本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

擬態(tài)弧菌系革蘭陰性弧菌，具有單鞭毛，有動(dòng)力，與副溶血弧菌、霍亂弧菌一樣屬正常海洋菌叢，廣泛存在于自然界河水、海水和海產(chǎn)品中。菌株在不含鈉或僅含1％氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)良好，可自水生動(dòng)物中分離出來(lái)。

在美國(guó)、北美、新西蘭、孟加拉及非洲國(guó)家均有擬態(tài)弧菌致病報(bào)道，我國(guó)福建、北京、上海、江蘇及浙江地區(qū)也有發(fā)病，多呈散發(fā)或暴發(fā)，一年四季均有發(fā)病，以夏季為多；潛伏期3～72h，平均24h；主要癥狀有腹瀉、嘔吐、腹痛，以及大便呈水樣或粘液血便；發(fā)病年齡不限，但小兒少見。因此對(duì)擬態(tài)弧菌的檢測(cè)在公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義。

目前，對(duì)擬態(tài)弧菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進(jìn)而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但是存在檢測(cè)效率低、檢測(cè)目標(biāo)單一、靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足。為滿足致病菌快速檢測(cè)的要求，發(fā)展了酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)法(vidas-chl)、酶免疫法(eia)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、膠體金試紙條法、api生化鑒定試紙條法、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(lamp)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光pcr等方法。其中，vidas-chl法、eia法、膠體金試紙法和api法均存在特異性差、靈敏度低等缺陷，而沒有得到廣泛應(yīng)用；lamp法，作為一種新興的檢測(cè)方法，盡管極大地提高了檢測(cè)效率，又降低了檢測(cè)成本，但是產(chǎn)生的假陽(yáng)性率較高。pcr技術(shù)作為一種高度靈敏、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法在諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其在病原體檢測(cè)方面取得了革命性的成果，成為核酸快速檢測(cè)的一個(gè)金標(biāo)準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)之上，又發(fā)展了dna探針技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)和pcr結(jié)合變性高效液相色譜(dhplc)技術(shù)等,而pcr引物的設(shè)計(jì)成為了制約該類檢測(cè)方法成敗的關(guān)鍵性因素，常規(guī)的pcr引物設(shè)計(jì)，不僅需要反復(fù)比對(duì)引物的特異性，而且需要優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)與反應(yīng)條件，尤其是退火溫度更是進(jìn)行反復(fù)優(yōu)化，以防止非特異性擴(kuò)增，在這些條件的制約下選取的引物極易影響擴(kuò)增的有效性和特異性。此外，熒光檢測(cè)設(shè)備普遍售價(jià)偏高，也在一定程度上限制了這類檢測(cè)方法的推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和快速的基于rpa-iac技術(shù)的檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、不需要特殊的儀器和適用范圍廣的rpa-iac引物及內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):

本發(fā)明第一方面提供了引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列，所述引物對(duì)包含seqidno：1所示的核苷酸序列和seqidno：2所示的核苷酸序列，所述內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段包含seqidno：3所示的核苷酸序列。

本發(fā)明第二方面提供了所述的引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

在一優(yōu)選例中，所述制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品包括：制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品，以及制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)病原菌為或候選為擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品。

本發(fā)明第三方面提供了一種試劑盒，包括所述的引物對(duì)和包含有所述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒。

在一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑。

在一優(yōu)選例中，所述rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑包括來(lái)自twistdx公司的rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits所包含的試劑。

在一優(yōu)選例中，還包括dna提取試劑。

在一優(yōu)選例中，所述dna提取試劑包括來(lái)自天根生化科技有限公司的貨號(hào)為dp432的動(dòng)物基因組dna提取試劑盒所包含的試劑。

在一優(yōu)選例中，所述dna提取試劑還包括來(lái)自天根生化科技有限公司貨號(hào)為dp302的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒所包含的試劑。

在一優(yōu)選例中，還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

本發(fā)明第四方面提供了所述的試劑盒在檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌，或制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

在一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌包括：檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌，以及檢測(cè)或輔助檢測(cè)病原菌是否為或候選為擬態(tài)弧菌。

在一優(yōu)選例中，所述制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品包括：制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品，以及制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)病原菌為或候選為擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品。

本發(fā)明第五方面提供了一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的rpa-iac方法，包括使用所述的引物對(duì)和包含有所述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)?；蛩鲈噭┖械牟襟E。

在一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌包括：檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌，以及檢測(cè)或輔助檢測(cè)病原菌是否為或候選為擬態(tài)弧菌。

