一種基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種利用DNAzyme探針來進行定性和定量檢測乙肝病毒DNA的方法。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的局限性，以PCR擴增為基礎(chǔ)檢測平臺，通過引入3’-氨基修飾的DNAzyme探針，實現(xiàn)了乙肝病毒的一步法定性及定量檢測。該技術(shù)具有靈敏度高，特異性強，檢測線性范圍廣，成本低廉，準確度高，方便操作等優(yōu)點，為乙肝病毒提供了簡單快速、準確高效、經(jīng)濟實用的檢測方法。
【專利說明】—種基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于DNAzyme探針的乙肝病毒DNA定性及定量檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前應(yīng)用最為廣泛的乙肝病毒DNA檢測方法是實時熒光定量PCR方法，熒光定量PCR有很多優(yōu)勢，包括靈敏度高、特異性強，但是該技術(shù)需要依賴昂貴的熒光定量PCR儀和熒光探針，檢測成本遠遠高于普通PCR，不利于大范圍推廣。因此，開發(fā)一種簡單快速、準確高效、經(jīng)濟實用的乙肝病毒檢測方法具有重要的社會意義和科研價值。
[0003]脫氧核酶(DNAzyme)是通過體外篩選技術(shù)獲得的具有催化功能的單鏈DNA序列，迄今通過體外篩選已經(jīng)獲得多種具有不同催化功能的脫氧核酶，包括能夠催化RNA剪切和鏈接、DNA的剪切和連接、DNA的磷酸化、卟啉的金屬化、碳-碳鍵形成以及氧化等反應(yīng)。DNAzyme除了具有多功能性，相對于蛋白酶和核酶，還具有合成簡單、成本低、易保存、穩(wěn)定性高等優(yōu)勢。目前，DNAzyme已在生物分析、醫(yī)學(xué)診斷、納米技術(shù)以及基因治療等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注并取得一系列先進的研究成果。因此，基于DNAzyme的獨特優(yōu)勢進行乙肝病毒檢測方法的開發(fā)將有望突破現(xiàn)有技術(shù)的一些障礙，為乙肝病毒的檢測提供更為經(jīng)濟實用的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在 于提供一種簡單快速、準確高效、經(jīng)濟實用的定性和定量檢測乙肝病毒的方法。
[0005]本發(fā)明具體涉及一種在PCR檢測平臺上利用DNAzyme探針對乙型肝炎病毒進行檢測的方法。方法以乙肝病毒的基因保守區(qū)域為待檢測的目標核酸序列進行PCR引物及特異性DNAzyme探針的設(shè)計。本發(fā)明所涉及的DNAzyme探針為一發(fā)夾探針，在常溫條件、未檢測到乙肝病毒時呈封閉的發(fā)夾狀態(tài)，不顯示DNAzyme活性，從而無檢測信號產(chǎn)生；當(dāng)用正反向引物對乙肝病毒S區(qū)保守序列即目標核酸序列進行擴增時，DNAzyme探針在PCR循環(huán)過程中可與目標核酸序列互補，并在引物延伸過程中由于核酸聚合酶5’ -3’外切酶活性而被部分消化從而釋放出DNAzyme探針中的活性DNAzyme序列。此時,被釋放的活性DNAzyme序列便能發(fā)揮其活性產(chǎn)生多種可讀的檢測信號，如肉眼可見的顏色信號及可準確定量的光吸收信號、熒光信號等，從而報告檢測結(jié)果。
[0006]本發(fā)明以乙肝病毒S區(qū)的基因保守區(qū)域設(shè)計了相應(yīng)的引物和特異性DNAzyme探針的設(shè)計:(I)正向引物 HBV-F: 5，-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3 ’ ；( 2 )反向引物 HBV-R: 5 ’ -GGACAAACGGGCAACATACCTT-3’ ；(3)特異性的 DNAzyme 探針:5’ -CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH2-3，。
[0007]本發(fā)明具體包括兩個操作步驟:(1)PCR擴增目標核酸并釋放活性DNAzyme序列；
(2)比色/熒光報告檢測結(jié)果。[0008]與已有的相關(guān)檢測技術(shù)相比，本發(fā)明所涉及的DNAzyme探針的3’ -端進行了氨基修飾，使得目標核酸的檢測可以一步完成，無需在PCR過程中再開蓋加探針和補加引物便能獲得非常好的檢測信號，不僅使得操作過程更為簡單，更重要的是避免了 PCR過程中開蓋將引起的交叉污染。此外，本發(fā)明在PCR反應(yīng)中采用了 UNG體系，避免擴增產(chǎn)物的污染，使得檢測結(jié)果更為真實可靠，也降低了對操作環(huán)境的要求。
[0009]本發(fā)明所涉及的DNAzyme是一種能夠產(chǎn)生信號的、具有催化功能的DNA序列。目前所發(fā)現(xiàn)的DNAzyme分為5大類:切割DNA的DNAzyme、切割RNA的DNAzyme、與卟啉鐵等結(jié)合具有過氧化物酶活性的DNAzyme、具有連接酶功能的DNAzyme、具有激酶活力的DNAzyme。
