檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn) 使用情況的引物及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬立克氏?。∕arek，sdisease,MD)是由馬立克氏病病毒（(Marek，sdisease virus,MDV)引起的一種禽類高度接觸性、傳染性、淋巴組織增生性腫瘤病，主要危害雞，鶴 鶉、山雞也有發(fā)病。該病可引起內(nèi)臟器官、肌肉和外周神經(jīng)的淋巴細(xì)胞瘤的神經(jīng)腫大。臨床 上MD發(fā)病雞群表現(xiàn)為生長(zhǎng)不均勻、極度消瘦、死亡等癥狀，最常見的病變是神經(jīng)損害和多 種實(shí)質(zhì)臟器的淋巴腫瘤，以肝臟、脾臟腫瘤最為多見，因神經(jīng)損害導(dǎo)致的不對(duì)稱性進(jìn)行性麻 痹，最終可引起單個(gè)或多個(gè)肢體的完全性麻痹。
[0003] MDV屬于皰疹病毒科，有三種不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含 有特異性抗原。I型MDV感染能引起腫瘤，II型和III型MDV毒株無致病性，可用于疫苗株。 因I型MDV感染可引起腫瘤，其檢測(cè)具有非常重要的意義。目前，臨床上最常用鑒別診斷I 型MDV感染的方法是病毒分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)方法等。病毒分離鑒定不但對(duì) 臨床診斷很有價(jià)值，對(duì)流行病學(xué)及病原學(xué)研究亦至關(guān)重要，但該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，約需1~ 2個(gè)月，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的操作要求高，局限性較大。血清學(xué)方法如ELISA等主要用于檢測(cè)羽 毛囊上皮、溶細(xì)胞感染的淋巴細(xì)胞組織及細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品，此類方法檢測(cè)成本相對(duì)較高， 并且由于部分病例中病毒血癥時(shí)間較短，病毒含量低，導(dǎo)致檢出率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，有必要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)馬立克氏病病毒存在的問題，提供檢測(cè) LMAN2(lectin,mannose-binding2,LMAN2)基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物 及方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] -種檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物，所述引物包括第一 對(duì)引物和第二對(duì)引物，其序列與LMAN2基因3'非翻譯區(qū)中的兩對(duì)序列或其互補(bǔ)序列相同。
[0007] 優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的序列與LMAN2基因3'非翻譯區(qū)中common區(qū)域的部分 序列或其互補(bǔ)序列相同，所述第二對(duì)引物的序列為L(zhǎng)MAN2基因3'非翻譯區(qū)中Extended區(qū) 域的部分序列或其互補(bǔ)序列相同。
[0008] 優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物用于擴(kuò)增common區(qū)域的Proximal片段，所述第二對(duì)引物 用于擴(kuò)增Extended區(qū)域的Distal片段。
[0009] 優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的序列如SEQIDNO:1_2所示或其互補(bǔ)序列，所述第二對(duì) 引物的序列如SEQIDN0 :3-4所示或其互補(bǔ)序列。
[0010] -種檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的方法，包括以下步驟：
[0011] 提取樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA;
[0012] 以cDNA為模板，使用第一對(duì)引物qPCR擴(kuò)增common區(qū)域的Proximal片段，得到CT 值一
[0013] 以cDNA為模板，使用第二對(duì)引物擴(kuò)增Extended區(qū)域的Distal片段，得到CT值 dis?
