腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一套檢測小鼠腸道分節(jié)絲狀菌SFB鞭毛蛋白的方法與應(yīng)用，包括PCR方法、蛋白質(zhì)變性電泳與免疫印跡方法(SDS?PAGE?Western blotting)、細(xì)菌原位雜交結(jié)合免疫組化方法(FISH+IHC)。所述PCR方法為，設(shè)計合成了一對能特異性擴增SFB鞭毛蛋白Flic3基因的引物，使用該引物對樣品DNA進(jìn)行PCR擴增后，可以在凝膠電泳后檢測到與Flic3基因片段大小一致的DNA條帶。所述蛋白質(zhì)變性電泳與免疫印跡方法為，成功制備了兔抗SFB Flic3鞭毛蛋白的多克隆抗體，并可以使用該蛋白對樣品中是否存在SFB Flic3鞭毛蛋白進(jìn)行檢測。所述細(xì)菌原位雜交結(jié)合免疫組化方法為使用SFB16S rRNA基因特異常性探針和兔抗SFB Flic3鞭毛蛋白多克隆抗體檢測SFB鞭毛蛋白的表達(dá)情況、SFB細(xì)菌的形態(tài)及SFB與腸上皮的相互作用情況。本發(fā)明所涉及的檢測方法具有快速、直觀和表象的優(yōu)點。
【專利說明】腸道分節(jié)竺狀菌鞭毛蛋白的檢測方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種鞭毛蛋白的檢測，特別設(shè)計一種PCR方法檢測腸道分節(jié)絲狀菌鞭 毛蛋白的方法。 (二)【背景技術(shù)】
[0002] 腸道分節(jié)絲狀菌（SFB)是一種革蘭氏陽性菌，廣泛定殖于包括人體在內(nèi)的脊椎和 非脊椎動物腸道中。SFB定殖對宿主的免疫系統(tǒng)意義非常重大。通過小鼠動物實驗得知，SFB 能刺激宿主sIgA的釋放，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化與平衡，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的成熟等。同時，SFB與宿 主自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。但到目前為止，對Si^如何與宿主細(xì)胞相互作用還知之甚 少。
[0003] 細(xì)菌鞭毛基因是影響細(xì)菌定殖和宿主免疫調(diào)控反應(yīng)的重要功能基因。很多腸道細(xì) 菌，如沙口氏菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌均具有表達(dá)分泌鞭毛蛋白的能力。當(dāng)鞭毛蛋白粘 附到腸上皮基底部后可W啟動天然免疫反應(yīng)和鞭毛蛋白介導(dǎo)的促炎反應(yīng)。同時，也有研究 表明腸道細(xì)菌編碼的鞭毛蛋白具有調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)CD4T細(xì)胞分化的功能。鑒于細(xì)菌鞭毛蛋白 的重要生理功能，推測Si^鞭毛蛋白可能與其特異性定殖和免疫調(diào)控功能相關(guān)。SFB全基因 組測序分析也發(fā)現(xiàn)，Si^基因組編碼46個鞭毛和趨化相關(guān)蛋白，具有一套完整的生物合成鞭 毛蛋白的基因。比較基因組學(xué)分析表明，雖然與5!^分類相近的大部分梭菌也編碼鞭毛蛋 白，但只有SFB鞭毛蛋白具有被宿主化R5受體識別的位點。體外實驗也表明，SFB鞭毛蛋白 Flic2、Flic3和Flic4確實能與化R5受體相互作用。因此有必要對SFB鞭毛蛋白與宿主的相 互作用及其生理功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。但到目前為止，電鏡觀察并沒有發(fā)現(xiàn)到SFB鞭毛蛋 白的存在，所W建立Si^鞭毛蛋白的檢測方法將為進(jìn)一步5!^的定殖及5!^對宿主免疫調(diào)控 機制的研究奠定基礎(chǔ)。 (Ξ)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 到目前為止，電鏡觀察并沒有發(fā)現(xiàn)SFB細(xì)菌外膜有鞭毛存在。本發(fā)明目的是使用 Western blotting、質(zhì)譜鑒定和細(xì)菌原位雜交結(jié)合巧光免疫組化的方法檢測小鼠腸道內(nèi) SFB鞭毛蛋白的表達(dá)情況。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 第一，本發(fā)明提供一種腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白的檢測方法，所述方法為:提取待 測腸道內(nèi)容物DNA為模板，WSFB F1 iC3-F和SFB F1 iC3-R為引物進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物長度與mflic3基因長度相同（1100-1300bp，優(yōu)選1200bp)，則 待測腸道含有腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白；所述mflic3基因核巧酸序列為SEQ ID NO.2所示；