[0010]本發(fā)明所涉及的DNAzyme是與卟啉鐵等結(jié)合具有過氧化物酶活性的DNAzyme時，當(dāng)DNAzyme釋放后，(I)通過加入hemin、顯色底物(ABTS、DAB等)、H202，在室溫下顯色，直接用肉眼觀察顏色變化或用分光光度計測得一定波長下的吸光值來檢測信號，從而判斷目標核酸序列是否存在。當(dāng)顯色底物為ABTS時，存在目標核酸序列的樣品顯綠色，當(dāng)顯色底物為DAB時，存在目標核酸序列的樣品顯棕紅色，不存在目標核酸序列的樣品都為無色；(2)向體系中加入hemin、鹽酸酪胺(Tyramine.HCl)>H2O2,以320nm為激發(fā)光激發(fā)反應(yīng)產(chǎn)物，即可在410nm處觀察到檢測結(jié)果，從而實現(xiàn)對樣本的準確定量檢測。
[0011]本發(fā)明所涉及的DNAzyme為可與鋅原卟啉、結(jié)晶紫或孔雀石綠等熒光底物結(jié)合的DNAzyme時，當(dāng)DNAzyme釋放后，可與體系中的熒光底物結(jié)合，通過DNAzyme與熒光底物結(jié)合與否的熒光強度變化可實現(xiàn)樣本的定量檢測。
[0012]本發(fā)明所申請保護的技術(shù)雖是針對乙肝病毒檢測的，但也適用于其他核酸樣本的檢測。
[0013]本發(fā)明所涉及的核酸聚合酶是一種具有5’ -3’外切酶活性的耐熱性聚合酶。
[0014]本發(fā)明對待測核酸樣品的長度沒有限制，但對PCR反應(yīng)中擴增的特異性序列長度有一定的限制，擴增片段不宜過長，通常為200個堿基以內(nèi)。
[0015]如本文所用，下列詞語/術(shù)語具有下列含義，除非另外說明。
[0016]“DNAzyme”:脫氧核酶(deoxyribozyme, Catalytic DNA)是人工合成的、利用體外分子進化技術(shù)篩選的一種具有催化功能的單鏈DNA片段，具有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力。據(jù)催化功能的不同，可以將脫氧核酶分為5大類:切割RNA的脫氧核酶、切割DNA的脫氧核酶、具有激酶活力的脫氧核酶、具有連接酶功能的脫氧核酶、催化卟啉環(huán)金屬螯合反應(yīng)的脫氧核酶。
[0017]“UNG體系”:在PCR體系中，為了防止擴增產(chǎn)物的污染，以dUTP代替dTTP進行PCR，使PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。當(dāng)在這種“dU”取代“dT”PCR體系中加入尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)，在PCR擴增前一定溫度下保溫5-10min，UNG酶即可將反應(yīng)體系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶堿基降解。在隨后熱變性的過程中DNA鏈斷裂，從而消除可能污染到的上一輪的擴增產(chǎn)物，以保證擴增結(jié)果的特異性、準確性。同時，熱變性還使UNG酶失活，無法再對新的擴增產(chǎn)物進行降解。這樣的PCR體系即為“UNG體系。
[0018]“Hemin”:血紅素，Spn 卜啉鐵。
[0019]“ABTS”:2，2，-Azinobis- (3~ethyIbenzthiazoIine-6-sulphonate)，2，2_ 聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)。
[0020] “DAB”:Diaminobenzidine, 二氨基聯(lián)苯胺。[0021]本發(fā)明具有明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點，其主要優(yōu)點包括:
[0022]1.簡便性。本發(fā)明通過對DNAzyme探針進行改進，使得整個檢測反應(yīng)可以一步完成，大大降低了操作復(fù)雜性。
[0023]2.準確性。本發(fā)明的一步法操作及UNG體系，最大程度避免了樣品間的交叉污染和來自擴增產(chǎn)物的污染，使得檢測結(jié)果更為準確，可信度更高。
[0024]3.快速性。本發(fā)明用于檢測很快速，3-4小時即可得到檢測結(jié)果。
[0025]4.通用性。本發(fā)明所涉及的PCR檢測方法，適用于各種基因型的乙肝病毒樣本的檢測,也可用于檢測其它核酸樣本.[0026]5.實用性?，F(xiàn)有的實時熒光PCR技術(shù)通常對檢測設(shè)備和檢測條件具有較高的要求，從而使檢測具有一定的局限性，而本發(fā)明檢測方法僅需要普通PCR儀。再加上本發(fā)明是基于DNAzyme而開發(fā)的技術(shù)，能夠進行比色檢測，肉眼即可觀察到檢測結(jié)果。因此，方法本身對檢測條件要求低，實用性強，使得乙肝病毒檢測變得更加簡單、實用、經(jīng)濟、方便。
[0027]6.經(jīng)濟性?，F(xiàn)有的實時熒光PCR技術(shù)，試劑和探針的合成費用都較高，而本發(fā)明中所涉及的DNAzyme探針序列和標記物都由普通的核苷酸組成，合成方便，試劑較為廉價，因此,大大降低了檢測成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為乙肝病毒血清樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。其中泳道1、2、3分別為陰性乙肝血清樣本、受試乙肝血清樣本以及乙肝陽性對照的PCR擴增產(chǎn)物，擴增片段大小為116bp ;泳道M為DL-2000分子量Marker，片段從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。
[0029]圖2是乙肝病毒血清樣本的比色檢測結(jié)果，其中:1為陰性對照，陰性乙肝血清標本；2為陽性乙肝血清標本；3為陽性對照，含S區(qū)基因質(zhì)粒。
