表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種重組雞馬立克氏病病毒疫苗株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，特別設(shè)及一 種表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株及其構(gòu)建方法和 應(yīng)用，本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過(guò)度增生 的腫瘤性疾病。根據(jù)致病性和宿主的不同，ALV被劃分為A-J 10個(gè)亞群，其中A-D為外源性病 毒，主要感染蛋雞，A、B亞群主要誘發(fā)雞的淋己細(xì)胞白血病。J亞型禽白血病病毒(ALV-J)是 由英國(guó)的化yne于1991年首次從肉用型雞中分離出來(lái)的一個(gè)新的囊膜亞群(Payne，L. N.， Brown，S.民.，Bumstead，N.,Howes，K.,Frazier,J.A.,Thouless，M.E.，1991.A novel subgroup of exogenous 過(guò)vi過(guò)n leukosis virus in chickens.The Journ過(guò)I of general virology 72(Pt 4),801-807.)D該病毒可通過(guò)水平傳播和垂直迅速地感染整個(gè)雞群，其水 平傳播能力明顯強(qiáng)于其他亞群。目前ALV的主要防治途徑是通過(guò)種群檢測(cè)淘汰陽(yáng)性感染雞 只，達(dá)到種群凈化切斷垂直傳播的途徑，來(lái)減少該病給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)的損失。但是，由于我國(guó) 的養(yǎng)殖模式多樣性，養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量多、分布散等特點(diǎn)，在我國(guó)地方雞群中實(shí)施ALV-J的凈化需 要若干世代，周期長(zhǎng)，且花費(fèi)高，要實(shí)現(xiàn)對(duì)我國(guó)的商品代雞群W及地方品系雞群的完全凈 化，幾乎是不可能完全實(shí)現(xiàn)的。因此探索ALV-J凈化過(guò)程中的適用技術(shù)和疫苗藥物使用可W 縮短凈化周期，加快凈化進(jìn)程，極具應(yīng)用價(jià)值和實(shí)踐意義。
[0003] 馬立克氏病(MD)是由馬立克氏病病毒(MDV)引起的一種雞的傳染性腫瘤病，W淋 己組織增生和腫瘤形成為特征。馬立克氏病是雞的主要疾病之一，也是國(guó)內(nèi)外50年代W來(lái) 最受重視的雞病。MDV屬于a-瘤疹病毒亞科馬立克氏病樣病毒屬，是一種細(xì)胞結(jié)合性瘤疹病 毒，其基因組為線狀雙股DNA，約為180kb。該病可引起雞發(fā)生多發(fā)性淋己瘤，導(dǎo)致雞只衰竭、 死亡，同時(shí)損傷雞體的免疫器官，產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫抑制，易并發(fā)其他疾病。該病病程較長(zhǎng)，并 且發(fā)生該病后常導(dǎo)致整個(gè)雞群的淘汰，一旦發(fā)生該病，損失往往特別巨大。疫苗是控制該病 的主要手段，在種雞群、蛋雞群中MD疫苗是必須使用的疫苗，肉雞群中使用該疫苗可W較大 幅度地提高養(yǎng)殖效率(Morgan,R.W. ,(^intello,J丄.，McDermott,C.H. ,1990.Transfection of chicken embryo fibroblasts with Marek's disease virus DNA.Avian diseases 34,345-351. )dMDV血清I型弱毒疫苗814株是一株自然弱毒株，該疫苗株自從上世紀(jì)80年代 研制成功W來(lái)，已安全使用30余年，沒(méi)有任何不良反應(yīng)(孫百明.馬立克氏病的免疫及疫苗 研究進(jìn)展.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33:988-991.)。814疫苗株具有良好的免疫原性，保護(hù) 效果與CVI988/Rispens株相當(dāng)。同時(shí)，814疫苗株也是我國(guó)自主研制的，唯一有效應(yīng)用的、具 有自主產(chǎn)權(quán)的MD疫苗。
[0004] 雞馬立克氏病(MD)和禽白血病(ALV)是兩種主要的危害禽類的免疫抑制性疾病， 其在國(guó)內(nèi)的廣泛流行給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，兩種病毒的混合感染 造成的危害更加嚴(yán)重，也增加了防控的難度。
[0005] 重組活載體疫苗是用基因工程技術(shù)將病毒或細(xì)菌構(gòu)建成一個(gè)載體，然后把外源基 因插入其中使之表達(dá)的活疫苗。該類疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫比較廣泛，包括體液免疫和 細(xì)胞免疫，甚至粘膜免疫;更為重要的，活載體疫苗可W同時(shí)表達(dá)多種抗原，制成多價(jià)或多 聯(lián)疫苗，起到"一針?lè)蓝嗖?的效果，是當(dāng)今和未來(lái)疫苗研發(fā)的主要方向之一。作為瘤疹病 毒，MDV較大的基因組便于外源基因的插入，是活載體疫苗研究的理想載體。在之前的研究 中，申請(qǐng)者成功建立了MDV弱毒疫苗株(814株)的多片段感染性克隆捶救系統(tǒng)，為MDV活載體 疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。本研究探索WMDV弱毒疫苗株為載體，研制表達(dá)ALV-J保護(hù)性抗原 的重組MDV活載體疫苗，可W起到同時(shí)預(yù)防MD和ALV-J的效果，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