[0007] SFB FliC3-F:5'-ATG ΑΤΑ ATT AAY CAC AAT ATG AAT G-3'，
[0008] SFB FliC3-R:5'-TCT ΥΑΑ ΚΑΤ WGA AAG WAC TTG TTG Τ-3'。
[0009] 進(jìn)一步，所述PCR擴增體系為25化：2.5化 2.5mmol dNTP，2.5yL lOXEX Taq buffer, 10皿ol上、下游引物各化L，0.：3yL 5U/化EX Taq polymerase和lOOng模板，補水至 2f5]iL。
[0010] 進(jìn)一步，所述 PCR 擴增程序為:94°C45s 1 個循環(huán);941：3〇3,5〇1：3〇3,721：453,30個 循環(huán)；72°C5min，1個循環(huán)。
[0011] 第二，本發(fā)明還提供一種腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白的檢測方法，所述方法將待測 腸道內(nèi)容物中腸道菌群蛋白W兔抗mflic3基因編碼蛋白多克隆抗體為二抗進(jìn)行SDS-PAGE 和Western blotting檢測，若腸道菌群蛋白大小與mflic3基因編碼蛋白大小（約50kD) - 致，則待測腸道含有腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白；所述兔抗mflic3基因編碼蛋白多克隆抗體 Wmflic3基因編碼蛋白為抗原免疫兔制備獲得，所述mflic3基因編碼蛋白的氨基酸序列為 沈Q ID NO. 1所示。
[0012] 進(jìn)一步，所述SDS-PAGE獲得的膠內(nèi)蛋白經(jīng)過膜酶酶切法提取膚段進(jìn)行質(zhì)譜鑒定， 若含有5!^鞭毛蛋白F1 ic3特異性膚段，則待測腸道含有Si^鞭毛蛋白且表達(dá);所述Si^鞭毛 蛋白Flic3特異性膚段氨基酸序列為下列之一：
[0013] (1化LGLGGVNVATT孤AK;(2)TDLENVNTLGEGTFK;
[0014] (3化邸TIASTDnTAE化QAAESR; (4HTNDTEFNGSK化NGDKSG?。?br>[0015] (5)TDLENVNTLGEGTFK;(6化LGLGGVNISTAEDAK;
[0016] (7)LEHTIASTDNTAE化QAAESR;(8化LGLGGVSVSTAEDSK;
[0017] (g)QINFTIENTAQQK。
[0018] 本發(fā)明提供一對擴增SFB鞭毛蛋白編碼基因 flic3的PCR引物，并通過克隆文庫測 序和DNA序列同源性比較分析驗證了該引物的特異性。所述PCR引物設(shè)計方法如下：從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載已發(fā)表的SFB鞭毛蛋白Flic3基因全長序列，利用oligo 6軟件設(shè)計擴增Flic3 基因全長的PCR引物，然后將設(shè)計好的引物序列發(fā)送給上海生物工程有限公司進(jìn)行引物合 成。合成好的引物用無菌水稀釋到終濃度1化mol/L。使用QIAGEN公司的糞便細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒抽提小鼠回腸和育腸內(nèi)容物細(xì)菌基因組DNA。使用美國Applied Biosystems公 司的PCR儀進(jìn)行PCR擴增。使用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。將PCR產(chǎn)物凝膠電泳后 與預(yù)期目的片段大小一致的DNA條帶，使用OMEGA膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。使用化KaRa公 司的PMD18-T載體試劑盒，將膠回收后的PCR產(chǎn)物連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到TaKaRa公司 的D冊α化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物涂布到含有徑節(jié)青霉素(終濃度50μg/ml)和 X-gal (終濃度10μg/ml)的LB平板上。平板倒置放入37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時后，用高壓滅 菌過的牙簽將白色單菌落挑選接種到含有5ml LB液體培養(yǎng)基和終濃度50μg/ml徑節(jié)青霉素 的LB液體培養(yǎng)基試管中。試管放入37度細(xì)菌培養(yǎng)搖床上，200轉(zhuǎn)每分鐘振蕩培養(yǎng)過液后，將 菌液送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。
