一種發(fā)酵培養(yǎng)基及用該發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵nmn轉(zhuǎn)移酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)基及用該發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵NMN轉(zhuǎn)移酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究發(fā)現(xiàn)，NMN轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、原核生物和真核生物的細(xì)胞中。目前已經(jīng)知道的NMN轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞中的存在形式主要有三種亞型，分別是Nmnatl、Nmnat2以及Nmnat3，且其分子量大小，性質(zhì)以及特征隨著其在組織細(xì)胞中的分布位置不同出現(xiàn)差異。煙酰胺單核苷酸(NMN)在人體細(xì)胞能量生成中扮演著重要角色，它參與細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化的重要輔酶)的合成。在所有活的生物組織中，NMN轉(zhuǎn)移酶是合成NAD的不可缺少的生物酶，研究證明，它對(duì)原核生物細(xì)胞的存活十分重要，是唯--種能夠催化細(xì)胞核內(nèi)NAD合成的生物酶，而且，NMN轉(zhuǎn)移酶也可以作為生物藥劑的靶標(biāo)，一定程度上可以降低生物細(xì)胞的衰老和死亡，減少一些疾病的發(fā)生率。例如:可以降低由基因引起的軸突的變性，提高抗腫瘤藥物的生物活性。
[0003]目前合成NMN轉(zhuǎn)移酶的方法主要是生物合成法，用傳統(tǒng)的篩選和誘變技術(shù)可以獲得一些具有較高酶活的NMN轉(zhuǎn)移酶的菌種如金黃色葡萄球菌、埃希式桿菌、極端嗜熱古細(xì)菌等，但是，這些菌種產(chǎn)酶能力和催化能力較低，不能滿足工業(yè)發(fā)展的需求。
[0004]大腸桿菌比上述這些細(xì)菌產(chǎn)酶能力和催化能力都較高，并且大腸桿菌有其最適生長培養(yǎng)基，而不同來源的NMN轉(zhuǎn)移酶的生成和其菌體生長的培養(yǎng)基不同，因此，篩選一種既適合大腸桿菌的菌體生長又能利于提高NMN轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是為了解決上述問題而進(jìn)行的，目的在于提供一種既適合大腸桿菌的菌體生長又能利于提高NMN轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及采用該發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵NMN轉(zhuǎn)移酶的方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]本發(fā)明提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，具有這樣的特征，包含:濃度為20?30g/L的酵母粉，濃度為8?12g/L的胰蛋白胨，體積分?jǐn)?shù)為3 %?4.5 %的甘油，濃度為0.2?0.3g/L的MgSO4,酵母膏，濃度為1.0?1.5g/L的NH4Cl,濃度為0.4?0.6g/L的NaCl，濃度為2?3g/L的KH2PO4，濃度為9?13.5g/L的K2HPO4以及雙蒸水。
[0008]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵方法，利用上述的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，其特征在于，包括以下步驟:步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基上，在37 0C的條件下培養(yǎng)12?18h，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基;步驟二，取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其pH值為7.0，在121°C條件下滅菌20min，得到濃度為25g/L的活化液;步驟三，在無菌環(huán)境下從固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為30yg/ml的硫酸卡那霉素，在37°C條件下活化8?12h，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體;步驟四，將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分?jǐn)?shù)為I?5%的接種量接入經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180?200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)至OD600為0.5?0.7時(shí)，加入終濃度為8mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為25°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)8?12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵液;步驟五，將發(fā)酵液放置于離心管中，在8000?12000r/min條件下離心5?lOmin，取離心管內(nèi)的沉淀得到含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌濕菌體。
[0009]在本發(fā)明提供的煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵方法中，還可以具有這樣的特征:其中，在上述步驟一中，固體培養(yǎng)基的制備方法為:將濃度為25g/L的LB培養(yǎng)基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，在121°C條件下高壓滅菌20min，得到固體培養(yǎng)基。
[0010]在本發(fā)明提供的煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵方法中，還可以具有這樣的特征:其中，對(duì)大腸桿菌濕菌體中的煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的酶活進(jìn)行測(cè)定的步驟，該步驟包括以下子步驟:子步驟一，將大腸桿菌濕菌體用濃度為50mmol/L、pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液重懸，超聲破碎大腸桿菌濕菌體，破壁后的菌液在溫度為4 °C、轉(zhuǎn)速為12000r/min離心20min，收集菌液的上清液，菌液的上清液即為粗酶液;子步驟二，將濃度為lmol/L pH7.5Tris-HCl的緩沖液、濃度為300mmol/L的NMN轉(zhuǎn)移酶、濃度為50mmol/L的ATP、濃度為50mmol/L的Mn2+、體積分?jǐn)?shù)為2 %的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為53 %的粗酶液以及酶量為7U的乙醇脫氫酶(ADH)混勻，得到混合溶液;子步驟三，將混合溶液置于37°C的恒溫水浴鍋中振蕩反應(yīng)2h，加入濃度為0.155mol/L的EDTA反應(yīng)5min，終止酶反應(yīng)，冰浴冷卻后在轉(zhuǎn)速8000r/min條件下離心Imin，取混合溶液的上清液并在340nm處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值OD34o，吸光值0D34Q代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力大小。
[0011]在本發(fā)明提供的煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵方法中，還可以具有這樣的特征:其中，在上述子步驟三中，超聲破碎的條件為功率為300W，超聲時(shí)間4s，每次間隔6s，超聲次數(shù)60次。
[0012]發(fā)明的作用與效果
