìn)行酶切分析以判斷文庫質(zhì)量，Ml:入Mix (片段從大到小依次為48.5kb, 38.4kb, 33.5kb, 29.9kb, 24.5kb, 24.0kb, 19.4kb, 17.lkb, 15.0kb, 12.2kb, 10.lkb, 8.6kb, 8.3kb) ；M2: A -Hind III digest(片段從大到小依次為23.lkb,9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.3kb，2.0kb);其他泳道分別為文庫克隆。圖3為文庫中纖維素酶活性陽性克隆的篩選。圖4為能降解羧甲基纖維素的文庫克隆質(zhì)粒FosSCSIOI的BamH I酶切帶型，I:入-Hind III digest (片段從大到小依次為 23.lkb, 9.4kb, 6.6kb, 4.4kb, 2.3kb, 2.0kb) ；2:DL2000 (片段從大到小依次為 2.0kb, 1.0kb，0.75kb，0.5kb，0.25kb，0.lkb)；3:FosSCS101/BamH I。圖5為重組質(zhì)粒pET_mgcel44轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的轉(zhuǎn)化子能降解羧甲基纖維素(上)，而空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的轉(zhuǎn)化子不能降解羧甲基纖維素(下)。
具體實(shí)施例方式以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述，提供的實(shí)施例是為了更好地理解本發(fā)明，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明。
在本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括:紅樹林土壤樣品，EPI300-T1R菌株、Copycontrol PCC2Fos載體購自Epicentre公司，限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑購自Promega、Takala、Sigma。實(shí)施例1:紅樹林土壤微生物宏基因組文庫的構(gòu)建1、紅樹林土壤微生物總DNA的提取(I)稱取5g紅樹林土壤樣品，放置于50mL無菌離心管中；(2)加 A 13.5ml 紅樹林土壤 DNA 提取緩沖液:(IOOmmol Tris-HCl, IOOmmolEDTA[乙二胺四乙酸鈉],100mmo1 sodium phosphate [憐酸鈉]，1.5mol/L NaCl,1%CTAB [十六烷基三甲基溴化銨]，2%PVPP [交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮]，其余為水，pH8.0)，漩渦震蕩5-10min，使土壤顆粒充分分散于緩沖液中；(3)將震蕩后的樣品置于搖床中，常溫下振搖45min，使得土壤勻質(zhì)化，加入
1.5mL20%SDS，輕柔顛倒混勻，65°C水浴3h，每隔30min輕柔顛倒混勻樣品；(4)水浴裂解后，冷卻至室溫，IOOOOg離心IOmin離心取上清液；(5)加入預(yù)冷的氯仿/異戊醇(24:1)，顛倒混勻，室溫下IOOOOg離心IOmin.收集上清，加入0.6倍體積的預(yù)冷的異丙醇,室溫下沉淀40min ；(6)室溫下，IOOOOg離心15min收集核酸沉淀；(7)核酸沉淀用70%冰乙醇洗滌2次，IOOOOg離心5min，重懸于100 U I無菌TE緩沖液，得紅樹林土壤總DNA，0.8%電泳檢測(cè)(見圖1)。2、插入片段的切割及末端修復(fù)對(duì)提取的紅樹林土壤總DNA用槍頭反復(fù)吹打進(jìn)行機(jī)械性切割，使得其大小在35kb左右，脈沖場(chǎng)電泳進(jìn)行DNA片段的分離(脈沖場(chǎng)電泳設(shè)置為電壓:6V/cm,脈沖值:5_15s,溫度:16°C，時(shí)間16h)，回收35kb左右的DNA片段，對(duì)回收的片段進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，在冰上依次向微量離心管中加入:8iillOX ii末端修復(fù)緩沖液，8iU2.5mM dNTP混合物，8 u IlOmMATP, 20 u g插入片段，4ii I末端修復(fù)酶,加去離子水至總體積為80 y I。在室溫下反應(yīng)45min，然后轉(zhuǎn)移至70°C水浴IOmin以滅活末端補(bǔ)平酶，沉淀并回收DNA。3、連接及 Copycontrol Fosmid 克隆的包裝連接反應(yīng)的體系為:1 iillOx快速連接緩沖液，I U I ATP, I U I PCC2Fos預(yù)處理好的克隆載體(0.g/iil)，插入DNA(0.25 u g of ^ 35kb步驟2的回收DNA)，Iyl快速連接酶，加去離子水至體積為lOiil，16°C連接20h，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到70°C，lOmin，使快速連