[0006] 本發(fā)明在前期建立的MDV弱毒疫苗株多片段捶救系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，建立了 MDV弱毒疫 苗814株感染性重組克隆系統(tǒng)（公開(kāi)號(hào)為CN104830883A)。此外，本發(fā)明人通過(guò)在MDV基因組 的US2、US10、UL45/46等區(qū)域插入GFP巧光蛋白基因來(lái)比較外源基因在MDV不同復(fù)制非必需 區(qū)的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)US2區(qū)域是一個(gè)很好的表達(dá)外源基因的MDV復(fù)制非必需區(qū)。將ALV-J gag和env基因表達(dá)框架插入MDV US2基因中，構(gòu)建了表達(dá)gag和env基因的重組MDV疫苗株， 且US2基因缺失后不影響MDV的復(fù)制和致病性。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)MDV弱毒疫苗814株感染性重組克隆系統(tǒng)，構(gòu)建了表達(dá)ALV-J保護(hù)性抗 原的重組活載體疫苗，在國(guó)內(nèi)外研究中尚屬首創(chuàng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和化V基因的 重組雞馬立克氏病病毒疫苗株及其構(gòu)建方法，本發(fā)明構(gòu)建得到的疫苗株能使動(dòng)物體產(chǎn)生良 好的對(duì)抗ALV的抗體，同時(shí)還不影響MDV的免疫效果。
[0009] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)手段：
[0010] 本發(fā)明發(fā)明人在前期建立的MDV弱毒疫苗株多片段捶救系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，建立了 MDV 弱毒疫苗814株感染性重組克隆系統(tǒng)，W利于外源基因向MDV基因組的插入。然后，將含有 ALV Gag和化V基因的表達(dá)框架插入MDV US2基因中化S2基因是MDV的復(fù)制非必需基因，缺失 后不影響MDV的復(fù)制和致病性），構(gòu)建了表達(dá)Gag和Env基因的重組MDV疫苗株，研究表明，本 發(fā)明構(gòu)建的重組病毒疫苗株rMDV-ALVGE可W穩(wěn)定表達(dá)Gag和化V蛋白，并具有良好的遺傳穩(wěn) 定性。該重組病毒rMDV-ALVGE與親本病毒具有完全一致的復(fù)制特性，免疫動(dòng)物后可W誘導(dǎo) 產(chǎn)生ALV-J特異性抗體反應(yīng)，并顯著降低ALV-J感染造成的病毒血癥，同時(shí)不影響其本身對(duì) MDV的免疫保護(hù)效果。
[0011] ALV-J的宿主范圍十分廣泛，幾乎感染所有品系的雞。該病毒的傳播主要有水平傳 播和垂直傳播兩種形式。垂直傳播的雞從雞胚中獲得病毒，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生免疫耐受，病毒可在 體內(nèi)長(zhǎng)期存在，且長(zhǎng)期保持較高的病毒血癥和持續(xù)向外界排毒。本發(fā)明結(jié)果表明，rMDV-ALVGE重組疫苗不僅能夠在免疫后產(chǎn)生一定水平的中和抗體，而且能夠明顯降低已感染 ALV-J的雞群中病毒血癥的發(fā)生率，對(duì)已感染雞體內(nèi)的ALV-J病毒具有一定的清除作用。因 此，該重組疫苗在阻斷ALV-J的水平傳播和垂直傳播中均能起到一定作用。
[0012] 由此可見(jiàn)，本發(fā)明獲得的表達(dá)ALV Gag和Env基因的重組MDV疫苗株rMDV-ALVGE可 W用于制備預(yù)防或治療禽白血病和雞馬立克氏病的藥物。
[0013] 具體的，本發(fā)明的一種表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏 病病毒疫苗株，其是將包含J亞群禽白血病病毒Gag和化V基因和CAG啟動(dòng)子序列的表達(dá)框架 CAG-ALVGE插入到雞馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因內(nèi)部，獲得在US2基因內(nèi)部插 入CAG-ALVGE表達(dá)框架的重組粘粒，由其捶救獲得表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的 重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，其中，US2基因缺失了其中第15至630位的核巧酸，代之W插 入CAG-ALVGE表達(dá)框架，所述的CAG-ALVGE表達(dá)框架的結(jié)構(gòu)為CMV增強(qiáng)子-雞e-actin啟動(dòng)子-Gag 基因-IRES2 序列-Env 基因-sv40PolyA。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的CAG-ALVGE表達(dá)框架的核巧酸序列為SEQ ID NO. 1 所示。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的 重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，命名為rMDV-ALVGE，分類命名為馬立克氏病病毒(Marek's disease virus)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，地址在北京市 朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為:CGMCC No. 12010,保藏時(shí) 間為2016年1月14日。