[0019] LB平板培養(yǎng)基終濃度組成:膜蛋白腺lOg/L、酵母提取物5g/L、氯化鋼lOg/L，瓊脂 12g/L，溶劑為水，pH值自然。
[0020] LB液體培養(yǎng)基終濃度組成:膜蛋白腺lOg/L、酵母提取物5g/L、氯化鋼lOg/L，溶劑 為水，pH值自然。
[0021] 將測序所獲得的基因序列與NCBI已發(fā)表的flic3基因序列進(jìn)行同源性比對。同時 在NCBI數(shù)據(jù)中使用BLAST對所得序列進(jìn)行初步鑒定，測序所得序列為mflic3基因。
[0022] 將測序獲得的mflic3基因序列從PMD18-T載體亞克隆到原核表達(dá)載體陽T-2&1上。 然后將陽T-28a-mflic3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到化KaRa公司的化2UDE3)大腸桿菌中。使用IPTG誘導(dǎo)SFB 鞭毛蛋白在大腸桿菌中的大量表達(dá)。然后使用HIS*BINDPURIFICATION KIT(millipore, 70239)純化Sra鞭毛蛋白（即mflic3基因編碼蛋白）。使用純化的Sra鞭毛蛋白免疫兔子，獲 得兔抗5!^鞭毛蛋白的多克隆抗體。使用兔抗Si^鞭毛蛋白的多克隆抗體為二抗對腸道菌群 蛋白中SFB鞭毛蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，進(jìn)一步驗證PCR檢測結(jié)果。同時對SFB鞭毛蛋白在 SDS-PAGE膠上相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行切膠后酶消化與蛋白質(zhì)譜鑒定，從分子水平上進(jìn)一步鑒定PCR 擴增產(chǎn)物是否為SFB鞭毛蛋白。
[0023] 第Ξ，本發(fā)明使用細(xì)菌原位雜交和巧光免疫組化的方法觀察小鼠回腸和育腸樣品 中SFB鞭毛蛋白的表達(dá)。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明方法可W通過特異引物PCR 擴增的方法快速檢測樣品中是否存在編碼Sra鞭毛蛋白Flic3的基因；可W通過werstern blotting檢測SFB鞭毛蛋白Flic3在腸腔中是否有表達(dá);通過細(xì)菌原位雜交和巧光免疫組化 可W清楚的看到SFB鞭毛蛋白的表達(dá)情況、SFB細(xì)菌的形態(tài)及SFB與腸上皮的相互作用情況。 (四）
【附圖說明】
[0025] 圖1是SFB16S rRNA基因特異引物PCR擴增后檢測小鼠回腸內(nèi)容物中Sra存在情況 的電泳圖。泳道1為DNA marker,泳道2-7分別為6只小鼠腸道樣品的PCR擴增結(jié)果，泳道8為 PCR陰性對照。
[0026] 圖2是SFB鞭毛蛋白基因 f 1 ic3特異引物PCR擴增后檢測小鼠回腸內(nèi)容物中SFB存在 情況的電泳圖。泳道1為DNA marker,泳道2-7分別為6只小鼠腸道樣品的PCR擴增結(jié)果，泳道 8為PCR陰性對照。
[0027] 圖3是純化的SFB鞭毛蛋白的SDS-PAGE和Wester blotting檢測圖。A為SDS-PAGE 圖，泳道1為蛋白marker,泳道2-3分別為純化的Flic3鞭毛蛋白。B為Wester blotting圖，泳 道1為蛋白marker,泳道2為純化的Flic3鞭毛蛋白。
[0028] 圖4是蛋白印跡檢測sra鞭毛蛋白存在情況圖。泳道1為蛋白marker,泳道2為純化 的Flic3鞭毛蛋白樣品，泳道3為育腸內(nèi)容物提取的蛋白樣品，泳道5為回腸粘膜刮取物提取 的蛋白樣品。
[0029] 圖5是細(xì)菌原位雜交結(jié)合免疫組化檢測小鼠回腸5!^鞭毛蛋白的表達(dá)情況。A-D為 普通巧光顯微鏡下觀察到的結(jié)果，E-H為掃描電鏡下觀察到的結(jié)果。A和E為DAPI染色的結(jié) 果;B和F為Si^特異性控針雜交后的結(jié)果;C和G為5!^鞭毛蛋白Flic3抗體雜交后的結(jié)果;D為 B圖和C圖疊加后的結(jié)果;Η為F圖和G圖疊加后的結(jié)果。
[0030] 圖6是細(xì)菌原位雜交結(jié)合免疫組化檢測小鼠育腸5!^鞭毛蛋白的表達(dá)情況。A-D為 普通巧光顯微鏡下觀察到的結(jié)果。A為DAPI染色的結(jié)果;Β為SFB特異性控針雜交后的結(jié)果;C 為SFB鞭毛蛋白F1 ic3抗體雜交后的結(jié)果;D為B圖和C圖疊加后的結(jié)果。 (五)
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0032] 實施例1:小鼠 SFB鞭毛蛋白Flic3PCR擴增引物的設(shè)計與檢測。