接酶失活，得到連接反應(yīng)液。Copycontrol Fosmid克隆的包裝的步驟如下:(I)冰上融化I管噬菌體包裝提取物用于連接反應(yīng)，該連接反應(yīng)可以擴(kuò)大或縮小反應(yīng)體系； (2)在融化過程中，立即轉(zhuǎn)移25iil噬菌體包裝提取物到另一個(gè)1.5ml的離心管中；(3)加入10 U I連接反應(yīng)液至25 U I已經(jīng)冰上融化了的噬菌體包裝提取物中；(4)用移液槍輕輕混勻液體數(shù)次，注意避免產(chǎn)生氣泡，短暫離心使溶液都到小管底部;(5 ) 30 °C 下包裝 90min ；
(6)加入剩余的25 U I噬菌體包裝提取物至管中；(7) 30°C下額外包裝 90min ；(8)加入噬菌體稀釋緩沖液至1ml，溫和混勻，每管加入25 Ul氯仿，得到包裝好的
噬菌體。4、文庫的評(píng)估將包裝好的噬菌體侵染大腸桿菌EPI300，共獲得100,000個(gè)克隆的文庫，隨機(jī)挑取18個(gè)克隆，經(jīng)過誘導(dǎo)，使其產(chǎn)生高拷貝質(zhì)粒后提取質(zhì)粒DNA，然后用內(nèi)切酶BamH I酶切，脈沖電泳檢測(cè)(見圖2)。結(jié)果所有質(zhì)粒除了都有一個(gè)8.1kb的載體片段外，都含有插入片段，而且?guī)透鞑幌嗤?見圖2)，說明文庫含有隨機(jī)的插入片段，插入片段大小在20-55kb之間，平均長度約為30kb，文庫容量達(dá)3Gb，說明文庫的容量非常大，質(zhì)量非常好。實(shí)施例2:表達(dá)纖維素酶活性陽性克隆的篩選將保存在96孔板中的文庫克隆子挑取到含有1%的羧甲基纖維素鈉(CMC)的卡那霉素抗性LA平板上，將平板在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，用0.5%剛果紅溶液染色20min，IMNaCl溶液脫色15min，檢測(cè)平板上是否有透明圈，結(jié)果篩選到I個(gè)CMCase陽性克隆子(見圖3)，該陽性克隆的質(zhì)粒命名為fosSCSIOl。為了證實(shí)fosSCSIOl確實(shí)含有纖維素酶基因，用提取的fosSCSIOl質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌EPI300，結(jié)果重組子在含羧甲基纖維素鈉的平板上檢測(cè)到清晰的水解圈，而不含質(zhì)粒的大腸桿菌EPI300在平板上則沒有檢測(cè)到水解圈，說明fosSCSIOl質(zhì)粒上確實(shí)含有纖維素酶基因。用限制性內(nèi)切酶BamH I完全酶切fosSCSIOl后，電泳檢測(cè)分析，結(jié)果除了有一個(gè)8.1kb的載體片段外，還有另外6條片段，大小分別為
6.0kb、5.0kb、4.lkb、3.5kb、3.0kb、2.2kb (見圖 4)，說明 fosSCSIOl 含有約 23.8kb 的插入片段。
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實(shí)施例3:纖維素酶基因的獲得提取纖維素酶活性克隆fosSCSIOl質(zhì)粒，用Sau3A I進(jìn)行酶切，酶切體系為:5u 110X酶切緩沖液，適量質(zhì)粒DNA，0.5iil稀釋100倍的內(nèi)切酶Sau3A I，加入ddH20至總體積為50 u 1，37°C反應(yīng)3min，回收長度為l_5kb的DNA片段。同時(shí)PUC19載體進(jìn)行BamH I酶切，酶切后再進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)體系為:2iillOX緩沖液，適量酶切后TOC19載體，
IU I CIAP，加入ddH20至總體積為20 ill。磷酸化處理后的TOC19載體與回收的Sau3A I酶切的質(zhì)粒酶切片段進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞，利用剛果紅平板進(jìn)行纖維素酶活性陽性克隆子篩選，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)陽性克隆子質(zhì)粒大小進(jìn)行分析，如果插入片段過大，則重復(fù)以上步驟進(jìn)行下一輪亞克隆，直到陽性克隆子質(zhì)粒大小符合測(cè)序要求。最終獲得一個(gè)插入片段長度為3kb左右的陽性克隆子，將該片段送去華大基因進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過拼接得到完整的含有mgCel44基因的片段。實(shí)施例4:纖維素酶基因mgcel44的核苷酸序列分析用 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的軟件如ORF finder, Blast對(duì)步驟3的測(cè)序的完整的含有mgcel44基因的片段進(jìn)行序列分析。纖維素基因mgCel44的開放閱讀框由1947個(gè)脫氧核苷酸組成，序列如SEQ ID N0.1所示，其中起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。