一種低β-葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及添加劑的技術領域，特別涉及一種低β-葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法。
【【背景技術】】
[0002]纖維素水解可得纖維低聚糖，纖維低聚糖在水中有一定的溶解度，在有機溶劑中微溶或者不容，纖維低聚糖是功能性低聚糖，可促進礦物質吸收、為雙歧桿菌增殖因子、降低血清膽固醇、增強機體免疫力、抵抗腫瘤等獨特的生理功能，是人、動物、植物等具有特殊生理作用的低聚糖，可廣泛應用于食品和飼料工業(yè)。
[0003]纖維素酶是一類能夠水解纖維素的β-l，4_葡萄糖苷鍵生成葡萄糖的多組分酶的總稱，傳統(tǒng)上傳統(tǒng)上將其分為3類:內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纖維素酶在降解纖維素的過程中，纖維素酶組分中的葡萄糖苷酶主要在液相中發(fā)生作用，而水解得到的纖維低聚糖也主要溶解在液相中，葡萄糖苷酶會進一步水解纖維低聚糖，釋放出葡萄糖作為產物。
[0004]目前，采用里氏木霉纖維素酶應用于降解纖維素制備纖維低聚糖，盡管里氏木霉纖維素酶系中的葡萄糖苷酶活力較低，但是產物中葡萄糖含量依然很高，需要將其中的葡萄糖苷酶組分分離除去，以減少或消除葡萄糖苷酶對生成的纖維低聚糖進一步降解。
[0005]現有技術中，從里氏木霉纖維素酶系中分離除去β_葡萄糖苷酶的一個較好的方法是應用層析分離法，但是層析分離法成本較高，不適合工業(yè)化生產，因此尋找經濟可行的、可工業(yè)化的一種低葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，是十分必要的。
【
【發(fā)明內容】
】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述現有技術的不足，提供一種低β_葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，其旨在解決現有技術中纖維素酶降解纖維素得到纖維低聚糖的產量較低，且應用層析分離法去除葡萄糖苷酶成本較高，不適合工業(yè)化生產的技術問題。
[0007]為實現上述目的，本發(fā)明提出了一種低β_葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，包括如下步驟:
[0008]步驟一、選取菌種:選取木霉屬中的里氏木霉作為生產纖維素酶的菌株；
[0009]步驟二、制備斜面孢子:將選取的里氏木霉接種至PDA斜面培養(yǎng)基中，并置于生化培養(yǎng)箱中，在溫度為24?30°C、相對濕度為95?97%的恒溫恒濕暗環(huán)境下培養(yǎng)5?7天，直至里氏木霉菌絲表面形成一層分生孢子層，于4°C溫度下保存?zhèn)溆茫?br>[0010]步驟三、制備孢子懸液:用無菌水洗下步驟二處理得到的分生孢子，并稀釋孢子濃度至18個/mL，備用；
[0011]步驟四、制備種子液:在250mL的三角瓶中裝入50mL液態(tài)種子培養(yǎng)基，并用紗布封口，滅菌處理后，在無菌環(huán)境中取ImL經步驟三得到的孢子懸液接種至液態(tài)種子培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)2?3天，使孢子萌發(fā)得到纖維素酶種子液，備用；
[0012]步驟五、制備發(fā)酵料:將秸桿、稻草、麥麩等纖維原料粉碎至20目以下，預處理并滅菌處理后冷卻，得到無菌發(fā)酵料；
[0013]步驟六、發(fā)酵產酶培養(yǎng):將步驟四得到的種子液與步驟五得到的無菌發(fā)酵料以質量比為1:10?12的比例均勻接種至液體培養(yǎng)基中，接種量為4?5%，并按照50?60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液初始PH值控制在4?7、溫度控制在28?32°C進行發(fā)酵產酶處理，發(fā)酵時間為72?96小時；
[0014]步驟七、制備纖維素酶液:將經過步驟六處理得到的發(fā)酵液在離心機中離心處理，得到纖維素酶液，備用；
[0015]步驟八、吸附脫附處理:取經步驟七得到的纖維素酶液與纖維吸附基質以一定的比例混合加入離心機中，并加入2?4倍水靜置，靜置一段時間后，開啟離心機離心脫附處理，去除液相中的葡萄糖苷酶；
[0016]步驟九、后處理:取出經步驟八處理后的離心機中的低β-葡萄糖苷酶的物料，可直接用作綠色飼料添加劑進行飼喂，纖維低聚糖含量高。
[0017]作為優(yōu)選，所述步驟二中的TOA固體培養(yǎng)基的制備方法:新鮮去皮馬鈴薯200g，切小塊，加蒸餾水至lOOOmL，沸水煮30min后用紗布過濾，添加葡萄糖20g、瓊脂粉18?20g，加熱至瓊脂溶化后加蒸餾水至100mU分裝至無菌試管中，于121°C溫度下滅菌30min，傾斜靜置，凝固后備用。