[0033] 1、小鼠腸道樣品細(xì)菌基因組DNA提取與PCR檢測
[0034] (1)腸道樣品細(xì)菌基因組DM提取:6只8周齡雄性ICR小鼠購自上海史萊克動物公 司，并喂養(yǎng)在浙江大學(xué)實驗動物中屯、。小鼠斷頸處死后進(jìn)行腹部解剖，分別收集回腸末端 (約6-lOcm長）內(nèi)容物和盲腸內(nèi)容物。稱取0.2克腸道內(nèi)容物樣品，使用PBS緩沖液(使用無菌 水將生工購買的20 X PBS稀釋成1 X PBS緩沖液)進(jìn)行重懸，5000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、5分鐘，棄掉上 清。然后將得到的細(xì)菌沉淀使用糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Mini Κ i t，QIAGEN，51504)提取腸道樣品中的細(xì)菌基因組DM。
[0035] (2)SFB 16s rRNA基因和flic3鞭毛基因的PCR擴增:所用PCR引物均由上海生物工 程有限公司合成，然后用無菌水稀釋到終濃度10皿Ol/L。
[0036] 通過文獻(xiàn)報道的擴增SFB 16s rRNA基因的PCR特異引物（779F:5/-TGT GGG TTG TGA ΑΤΑ ACA AT-3'和 1008R:5'-GCG GGC TTC CCT CAT TAC AAG G-3')擴增SFB特異片段， W檢測出小鼠腸道樣品中SFB陽性的實驗樣品。W陽性小鼠腸道內(nèi)容物細(xì)菌基因組DNA為模 板，W779F和1008R為引物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)產(chǎn)物通過2%瓊脂糖（SunaiineBiOiAOOOg- iOO) 凝膠電泳，結(jié)果見圖 1。
[0037] 在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得編碼鞭毛蛋白Flic3基因全長序列（SEQIDN0.3所示SFB- mouse-Japan_Flic3)，利用oligo 6軟件設(shè)計特異性擴增Flic3的PCR引物。PCR上游引物為 SFB FliC3-F:5'-ATG ΑΤΑ ATT AAY CAC AAT ATG AAT G-3'，下游引物為SFBFliC3-R:5'- TCT YAA KAT WGA AAG WAC TTG TTG T-3'dW小鼠細(xì)菌基因組DNA為模板，WSFB FliC3-F 和SFB FliC3-R為引物進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)產(chǎn)物通過1%瓊脂糖(SunaiineBio，A0009-100)凝 膠電泳，結(jié)果見圖2。
[0038] PCR檢測為25化反應(yīng)體系，具體組成為2.扣LdNTP(2.5mmol)、2.扣L10XEXTaq buffer、上下游引物（10皿〇1)各化L、0.：3yL EX Taq polymerase(TaKaRa，抓AiL)和lOOng DNA模版，補水至25化。
[0039] PCR 反應(yīng)程序為 94°C45s 1 個循環(huán)；941：303,501：303,721：453,30個循環(huán)；721： 5min，1 個循環(huán)。PCR儀為美國Applied Biosystems產(chǎn)品。
[0040] 從圖1可W看到SFB 16s rRNA基因 PCR檢測結(jié)果表明，所購買的6只小鼠腸道樣品 中均存在SFB菌。圖2結(jié)果表明，從運6只小鼠中均能檢測至化FB鞭毛蛋白flic3基因。
[0041 ] 2、小鼠 SFB鞭毛蛋白F1 ic3PCR擴增引物的特異性檢測
[0042] (1)小鼠5!^鞭毛蛋白Flic3PCR產(chǎn)物膠回收：同步驟1，選取3只小鼠的回腸和育腸 內(nèi)容物樣品，提取DNA模板，WSFB F1 iC3-F和SFB F1 iC3-R為引物，按W上PCR體系和程序?qū)?每個樣品進(jìn)行PCR擴增，然后將電泳結(jié)果中與目的片段大?。s1200bp，核巧酸序列為SEQ ID NO.3所示)一致的條帶使用OMEGA膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物切膠純化回收。