[0016] 進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種構(gòu)建所述表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因 的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的方法，包括W下步驟：
[0017] (1)構(gòu)建馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳操作系統(tǒng)
[001引所述系統(tǒng)包含5個(gè)分別依次含有馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組1-47873 位、40028-79118位、72447-113806 位、106337-139612位和 129115-172541 位核巧酸序列的 重組粘粒，其中所述的馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因組序列的GeneBank登錄號(hào)為 JF742597,所述系統(tǒng)中的5個(gè)重組粘粒是通過(guò)將馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組1-47873 位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和 129115-172541 位核巧酸序 列與pCCWos載體連接后得到的，分別命名為9814-1、9814-2、9814-3、9814-4^及口814-5， 其中口814-5包含馬立克氏病病毒的1152基因，肥2基因的核巧酸序列如56010齡.2所示；
[0019] (2)含有CAG-ALVGE表達(dá)框架的重組突變粘粒P814-5US2ALVGE的構(gòu)建
[0020] 在步驟（1)構(gòu)建得到的重組粘粒P814-5中的US2基因內(nèi)部插入CAG-ALVGE表達(dá)框架 并替換US2基因的第15至630位核巧酸得到含有CAG-ALVGE表達(dá)框架的重組突變粘粒p814-抓S2ALVGE，CAG-ALVGE表達(dá)框架的結(jié)構(gòu)為CMV增強(qiáng)子-雞e-actin啟動(dòng)子-Gag基因-IRES2序 列-Env 基因 -S v40Po IyA;
[0021] (3)表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的捶 救
[0022] 對(duì)得到的重組粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4 W 及p814-5US2ALVGE 五個(gè)粘粒 進(jìn)行線性化處理，通過(guò)憐酸巧轉(zhuǎn)染方法將五個(gè)粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF，置于37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)染地后，棄掉細(xì)胞上清，用DMEM將細(xì)胞洗一遍;加入2ml甘油休克液，室溫解育2min;用 DMM洗涂3次后，加入含10 %FBS的DMM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，休克12h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為含 3 %FBS、1 %雙抗的DMM繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4-5天后盲傳2代可觀察到細(xì)胞病變的出現(xiàn)，捶救出 的重組病毒即為表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和化V基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株。
[0023] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，含有CAG-ALVGE表達(dá)框架的重組突變粘粒p814-抓S2ALVGE的 構(gòu)建，包括W下步驟：
[0024] (I)pKS KanccdB質(zhì)粒的構(gòu)建
[00巧]WRlF和RlR為引物，從PDEST22中擴(kuò)增得到attRl序列；WPSKanF和p6KanR為引物， 從PM0D6中擴(kuò)增得到卡那霉素抗性基因化an); WCC地R2F和CC地R2R為引物，從PDEST22中擴(kuò) 增得到CC地-attR2基因；分別純化上述得到的3個(gè)DNA片段，并W此3個(gè)片段為模板，WRlF和 ccdBR2R為引物，擴(kuò)增得到attRl-Kan-ccdB-attR2表達(dá)框架，將得到的attRl-Kan-ccdB-attR2表達(dá)框架利用XbaI和化ndIII酶切位點(diǎn)克隆入地Iuescript II KS( + )載體，獲得地S KanccdB;
[00%] RlF：GCGTCTAGAGATGATGAAGATACCCCACCA(XbaI)
[0027] RlR：GTGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAA
[0028] P6KanF：TTGGCAGCATCACCCGACGCACACATCTCAACCATCATCG
[0029] P6KanR：ATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCACCGAGCTCGAATTCGATGAA
[003