[0030]圖3是對IO1-1O7乙肝病毒DNA拷貝數(shù)的標準品進行PCR擴增后l_13min顯色反應(yīng)的動力學(xué)檢測曲線圖。其中，橫坐標代表顯色反應(yīng)檢測時間，縱坐標代表414nm處的吸收光強度。
[0031]圖4是從圖3中選取第4min時IO1-1O8拷貝8個梯度的吸收值繪制的乙肝血清標準曲線。其中，橫坐標代表乙肝血清樣本中乙肝病毒DNA拷貝數(shù)，縱坐標代表414nm處的吸收光強度。
[0032]圖5為使用本發(fā)明所述方法測定的乙肝血清樣本中乙肝病毒DNA的拷貝數(shù)(Ig值)與Taqman方法測定的乙肝血清樣本中乙肝病毒DNA的拷貝數(shù)(Ig值)的折線圖。橫坐標代表乙肝血清樣本編號，縱坐標代表測定的乙肝血清臨床樣本中乙肝病毒DNA的拷貝數(shù)(Ig值)?！?”表示本發(fā)明所述檢測方法測得的樣本值?！啊酢北硎綯aqman方法測得的樣本值。
[0033]圖6為該顯色方法測定乙肝血清樣本與Taqman方法測定乙肝血清樣本測定值的相關(guān)曲線。橫坐標代表該顯色方法測定的乙肝血清樣本的拷貝數(shù)(Ig值)，縱坐標代表Taqman方法測定的乙肝血清樣本的拷貝數(shù)(Ig值)。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合附圖，通過實例進一步說明本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0035]實施例1、乙肝血清標本的定性檢測
[0036] 1.PCR 反應(yīng)
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是:在PCR體系中加入檢測乙型肝炎病毒基因保守區(qū)域的特異性引物和DNAzyme探針對乙肝病毒基因保守區(qū)域進行擴增，擴增過程中利用核酸聚合酶5’ -3’外切酶活性對DNAzyme探針進行部分消化使其產(chǎn)生大量活性DNAzyme序列，最終通過檢測由活性DNAzyme序列產(chǎn)生的比色或熒光信號實現(xiàn)對乙肝病毒感染樣本的定性和定量檢測；該方法還適用于其他核酸樣本的檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是:所述DNAzyme探針為一發(fā)夾探針，在常溫下或未檢測到乙肝病毒基因序列時，通過探針的DNA堿基互補作用，活性DNAzyme序列被封閉在發(fā)夾中，不產(chǎn)生檢測信號；而在PCR過程中檢測到乙肝病毒基因序列時，DNAzyme探針打開并與目標核酸序列互補，引物延伸時核酸聚合酶利用其5’ -3’外切酶活性部分消化與目標核酸序列互補的DNAzyme探針并產(chǎn)生大量活性DNAzyme序列，從而獲得可檢測的顏色或熒光信號。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是:所述DNAzyme探針為經(jīng)3’ -端氨基修飾的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、3所述的基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是:一步反應(yīng)即可完成樣本 檢測，大大降低了操作復(fù)雜性，提高了方法的可靠性和實用性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是:當(dāng)待擴增的目標核酸序列為乙肝病毒S區(qū)的基因保守區(qū)域時，其特異性的正反向引物可以是(I)正向引物 HBV-F: 5，-CCTGGTTATCGCTGGATGTGT-3 ’ ；( 2 )反向引物 HBV-R: 5，-GGACAAACGGGCAACATACCTT-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、3所述的基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是:當(dāng)待擴增的目標核酸序列為乙肝病毒S區(qū)的基因保守區(qū)域時，其特異性的DNAzyme探針可以是5，-CCCTACCCATTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA-NH2-3，。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是引入了UNG防污染體系，進一步提高了方法的可靠性和實用性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNAzyme探針的乙肝病毒檢測方法，其特征是:當(dāng)活性DNAzyme為與hemin結(jié)合可以發(fā)揮具有過氧化物酶活性的DNAzyme時,可在乙肝病毒樣本的擴增產(chǎn)物中加入hemin以及如ABTS這樣的顯色底物和H2O2,利用DNAzyme/hemin復(fù)合物催化H2O2氧化顯色底物發(fā)生顏色變化，通過觀察顏色差異對乙肝病毒進行定性檢測，也可通過測定溶液在414nm處的光吸收值進行定量檢測。
【文檔編號】C12Q1/70GK103952497SQ201410161277
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】楊麗, 唐卓 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所