[0043] (2)PCR擴增產(chǎn)物連接和轉(zhuǎn)化：通過pMD? 18-T Vector Cloning Kit(Takara, 6011)將步驟（1)純化后的PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD18-Τ連接，然后轉(zhuǎn)化到化KaRa公司購買的 D冊α化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將構(gòu)建的克隆文庫涂布到添加氨節(jié)青霉素(終濃度50μg/ml)和 X-Gal(終濃度10μg/ml)的LB平板上。37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時后，從平板上隨機挑選10個W 上的白色菌落到含5ml添加終濃度50μg/ml徑節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37度進(jìn)行 擴大培養(yǎng)，然后將菌液送上海生物工程有限公司使用M13F和M13R引物進(jìn)行雙向測序，獲得 66條SFB鞭毛蛋白flic3基因序列。
[0044] LB平板培養(yǎng)基終濃度組成:膜蛋白腺lOg/L、酵母提取物5g/L、氯化鋼lOg/L，瓊脂 12g/L，溶劑為水，pH值自然。
[0045] LB液體培養(yǎng)基終濃度組成:膜蛋白腺lOg/L、酵母提取物5g/L、氯化鋼lOg/L，溶劑 為水，pH值自然。
[0046] (3)SFB鞭毛蛋白flic3基因同源性比對分析:將上海生物工程有限公司測得的SFB 鞭毛蛋白flic3基因使用DNAStar軟件包中的MegAlign進(jìn)行同源性比對和分析。結(jié)果如表1 所示，測序所得的66條SFB鞭毛蛋白flic3基因與NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的SFB-mouse-Japan Flic3基因均具有較高的同源性。將flic3基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，然后將 序列相似性達(dá)到100%的氨基酸序列只保留一條，共獲得具有同源性差異的氨基酸序列36 條，其中重復(fù)性最高的SFB鞭毛蛋白mFlic3(氨基酸序列SEQ ID N0.1，核巧酸序列為SEQ ID NO.2所示），W該蛋白作為腸道內(nèi)容物中SFB鞭毛蛋白檢測的判定依據(jù)。
[0047] 表1 5!^鞭毛蛋白flic3基因同源性比對分析 [004引
[0049] 實施例2:蛋白質(zhì)變性電泳和免疫印跡檢測小鼠 SFB鞭毛蛋白
[0050] (1)小鼠 SFB鞭毛蛋白的體外表達(dá)與純化:從實施例1測序獲得的66條序列中，選擇 重復(fù)性最高的SFB鞭毛蛋白mFlic3(氨基酸序列SEQ ID N0.1，核巧酸序列為SEQ ID N0.2)， 通過PCR擴增的方法給目的基因5'端和3'端分別加上Ba^l I和Not I酶切位點；然后利用雙 酶切后連接的方法使用化centre的快速連接試劑盒將Sra鞭毛蛋白編碼基因連接到表達(dá)載 體PET-2&1相應(yīng)的蛋白編碼框內(nèi)。然后將構(gòu)建好的質(zhì)粒PET28a-mflic3轉(zhuǎn)化到化2UCD3)感 受態(tài)細(xì)胞中。1L的LB培養(yǎng)基中加入終濃度50μg/ml的卡那霉素（購自上海生物工程有限公 司），37度搖床中，200巧m振蕩培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌0D600達(dá)到0.6左右時添加 ImM的IPTG(異丙基-β- D-硫代半乳糖巧），16度搖床中，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。8000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、5分鐘，收集細(xì)菌 沉淀利用郵泌11化、巧:.1日316']^義（]\111119〇'6,71456)提取蛋白，然后使用^5*81州 PURIFICATION KIT(millipore，70239)純化重組的mFlic3蛋白，獲得mFlic3蛋白（氨基酸序 列沈Q ID NO. 1，核巧酸序列為沈Q ID NO.2)。
[0051] (2)兔抗Si^鞭毛蛋白多克隆抗體的制備：
[0化2] a)免疫前采血約5ml
[0053] 第1天第一次免疫:每只兔子免疫20化g純化獲得的mFlic3蛋白，使用完全弗氏佐 劑；
[0054] 第15天第二次免疫:免疫劑量和免疫方法同第1次免疫；
[0055] 第29天第Ξ次免疫：每只兔子免疫10化g純化的mFlic3蛋白，使用不完全弗氏佐 劑；
[0化6] 第35天第1次采血15-30ml JLISA檢測；
[0057] 第42天第2次采血15-30ml JLISA檢測；
[0058] 第43天第四次免疫:免疫劑量和免疫方法同第3次免疫；
[0059] 第49天第3次采血15-30ml JLISA檢測；
[0060] 第51天ELISA轉(zhuǎn)陽后收集30-50ml陽性血，即兔抗mFlic3血清，安排純化。
[0061] b)血清化ISA檢測
[0062] 1)將純化的111。11。3蛋白分別按104旨/1111、2.化旨/1111、1.254旨/1111、0.62扣旨/1111、0.312 μg/ml濃度溶解于包被液中。包被液:50mM Na2C〇3 (pH9.6)，20mM Tris-HCl (P冊.5);
