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二聚探針同時檢測櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法

文檔序號:9645823閱讀:580來源:國知局
二聚探針同時檢測櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病毒檢測領域,具體涉及二聚探針同時檢測櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和 桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 桃潛隱花葉類病毒(Peachlatentmosaicviroid,PLMVd)屬于Avsunviroidae 科,主要侵染桃樹、李、杏等核果類果樹。1997年,Hadidi等報道PLMVd在歐洲、亞洲、 北美和南美的桃種質中廣泛分布(約為55 % ) (Hadidi,A,Giunchedi,L,Shamloul,AM ,etal.,OccurrenceofPeachlatentmosaicviroidinstonefruitsandits transmissionwithcontaminatedblades.PlantDisease, 1997, 81:154-158.)〇PLMVd 在桃樹上潛隱期可達5~7年,癥狀一般表現(xiàn)為花葉、延遲發(fā)芽,嚴重時引起早衰、甚至死 亡(DesvignesGC.PeachlatentmosaicanditsrelationtoPeachyellowmosaic virusdisease.ActaHorticulture, 1986, 193:51-57)。據(jù)報道,在我國遼寧、山東、河 北、陜西,四川,湖北等地樣品檢測到PLMVd,有的果園桃樹PLMVd發(fā)生普遍(張少瑜,張 尊平,洪霓,等.桃潛隱花葉類病毒的鑒定.中國果樹,2000,(1) :30-31.;劉曉,Barba M,Br〇ggi〇M,etal.,四川核果類果樹病毒類病害田間普查與檢測鑒定.西南農(nóng)業(yè)學報, 2004,17(5) :613-617.;徐文興,王國平,何云蔚,等.桃潛隱花葉類病毒中國分離株P3 的克隆與序列分析·植物病理學報,2005,35(4) :300-304. ;Yu,Y.,Zhao,Z.,Qin,L.,et al. ,IncidenceofmajorpeachvirusesandviroidsinChina.JournalofPlant Pathology, 2013, 95(3) :603-607.)。樓桃綠環(huán)斑駁病毒(Cherrygreenringmottle virus,CGRMV)是李屬植物中發(fā)生較普遍,危害較嚴重的病毒之一。能侵染多種李屬植物 包括甜櫻桃,酸櫻桃,櫻花,桃和杏(ZhangYP,KirkpatrickBC,SmartCD,etal.cDNA cloningandmolecularcharacterizationofCherrygreenringmottlevirus. JournalofGenVirol, 1998, 79:2275-2281·)。CGRMV屬于線形病毒科(Flxeviiridae) 凹陷病毒屬(Foveavirus)(KingAMQ,AdamsMJ,CarstensEB,etal.Virus taxonomy:classificationandnomenclatureofviruses:Ninthreportofthe internationalcommitteeontaxonomyofviruses.ElsevierAcademicPress,San Diego, 2011.),該病毒在北美、歐洲、新西蘭、非洲和亞洲等地區(qū)分布極廣。2011年我國 首次利用RT-PCR檢測技術在甜櫻桃和桃等李屬植物中發(fā)現(xiàn)了CGRMV(ZhouJF,WangG P,KuangR.F. ,etal.FirstreportofCherrygreenringmottlevirusoncherry andpeachgrowninChina.PlantDisease,2011,95(10):1319·)。王文文等(王文文, 宗曉娟,陳立偉,等.山東地區(qū)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(CGRMV)的RT-PCR檢測及外殼蛋白基因 的克隆.山東農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2012,43(2) :206-210,219.)對山東地區(qū)甜 櫻桃生產(chǎn)園進行病原檢測,發(fā)現(xiàn)CGRMV發(fā)生較普遍。近年來,我們對我國主要桃產(chǎn)區(qū)病毒 病進行了系統(tǒng)調查及RT-PCR分子檢測,結果表明:分別在新疆,甘肅,福建,河南,云南,廣 西,河北,北京,山東等地桃樹樣品上均檢測到PLMVd;在山東、福建和甘肅等地桃樹樣品上 檢測到CGRMV(Yu,Y.,Zhao,Z.,Qin,L.,etal.,Incidenceofmajorpeachvirusesand viroidsinChina.JournalofPlantPathology,2013,95 (3) :603-607. )。