[0014] 計(jì)算CT值dls與CT值pro的比值。
[0015] 優(yōu)選地，所述qPCR的反應(yīng)體系為：
[0016]
[0017] 優(yōu)選地，所述qPCR的反應(yīng)條件為：
[0018] 預(yù)變性：95°Clmin;擴(kuò)增：95°C5s，62°C15s，72°C10s信號(hào)收集，40 個(gè)循環(huán)；溶解 曲線：95°Clmin;冷卻：37°Clmin。
[0019] 3 '端非翻譯區(qū)（3 'UTR)作為mRNA結(jié)構(gòu)的一部分，對(duì)mRNA的穩(wěn)定性、定位及翻譯 效率都起著重要的作用。基因最后一個(gè)外顯子上的可選擇性P〇ly(A)位點(diǎn)，可以導(dǎo)致不同 長(zhǎng)度的3'UTR，即tandem3'UTR(串聯(lián)3'UTR)。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道在免疫應(yīng)答、神經(jīng) 活化、腫瘤形成及胚胎發(fā)育過程中均有3'UTR長(zhǎng)度的改變。在基因動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)過程中，選擇 性聚腺苷酸化（alternativepolyadenylation，APA)在近年來受到人們的廣泛關(guān)注。最近 的研究表明有超過一半的人類基因含有APA位點(diǎn)。這些都暗示著APA對(duì)于基因功能可能有 著重要的調(diào)控作用，也有著巨大的潛力成為新的分子標(biāo)記物。隨著第二代高通量測(cè)序技術(shù) 的發(fā)展，研究人員近年來開發(fā)了多種高通量測(cè)序文庫(kù)制備方法來對(duì)全基因組APA進(jìn)行測(cè)序 和分析。隨著APA研究的深入，APA越發(fā)成為新的基因轉(zhuǎn)錄與翻譯調(diào)控的研究熱點(diǎn)，目前， 已有研究開始將APA作為腫瘤發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)記。
[0020] 本發(fā)明利用雞的LMAN2基因3'非翻譯區(qū)中的兩對(duì)序列或其互補(bǔ)序列，通過實(shí)時(shí)熒 光定量PCR方法對(duì)雞只組織或血液中的LMAN2基因信使核糖核酸mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn) 使用情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)宿主在感染MDV后LMAN2基因可變腺苷酸位點(diǎn)的使用情況發(fā)生了 明顯改變，可將LMAN2基因可變腺苷酸位點(diǎn)的使用變化作為宿主（雞只等）感染馬立克病 毒的生物學(xué)標(biāo)記。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明LMAN2基因mRNA的可變腺苷 酸位點(diǎn)使用情況的檢測(cè)方法方便快捷，靈敏度高，特異性好，適合在條件簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室以及 發(fā)展中國(guó)家得到進(jìn)一步推廣。
【附圖說明】
[0022] 圖1為mRNA結(jié)構(gòu)中qPCR引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)示意圖。
[0023] 圖2為實(shí)施例1中LMAN2基因APA的變化情況。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】做進(jìn)一步說明。本發(fā)明中 所用試劑或儀器均可由市場(chǎng)購(gòu)得，使用的檢測(cè)方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。 [00 25] 實(shí)施例1
[0026]用 1X105pfuMd5 (Marek，sdiseasevirusMd5,MDVMd5)感染單層CEF細(xì) 胞（雞胚成纖維細(xì)胞），以不感染的CEF細(xì)胞為對(duì)照，分別收集18h、36h、54h、72h后的細(xì) 胞，提取總RNA;消化DNA后，檢測(cè)0D260/280,比值在2. 0-2. 1為合格，對(duì)合格的總RNA 進(jìn)行SAPAS(sequenceofalternativepolyadenylationsite,SAPAS)文庫(kù)的構(gòu)建， 構(gòu)建好的文庫(kù)用Hi-Seq-2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行APA(alternative polyadenylation,APA)的分析。
[0027] 結(jié)果如圖2所示，對(duì)比感染Md5和不感染Md5的CEF細(xì)胞的APA分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn) LMAN2基因多聚腺苷酸化位點(diǎn)的使用情況發(fā)生了明顯改變，感染Md5的CEF細(xì)胞的LMAN2基 因使用遠(yuǎn)端APA位點(diǎn)mRNA的比例提高，可作為感染MDV的一個(gè)生物標(biāo)記。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 本實(shí)施例中檢測(cè)LMAN2基因mRNA的可變腺苷酸位點(diǎn)使用情況的引物如表1所示。 該引物是根據(jù)LMAN2 基因（genebankAccession:X