[0063] 2)在96孔板中分別加入步驟l)mFlic3蛋白和PBS緩沖液各l(K)yL，4°C過夜；
[0064] 3)倒空液體并拍干殘留液體，洗涂液沖洗3次;洗涂液為PBST或純水；
[0065] 4)每孔加200化封閉液，37°C解育1小時；封閉液:一般封閉用BSA、脫脂奶粉、酪蛋 白、明化等；
[0066] 5)倒空液體并拍干殘留液體，洗涂液沖洗3次；
[0067] 6)每孔力日100化步驟a)制作的兔抗mF 1 i c3血清，37 °C解育1小時；
[006引7)倒空液體并拍干殘留液體，洗涂液沖洗3次；
[0069] 8)每孔加10化L羊抗兔免疫球蛋白G二抗，37 °C解育1小時；
[0070] 9)倒空液體并拍干殘留液體，洗涂液沖洗5次；
[0071] 10)拍干孔中殘留液體，每孔加1(Κ)化化學(xué)發(fā)光顯色液，37°C避光顯色lOmin;
[0072] 11)每孔加50化2M出S化終止顯色，并立即讀取450皿0D值。
[0073] 血清化ISA檢測均轉(zhuǎn)陽（1:4000,0D值〉1.0)，安排Protein A親和純化并進(jìn)行抗體 ELISA鑒定得到兔抗SFB鞭毛蛋白多克隆抗體(即mSFB-FliC3抗體）。
[0074] (3)SDS-PAGE聯(lián)合Western-blotting檢測純化蛋白的質(zhì)量
[0075] SDS-PAGE:將30化步驟（1)制備好的蛋白樣品與10化4 X NuPAGE.苦:LDS樣品緩沖 液(NP0007，Invitrogen?)充分混合，70度水浴10分鐘。之后12000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、15分鐘，取 上清30化加入 NuPAGi強' NovcxS 10 %Bis-TriS凝膠（NP0315B0X，Invitrogen?)的泳道 中，電泳液為lXNuPAGE?MES(NP0002，InvitrogenTM)，在電泳系統(tǒng)（NW2000，Life technologies)中電泳，電泳電壓為200伏，時間為35分鐘。待蛋白電泳結(jié)束，將凝膠小屯、取 出放在去離子水中漂洗一下，再將凝膠在新的去離子水中煮開1分鐘，之后在60轉(zhuǎn)每分鐘的 搖床上振蕩5分鐘;再將凝膠置于快速考馬斯亮藍(lán)染色液(P50116,海利克思）中煮開，之后 在搖床上W60轉(zhuǎn)每分鐘的速度染色5分鐘；倒掉染色液將凝膠在去離子水中煮開1分鐘，并 在搖床上漂洗，10分鐘左右可見凝膠上清晰的蛋白條帶(如圖3中A所示）。
[0076] Western-Blotting:待SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后，將其小屯、取出進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，所使 用的電轉(zhuǎn)膜為孔徑0.45皿的聚偏二氣乙締膜(polyvin}didene fluoride，PVDF)，電轉(zhuǎn)時恒 定電流200毫安，電轉(zhuǎn)時間50分鐘。電轉(zhuǎn)結(jié)束后將轉(zhuǎn)印了蛋白膜用WesternTM S化ndard kit (Ra化i t)試劑盒進(jìn)行抗體標(biāo)記，簡要步驟如下：
[0077] 1)在20化的WB-1溶液中加入化g的mSFB-FliC3抗體并充分混勻，室溫放置40分鐘 W上備用；
[0078] 2)電轉(zhuǎn)膜上加入10ml 0肥-冊UR預(yù)處理液并在搖床上解育5分鐘；
[0079] 3)倒掉預(yù)處理液，用1 X 0肥-冊UR洗液快速對轉(zhuǎn)印膜漂洗兩次；
[0080] 4)將步驟1)中已經(jīng)解育好的一抗加入到10ml含兔二抗的WB-2溶液中混勻，與轉(zhuǎn)印 膜在搖床上共解育40分鐘；
[0081 ] 5)將抗體解育好的轉(zhuǎn)印膜用PBS洗液漂洗Ξ遍，每次10分鐘；
[0082] 6)使用化學(xué)發(fā)光試劑盒Immun-StarTM HRP(1705060，Bi〇-Rad)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，并 使用發(fā)光成像儀(6200,化non)檢測，結(jié)果見圖3中B所示。
[0083] (4)腸道菌群的富集和蛋白提取
[0084] 將8-10周ICR雄性小鼠斷頸處死，解剖腹部，分別收集回腸末端(約6-lOcm長）內(nèi)容 物，同時刮取黏膜。50ml 1 X PBS重懸，冰上靜置5分鐘，收集上清。在4°C環(huán)境下，8000轉(zhuǎn)每分 鐘離屯、10分鐘。收集沉淀，加入細(xì)菌裂解液BugBuslcr霞Master Mix(Millipore，71456)和含 邸ΤΑ的蛋白酶抑制劑(Merck，C500027-0001)，冰上裂解，并超聲300w，lOs/lOs，5分鐘。4°C， 12000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、15分鐘，收集上清，獲得腸道菌群蛋白。