實(shí)施例5:纖維素酶基因mgcel44編碼產(chǎn)物纖維素酶MgCel44的氨基酸序列分析利用密碼子規(guī)則，纖維素酶基因mgcel44編碼一個(gè)含648個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其序列如 SEQ ID N0.2 所不，命名為纖維素酶 MgCe144,使用 Blast (http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/)搜索GenBank數(shù)據(jù)庫,纖維素酶MgCel44屬于糖苷水解酶44家族,與其它內(nèi)切葡聚糖酶具有一定的相似性，與Micromonospora lupini str.Lupac08的胞外纖維素酶、Streptomyces bingchenggensis BCW-1 的內(nèi)切葡聚糖酶、Amycolatopsis mediterraneiU32的內(nèi)切葡聚糖酶有最高一致性，一致性為48%，因此纖維素酶MgCel44是一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶。用組件結(jié)構(gòu)研究工具Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/search)分析MgCel44的組件結(jié)構(gòu)，自N端的第33_87位氨基酸為多配體聚糖區(qū)域，自N端的第147-399位氨基酸為家族44糖基水解酶功能域。實(shí)施例6:纖維素酶基因mgcel44的克隆和表達(dá)用上游引物mgcel44-S:CTCCGGAAITCATGGGITTGGCCCTGGATGC，下游引物mgcel44-A:CTCCGCTCGAGTCTAATGACGATTGAGTGCCGAAAG,以實(shí)施例 3 的纖維素酶陽性克隆子質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增纖維素酶基因mgCel44 (經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增得到的片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，為纖維素酶基因mgcel44)，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，與經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的pET-22b表達(dá)載體進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，涂布到含50ii g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基平板上篩選陽性克隆，進(jìn)一步提取質(zhì)粒DNA，雙酶切驗(yàn)證正確后命名重組質(zhì)粒為pET-mgCel44，該重組質(zhì)粒是將纖維素酶基因mgcel44插入pET_22b表達(dá)載體中。將質(zhì)粒pET_mgcel44轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化子用IPTG誘導(dǎo)后，在平板上能降解羧甲基纖維素，而含有未插入纖維素酶基因mgCel44的pET-22b空載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子則不能降解羧甲基纖維素(圖5)，由此說明纖維素內(nèi)切酶基因mgcel44在大腸桿菌中成功表達(dá),該纖維素酶基因mgcel44的表達(dá)產(chǎn)物纖維素酶MgCel44能夠降解羧甲基 纖維素。
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶MgCel44，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的纖維素酶MgCel44的纖維素酶基因mgCe144，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.—種表達(dá)載體,其特征在于,含有權(quán)利要求2所述的纖維素酶基因mgcel44。
4.一種宿主細(xì)胞,其特征在于,含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的原核細(xì)胞為細(xì)菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)菌為大腸桿菌BL2UDE3)。
7.權(quán)利要求1所述的纖維素 酶MgCel44在纖維素降解中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明得到了一種新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)及其編碼基因mgcel44(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，該新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44能夠水解纖維素，因此本發(fā)明的新穎的糖苷水解酶家族44的纖維素酶MgCel44可以在纖維素的水解中具有廣泛的用途。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103232984SQ201310124139
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者張偲, 麥志茂, 楊鍵, 李潔 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所