在一優(yōu)選例中，所述的方法包括如下步驟：

1)rpa-iac擴(kuò)增

以生物樣品或病原菌含有的dna為模板與所述的引物對(duì)和包含有所述的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)?；蛩鲈噭┖羞M(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增。

2)根據(jù)rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌，或病原菌是否為或候選為擬態(tài)弧菌。

任選的，在步驟1)之前還包括在生物樣品或病原菌中提取dna的步驟。

在一優(yōu)選例中，所述在生物樣品或病原菌中提取dna是采用天根生化科技有限公司的貨號(hào)為dp432的動(dòng)物基因組dna提取試劑盒或天根生化科技有限公司貨號(hào)為dp302的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒進(jìn)行。

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：

若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有大小為467bp的目標(biāo)基因片段，或同時(shí)擁有大小分別為334bp、467bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段和目標(biāo)基因片段，則判定為生物樣品感染擬態(tài)弧菌，或病原菌為或候選為擬態(tài)弧菌；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物只有大小為334bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，未含有大小為467bp的目標(biāo)基因片段，則判定為生物樣品未感染擬態(tài)弧菌，或病原菌不為或候選不為擬態(tài)弧菌；若所述rpa擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物未含有大小為334bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段且未含有大小為467bp的目標(biāo)基因片段，判定為反應(yīng)為假陰性，需要重新進(jìn)行檢測(cè)。

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：

含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管

再水化緩沖液29.5μl

seqidno：1和seqidno：2所示的引物各2μl，引物的終濃度均為0.4μmol/l

包含有seqidno：3所示的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒1.83×10³copies

模板dna50ng

醋酸鎂溶液2.5μl，濃度為280mmol/l

去離子水補(bǔ)足至50μl；

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：所述rpa-iac擴(kuò)增的溫度為37℃，時(shí)間為40min。

本發(fā)明第六方面提供了一種篩選擬態(tài)弧菌的系統(tǒng)，包括：

核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品或病原菌中的核酸樣本；

rpa-iac擴(kuò)增裝置，所述rpa-iac擴(kuò)增裝置與所述核酸提取裝置相連，適用于所述的引物對(duì)或所述試劑盒對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增；

判斷裝置，所述判斷裝置與所述rpa-iac擴(kuò)增裝置相連，以便基于rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果，判斷所述生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌，或病原菌是否為或候選為擬態(tài)弧菌。

在一優(yōu)選例中，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：

含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管

再水化緩沖液29.5μl

seqidno：1和seqidno：2所示的引物各2μl，引物的終濃度均為0.4μmol/l

包含有seqidno：3所示的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒1.83×10³copies

模板dna50ng

醋酸鎂溶液2.5μl，濃度為280mmol/l

去離子水補(bǔ)足至50μl；

任選的，所述rpa-iac擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：所述rpa-iac擴(kuò)增的溫度為37℃，時(shí)間為40min。

本發(fā)明的生物樣品為血液、細(xì)胞、組織等，或混雜了血液、細(xì)胞、組織等的食物等等；而病原菌則是一種純菌種或至少二種以上的菌種的混合。

本發(fā)明涉及的“內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段”是添加到pcr反應(yīng)體系中用以指示假陰性現(xiàn)象的一段人工構(gòu)建dna序列或者是一段致病菌的保守基因序列。擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)作用的主要原理是：將擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加到pcr反應(yīng)體系中，使之與目的基因進(jìn)行共同擴(kuò)增，如果在反應(yīng)體系中存在一些抑制因素，則擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)和目的基因的擴(kuò)增反應(yīng)都將受到抑制，從而達(dá)到指示pcr反應(yīng)假陰性的目的。

本發(fā)明的有益效果包括：

(1)本發(fā)明針對(duì)擬態(tài)弧菌設(shè)計(jì)特異性rpa-iac引物，建立了擬態(tài)弧菌rpa-iac檢測(cè)方法，可對(duì)擬態(tài)弧菌進(jìn)行定性檢測(cè)。

(2)本發(fā)明的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列與擬態(tài)弧菌基因組和人類基因組均非同源，可在確保目標(biāo)序列擴(kuò)增效率的同時(shí)有效規(guī)避檢測(cè)假陰性和操作人員個(gè)體核酸干擾檢測(cè)的發(fā)生。

(3)本發(fā)明針對(duì)擬態(tài)弧菌僅設(shè)計(jì)了一對(duì)引物即可完成擴(kuò)增，省去了復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)過程；本發(fā)明的引物擴(kuò)增只需要37℃下恒溫反應(yīng)即可，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；反應(yīng)時(shí)間僅需40min，檢測(cè)時(shí)間短；不像lamp產(chǎn)物的彌散帶，rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)具有特定大小的條帶，其結(jié)果易于判斷。