[0013]本發(fā)明提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基及用該發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵NMN轉(zhuǎn)移酶的方法，該發(fā)酵培養(yǎng)基中含有適合大腸桿菌生長的必需元素，在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，使得大腸桿菌在該發(fā)酵培養(yǎng)基中良好生長并且能夠高產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶，該培養(yǎng)基成分簡單、成本低、運(yùn)用前景廣闊，該發(fā)酵方法簡單實(shí)用，易于操作。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，對(duì)于實(shí)施例中所用到的具體方法或材料，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明技術(shù)思路的基礎(chǔ)上，根據(jù)已有的技術(shù)進(jìn)行常規(guī)的替換選擇，而不僅限于本發(fā)明實(shí)施例的具體記載。
[0015]實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均視為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑等，如無特別說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0016]實(shí)施例一
[0017]1、發(fā)酵培養(yǎng)基
[0018]本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)基中包含:濃度為20g//L的酵母粉，濃度為8g/L的胰蛋白胨，體積分?jǐn)?shù)為4.5%的甘油，濃度為0.2g/L的MgS04，酵母膏，濃度為1.0g/L的NH4Cl，濃度為
0.6g/L的NaCl，濃度為2g/L的KH2PO4，濃度為9g/L的K2HPO4以及雙蒸水。
[0019]2、發(fā)酵方法
[0020]采用本實(shí)施例成分含量的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行煙酰胺單核苷酸腺苷(匪N)轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵，包括以下步驟:
[0021]步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基的制備:將濃度為25g/L的LB培養(yǎng)基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，在121°(:條件下高壓滅菌201^11)上，在37°(:的條件下培養(yǎng)12?1811，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基；
[0022]步驟二，取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其pH值為7.0，在121°C條件下滅菌20min，得到濃度為25g/L的活化液；
[0023]步驟三，在無菌環(huán)境下從固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到活化液中，并加入終濃度為30yg/ml的硫酸卡那霉素，在37°C條件下活化8?12h，得到含有活化的大腸桿菌菌體的液體；
[0024]步驟四，將含有活化的大腸桿菌菌體的液體按照體積分?jǐn)?shù)為1.5%的接種量接入經(jīng)過滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為180?200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)至0D600為0.5?0.7時(shí)，加入終濃度為8mmol/L的誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在溫度為25°C，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)8?12h，收集得到含煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵液；
[0025]步驟五，將發(fā)酵液放置于離心管中，在8000?12000r/min條件下離心5?lOmin，取離心管內(nèi)的沉淀得到含有煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌濕菌體。
[0026]3、大腸桿菌產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶的酶活測(cè)定方法
[0027]對(duì)本實(shí)施例得到的大腸桿菌濕菌體中的煙酰胺單核苷酸腺苷(NMN)轉(zhuǎn)移酶的酶活進(jìn)行測(cè)定，包括以下子步驟:
[0028]子步驟一，將大腸桿菌濕菌體用濃度為50mmol/L、pH7.5的磷酸鹽緩沖溶液重懸，超聲破碎(功率為300W，超聲時(shí)間4s，間隔時(shí)間6s，超聲次數(shù)60次)大腸桿菌濕菌體，破壁后的菌液在溫度為4 0C、轉(zhuǎn)速為12000r/min離心20min，收集菌液的上清液，菌液的上清液即為粗酶液；
[0029]子步驟二，將濃度為lmol/L pH7.5Tris_HCl的緩沖液、濃度為300mmol/L的NMN轉(zhuǎn)移酶、濃度為50mmo 1/L的ATP、濃度為50mmo 1/L的Mn2+、體積分?jǐn)?shù)為2 %的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為53%的粗酶液以及酶量為7U的乙醇脫氫酶(ADH)混勻，得到混合溶液；
[0030]子步驟三，將混合溶液置于37 °C的恒溫水浴鍋中振蕩反應(yīng)2h，加入濃度為
0.155mol/L的EDTA反應(yīng)5min，終止酶反應(yīng)，冰浴冷卻后在轉(zhuǎn)速8000r/min條件下離心lmin，取混合溶液的上清液并在340nm處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值OD34o，吸光值OD34o代表NMN轉(zhuǎn)移酶酶活力大小。
[0031]在本實(shí)施例中，通過本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵出來的NMN轉(zhuǎn)移酶的活力為15.23?17.12U/mg。
[0032]實(shí)施例二
[0033]1、發(fā)酵培養(yǎng)基
[0034]本實(shí)施例的發(fā)酵培養(yǎng)基中包含:濃度為30g/L的酵母粉，濃度為12g/L的胰蛋白胨，體積分?jǐn)?shù)為3 %的甘油，濃度為0.3g/L的MgSO4，酵母膏，濃度為1.5g/L的NH4Cl，濃度為0.4g/L的NaCl，濃度為2g/L的KH2PO4，濃度為9g/L的K2HPO4以及雙蒸水。
[0035]2、發(fā)酵方法
[0036]采用本實(shí)施例成分含量的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行煙酰胺單核苷酸腺苷(匪N)轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵，包括以下步驟:
[0037]步驟一，將大腸桿菌劃線接種到固體培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基的制備:將濃度為25g/L的LB培養(yǎng)基和濃度為20g/L的瓊脂用雙蒸水溶解于500ml的錐形瓶中，加入NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，在121°(:條件下高壓滅菌201^11)上，在37°(:的條件下培養(yǎng)12?1811，得到含有大腸桿菌的固體培養(yǎng)基；
[0038]步驟二，取一定量的LB培養(yǎng)基溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)其pH值為7.0，在121°C條件下滅菌20min，得到濃度為25g/L的活化液；
[0039]步驟三，在無菌環(huán)境下從固體培養(yǎng)基上挑取大腸桿菌接種到活