[0085] (5)SDS-PAGE和Western blotting檢測腸道Flic3蛋白的表達(dá)
[00化]按照W上SDS-PAGE和western blotting的操作方法對腸道菌群蛋白使用步驟（2) 制備的兔抗SFB鞭毛蛋白多克隆抗體做為二抗進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4所示，從回腸樣品和育 腸樣品中均檢測到了與SFB鞭毛蛋白mFlic3大小一致的蛋白。
[0087] (6)蛋白膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定
[0088] 步驟（5)SDS-PAGE膠內(nèi)蛋白經(jīng)過膜酶酶切法提取膚段，通過Mass Spectrometer 化TQ Orbitrap Elite，Thermo Fisher)進(jìn)行膚段識別。沈QUEST HT捜索引擎對LC/MS/MS所 得的原始文件進(jìn)行捜庫比對，參考數(shù)據(jù)庫為uniprot-proteome-mouse數(shù)據(jù)庫。通過蛋白條 帶切膠與酶消化后質(zhì)譜分析，鑒定到了 SFB鞭毛蛋白特異性的膚段。
[0089] 表2腸道樣品中鑒定到的SFB Flic3特異的蛋白膚段
[0090]
[0092] 實施例3:細(xì)菌原位雜交結(jié)合免疫組化檢測5!^鞭毛蛋白
[0093] 收集小鼠回腸末端和盲腸內(nèi)容物，向其中加30ml IXPBS進(jìn)行重懸，600轉(zhuǎn)每分鐘 離屯、5分鐘，收集上清，再將收集的上清，8000轉(zhuǎn)每分鐘離屯、5分鐘，棄上清，收集沉淀（菌 體）。滿旋將沉淀離散，后加入2ml 4 %多聚甲醒水溶液，室溫（25 °C )固定化，4 °C冰箱固定 16-2地。菌液用水稀釋500倍后，取5(Κ)化稀釋液滴在防脫片載玻片上，37°C烘干；用PBS洗3 遍，每遍3min。
[0094] 1)制作濕盒：用5 X SSC( 35ml) +甲酯胺（35ml)置于濕盒內(nèi)。
[0095] 2) 30 %出化1份+9份純甲醇混合液室溫處理lOmin dDEPC水洗3次，每次Imin;
[0096] 3)載玻片置于濕盒內(nèi)，用0.2mol/L鹽酸水溶液滴于組織上，常溫15min，用DEPC水 洗2次，每次Imin(鹽酸可中和帶電荷的堿性蛋白，降低背景）；
[0097] 4)蛋白酶K覆蓋組織，分子雜交儀中37°C20min。蛋白酶K可W消化和暴露被遮蔽的 祀核酸，增加探針的結(jié)合效率。
[0098] 5)用0.2%或O.lmol/L甘氨酸洗液洗Imin(現(xiàn)用現(xiàn)配），終止蛋白酶K。
[0099] 6)PBS洗兩次，每次一分鐘。
[0100] 7)用4%PFA多聚甲醒固定組織lOmin。
[0101] 8)PBS洗Ξ次，每次 Imin。
[0102] 9)用乙酸酢溶液抑=8.0(乙酷化作用，降低背景)室溫洗5min，2次（乙酸酢溶液配 審IJ:每50mlS乙醇胺溶液中加入12化L乙酸酢，現(xiàn)用現(xiàn)配，按比例配制，用多少配多少）。
[0103] 10)用PBS 洗 5 次，每次 Imin。
[0104] 11)用5XSSC PH 7.5洗兩次，每次Imin。
[0105] 12)切片放置濕盒內(nèi)，用預(yù)雜交液覆蓋組織，65°C預(yù)雜交化。
[0106] 13)500ng/ml Cy3-labeled pube探針覆蓋切片，在雜交儀內(nèi)65°C黑暗反應(yīng)4她。
[0107] 14)用2XSSC PH=7.5,室溫洗 1 次，Imin。
[010引 15)用甲酯胺加4XSSC PH=4.5 1:1混合液在65°C洗Ξ次，每次20min。
[0109] 16)用PBS洗5次，每次Imin,室溫。
[0110] 17)將切片置于濕盒內(nèi)，用封閉液覆蓋切片，室溫反應(yīng)至少30min。
[0111] 18)滴加兔來源的一抗抗體(1:200)，371：6〇111111反應(yīng)，？85洗3遍，每遍5111111。
[0112] 19)滴加 FITC goat anti-ral3bit IgG(H+L)(l:500)，避光37°C30min反應(yīng)，PBS洗3 遍，每遍5min。
[0113] 20)DAPI 染核 5min，PBS 洗 3 遍，每遍 5min。
[0114] 21)滴加防澤滅劑，蓋蓋玻片。指甲油封片，巧光顯微鏡觀察。
[0115] 如圖5和圖6所示，我們在回腸和育腸內(nèi)容物樣品中觀察到了 SFB鞭毛蛋白Flic3的 存在。