[0018]作為優(yōu)選，所述的步驟四中的恒溫培養(yǎng)振蕩器的溫度設定在24?32°C，旋轉頻率為180?260r/min。
[0019]作為優(yōu)選，所述的步驟六發(fā)酵過程中從發(fā)酵罐底部通入凈化后的無菌空氣，進行氣流攪拌。
[0020]作為優(yōu)選，所述的步驟六中接種量為4%，發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵時間為96小時。
[0021]作為優(yōu)選，所述的步驟六中接種量為5%，發(fā)酵溫度為32°C，發(fā)酵時間為72小時。
[0022]作為優(yōu)選，所述的步驟八中的纖維吸附基質包括低聚木糖生產廢渣。
[0023]作為優(yōu)選，所述的步驟八中離心機內的溫度為10°C，pH值為7.0，靜置時間為30mino
[0024]本發(fā)明的有益效果:與現有技術相比，本發(fā)明提供的一種低β-葡萄糖苷酶活力纖維素酶的制備方法，采用里氏木霉生產制備纖維素酶，其中的葡萄糖苷酶活性較低，減緩了葡萄糖苷酶對纖維素的進一步降解作用，防止生成的纖維低聚糖進一步被降解成葡萄糖，采用液態(tài)深層發(fā)酵法生產，具有培養(yǎng)條件容易控制、不易染雜菌、生產效率高的特點，可工業(yè)化大規(guī)模生產，改善了目前國內絕大部分纖維素生產廠家均采用固體發(fā)酵法生產纖維素酶，發(fā)酵水平不穩(wěn)定，生產效率較低，不適合大規(guī)模生產的現狀，采用低聚木糖生產廢渣等作為纖維吸附基質，資源利用率高，并通過吸附脫附處理后，拆分去除溶于液相中的葡萄糖苷酶，進一步降低了纖維素酶中葡萄糖苷酶的含量，且吸附的脫附處理的溫度為10°C，pH值為7.0，靜置吸附時間為30min，大大提高了內切葡聚糖酶吸附率與β-葡萄糖苷酶吸附率的比值，提高了飼料中纖維低聚糖的含量。
[0025]本發(fā)明的特征及優(yōu)點將通過實施例結合附圖進行詳細說明?！尽靖綀D說明】】
[0026]圖1是溫度對低聚木糖生產廢渣吸附纖維素酶組分的影響分析圖；
[0027]圖2是pH對低聚木糖生產廢渣吸附纖維素酶組分的影響分析圖；
[0028]圖3是時間對低聚木糖生產廢渣吸附纖維素酶組分的影響分析圖。
【【具體實施方式】】
[0029]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明了，下面通過附圖中及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。但是應該理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說明中，省略了對公知結構和技術的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。
[0030]本發(fā)明實施例提供一種低β-葡萄糖苷酶纖維素酶添加劑的制備方法，包括如下步驟:
[0031]步驟一、選取菌種:選取木霉屬中的里氏木霉作為生產纖維素酶的菌株。
[0032]步驟二、制備斜面孢子:將選取的里氏木霉接種至PDA斜面培養(yǎng)基中，并置于生化培養(yǎng)箱中，在溫度為24?30°C、相對濕度為95?97%的恒溫恒濕暗環(huán)境下培養(yǎng)5?7天，直至里氏木霉菌絲表面形成一層分生孢子層，于4°C溫度下保存?zhèn)溆谩?br>[0033]其中，PDA固體培養(yǎng)基的制備方法:新鮮去皮馬鈴薯200g，切小塊，加蒸餾水至100mU沸水煮30min后用紗布過濾，添加葡萄糖20g、瓊脂粉18?20g，加熱至瓊脂溶化后加蒸饋水至lOOOmL，分裝至無菌試管中，于121°C溫度下滅菌30min，傾斜靜置，凝固后備用。
[0034]步驟三、制備孢子懸液:用無菌水洗下步驟二處理得到的分生孢子，并稀釋孢子濃度至108個/mL，備用。
[0035]步驟四、制備種子液:在250mL的三角瓶中裝入50mL液態(tài)種子培養(yǎng)基，并用紗布封口，滅菌處理后，在無菌環(huán)境中取ImL經步驟三得到的孢子懸液接種至液態(tài)種子培養(yǎng)基中，然后置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)2?3天，使孢子萌發(fā)得到纖維素酶種子液，備用。
[0036]其中，恒溫培養(yǎng)振蕩器的溫度設定在24?32°C，旋轉頻率為180?260r/min。
[0037]步驟五、制備發(fā)酵料:將秸桿、稻草、麥麩等纖維原料粉碎至20目以下，預處理并滅菌處理后冷卻，得到無菌發(fā)酵料。
[0038]步驟六、發(fā)酵產酶培養(yǎng):將步驟四得到的種子液與步驟五得到的無菌發(fā)酵料以質量比為1:10?12的比例均勻接種至液體培養(yǎng)基中，接種量為4?5%，并按照50?60%的裝入量裝入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液初始PH值控制在4?7、溫度控制在28?