2013 年6 月 我們對福建不同果園桃樹43個顯癥和不顯癥的樣品進行了 6種主要病毒:蘋果褪綠葉斑 病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV),李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunusnecrotic ringSpotviru S,PNRSV),CGRMV,杏假褪綠葉斑病毒(APCLSV),李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒 (Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus,PBNSPaV),白蝶蘭(屬)花葉病 毒(Pecteilismosaicvirus,PcMV),2 種類病毒(PLMVd和啤酒花矮化類病毒(Hopstunt viroid,HSVd)檢測,43個樣品中只檢測到PLMVd,HSVd和CGRMV三種病原,而且,CGRMV主 要是與PLMVd復合侵染為主,復合侵染率較高。
[0003] 目前關于果樹病毒和類病毒檢測方法主要有:生物學方法、血清學方法和電子顯 微鏡測定方法和分子生物學方法。分子生物學檢測法包括核酸分子雜交和PCR測定法等, 因其快速、靈敏、準確等特點,已逐漸成為植物病毒和類病毒研究和檢測的重要方法之一。 雖然PCR,RT-PCR等方法敏感度高,但該方法需要專門的儀器設備,由于污染,可能產(chǎn)生假 陽性,而核酸分子雜交方法靈敏性和特異性都較強,其中斑點雜交方法在尼龍膜上進行,只 要具備探針,檢測操作簡單方便,適合基層應用,能夠一次檢測大量樣品。
[0004] 在過去的幾年,同時檢測多種植物病毒非同位素標記的分子雜交技術已成為 重要的途斷方法(reviewsinJamesD.,Varga,A.,Pallas,V.,etal.Strategiesfor simultaneousdetectionofmultipleplantviruses.CanadianJournalofPlant Pathology,2006,28:16-29.)〇Herranzetal. (Herranz,M.C. ,Sanchez-Navarro,J. A.,Aparicio,F.,etal. ,Simultaneousdetectionofsixstonefruitvirusesby non-isotopicmolecularhybridizationusingauniqueriboprobeor'polyprobe' · JournalofVirologicalMethods,2005, 124:49-55.)報道,通過分子克隆和連接,串 聯(lián)幾個病毒核酸序列,合成非同位素標記的digoxigenin標記的單一分子探針,叫多聚 探針(polyprobe),能同時檢測六個核果的病毒(蘋果花葉病毒(Applemosaicvirus, ApMV),PNRSV,李矮縮病毒(Prunedwarfvirus,PDV),美洲李線紋病毒Americanplum linepatternvirus(APLPV),李痕病毒(Plumpoxvirus,PPV),ACLSVD 相比混合在一 起單探針,polyprobe能減少處理時間和總成本。隨后,這方法應用于同步檢測核果多個 類病毒(Cohen,0·,Batuman,0·,Stanbekova,G.,etal. ,Constructionofamultiprobe forthesimultaneousdetectionofviroidsinfectingcitrustrees.Virus Genes, 2006, 33:287-292. ;Lin,L. ,Li,R. ,Mock,R. ,etal. ,Developmentofapolyprobe todetectsixviroidsofpomeandstonefruittrees.JournalofVirological Methods,2011,171:91-97.;ZhangZ. ,Peng,S. ,Jiang,D. ,etal. ,Developmentofa polyprobeforthesimultaneousdetectionoffourgrapevineviroidsingrapevine plants.EuropeanJournalofPlantPathology,2012, 132:9-16·)。而同時檢測病毒與 類病毒的polyprobe,目前有一篇報道,Peiroetal(Peiro,Α·,Pallds,V.,S(inchez-Nav arro,J.A. ,Simultaneousdetectionofeightvirusesandtwoviroidsaffecting stonefruittreesbyusingauniquepolyprobe.EuropeanJournalofPlant Pathology,2012, 132:469-475.)在Herranzetal. (Herranz,M.C. ,Sanchez-Navarro,J. A. ,Aparicio,F.,etal. ,Simultaneousdetectionofsixstonefruitvirusesby non-isotopicmolecularhybridizationusingauniqueriboprobeor<polyprobe,. JournalofVirologicalMethods, 2005, 124:49-55.)用多聚探針同時檢測六個核果病毒 的基礎上,又增加了兩個核果病毒和兩個核果類病毒(HSVd,PLMVd)。目前,尚未有用于果 樹病毒和類病毒
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