[0116] 總之，本發(fā)明根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的小鼠 SFB鞭毛蛋白Flic3基因序列，設(shè)計 合成了擴增SFB鞭毛蛋白Flic3基因的PCR引物，PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)其檢測準(zhǔn)確率與文獻(xiàn)報道 的SFB 16S rRNA基因特異引物一致?？寺∥膸鞙y序發(fā)現(xiàn)，獲得的66條序列均為5!^鞭毛蛋白 Flic3基因同源序列，與已發(fā)表的SFB-mouse-化pan Flic3同源性在84.4%-97.5%。使用兔 抗SFB鞭毛蛋白多克隆抗體，Western blotting檢測到了與鞭毛蛋白大小一致的蛋白條帶， 同時通過蛋白條帶切膠與酶消化后質(zhì)譜分析，鑒定到了 SFB鞭毛蛋白特異性的膚段。結(jié)合細(xì) 菌原位雜交和免疫組化的方法從小腸和育腸樣品中檢測到了 SFB鞭毛蛋白的存在。
【主權(quán)項】
1. 一種腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白的檢測方法，其特征在于所述方法為：提取待測腸道 內(nèi)容物DNA為模板，以SFB FliC3-F和SFB FliC3-R為引物進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，擴增產(chǎn)物長度與mflic3基因長度相同，則待測腸道含有腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛 蛋白 ；所述mflic3基因核苷酸序列為SEQIDN0.2所示； SFB FliCS-FiS^ATG ΑΤΑ ATT AAY CAC AAT ATG AAT G-37 , SFB FliCS-RiS^TCT YAA KAT WGA AAG WAC TTG TTG T-37 〇2. 如權(quán)利要求1所述腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白的檢測方法，其特征在于所述PCR擴增體 系為25yL:2.5yL 2.5mmol dNTP，2.5yL 10XEX Taq buffer，10ymol上、下游引物各lyL， 0.3yL 5U/yL EX Taq polymerase和lOOng模版，補水至25yL。3. 如權(quán)利要求1所述腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白的檢測方法，其特征在于所述PCR擴增程 序為 94°C45s 1 個循環(huán)；941€3〇8,5〇1€3〇8,721€458,30個循環(huán) ；721€5111丨11，1個循環(huán)。4. 一種腸道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白的檢測方法，其特征在于所述方法是將待測腸道內(nèi)容 物中腸道菌群蛋白以兔抗mflic3基因編碼蛋白多克隆抗體為二抗進(jìn)行SDS-PAGE和Western blotting檢測，若腸道菌群蛋白大小與mflic3基因編碼蛋白大小相同，則待測腸道含有腸 道分節(jié)絲狀菌鞭毛蛋白；所述兔抗mflic3基因編碼蛋白多克隆抗體以mflic3基因編碼蛋白 為抗原免疫兔制備獲得，所述mflic3基因編碼蛋白的氨基酸酸序列為SEQ ID NO. 1所示。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于SDS-PAGE獲得的膠內(nèi)蛋白經(jīng)過胰酶酶切法提 取肽段進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，若含有SFB鞭毛蛋白FI ic3特異性肽段，則待測腸道含有SFB鞭毛蛋白 且表達(dá);所述SFB鞭毛蛋白FI ic3特異性肽段氨基酸序列為下列之一： (1)ELGLGGVNVATTDDAK；(2)TDLENVNTLGEGTFK； (3)LEHTIASTDnTAENLQAAESR；(4)ITNDTEFNGSKVLNGDKSGEK； (5)TDLENVNTLGEGTFK；(6)ELGLGGVNISTAEDAK； (7)LEHTIASTDNTAENLQAAESR；(8)ELGLGGVSVSTAEDSK； (9)QINFTIENTAQQK。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011281SQ201610579365
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月19日
【發(fā)明人】陳華海, 尹業(yè)師, 王欣, 項春生
【申請人】浙江大學(xué), 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院