(4)本發(fā)明的rpa-iac擴(kuò)增引物特異性好、靈敏度高且適用范圍廣。

(5)本發(fā)明建立的擬態(tài)弧菌rpa-iac檢測(cè)方法，靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便和快速，對(duì)進(jìn)出口相關(guān)貨物及產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫具有指導(dǎo)意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例4中rpa-iac引物對(duì)的特異性試驗(yàn)電泳檢測(cè)結(jié)果。其中m為markerdl1000，1：擬態(tài)弧菌；2：創(chuàng)傷弧菌；3：副溶血弧菌；4：河流弧菌；5：溶藻弧菌；6：霍亂弧菌；7：哈維氏弧菌；8：沙門氏菌；9：大腸桿菌；10：金黃色葡萄球菌；11：?jiǎn)卧隼钏固鼐?/p>

圖2為本發(fā)明實(shí)施例5中rpa-iac擴(kuò)增的靈敏度試驗(yàn)電泳檢測(cè)結(jié)果。其中m為markerdl1000，1-6：擬態(tài)弧菌模板量依次為100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng，擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的用量均為1.83×10³copies。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例5中rpa擴(kuò)增的靈敏度試驗(yàn)電泳檢測(cè)結(jié)果。其中m為markerdl1000，1-6：擬態(tài)弧菌模板量依次為100ng、10ng、1ng、0.1ng、0.01ng和0.001ng。

具體實(shí)施方式

除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。

下面參考具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

以下實(shí)施例中使用的副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌均由汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了rpa引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列及其應(yīng)用。

rpa引物對(duì)的篩選方法為：針對(duì)擬態(tài)弧菌vmh基因(genbankid:cp016384.1)，設(shè)計(jì)了多條rpa引物并進(jìn)行了大量篩選，綜合其特異性、靈敏度、引物與引物之間的作用，以及所使用的各引物與rpa擴(kuò)增試劑盒的適配性，最終篩選出特異性好、重復(fù)性好且靈敏度高的如下可檢測(cè)擬態(tài)弧菌的rpa引物對(duì)：

vmh-f：5′-gagatattggcatctttacaaaatggacga-3′(seqidno：1)；

vmh-r：5′-gattggcaatcagaagaaagccaattacccag-3′(seqidno：2)；

內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的設(shè)計(jì)和合成：為避免相近細(xì)菌的同源干擾和檢測(cè)人員的個(gè)體核酸污染，經(jīng)過綜合分析考量和反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以高度保守的豬種屬特異性基因β-actin的部分核酸序列為基礎(chǔ)，兩端分別連接引物序列vmh-f和vmh-r，形成如下所示序列大小為334bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列：

gagatattggcatctttacaaaatggacgagttcgagaccttcaacaccccagccatgtacgtggccatccaggcggtgctgtccctgtacgcctctggccgcaccactggcatcgtgatggactccggagacggggtcacccacacggtgcccatctacgaggggtacgccctgccccacgccatcctgcgtctggacctggctggccgggacctgaccgactacctcatgaagatcctgacggagcggggctacagcttcaccaccacggccgagcgggagatcgtgcgggacatcaaggctgggtaattggctttcttctgattgccaatc(seqidno：3)

上述seqidno：3中，大寫序列為添加的vmh-f的原始序列和vmh-r的反向互補(bǔ)序列，小寫序列272bp來(lái)源于genbank登錄號(hào)為dq452569.1且標(biāo)題為susscrofabetaactin(actb)gene,partialcds中489-760的一段序列，并經(jīng)過理論和實(shí)踐的同源性驗(yàn)證。

上述rpa-iac引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的合成工作，均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

在應(yīng)用上，上述引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列可應(yīng)用于制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品，例如將內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列制備成含有此內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，然后與引物對(duì)或其它結(jié)合起來(lái)成為檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品，直接用來(lái)檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括：

(1)seqidno：1、seqidno：2(來(lái)自實(shí)施例1)，以及含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒；

(2)dna提取試劑；

(3)含凍干酶粉管；

(4)再水化緩沖液；

(5)醋酸鎂溶液。

上述含凍干酶粉管、再水化緩沖液(rehydrationbuffer)和醋酸鎂溶液(280mmol/l)為來(lái)自rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits(twistdx公司，貨號(hào)為tabas03kit)中的試劑。

所述dna提取試劑為來(lái)自貨號(hào)為dp432的天根生化科技有限公司的動(dòng)物基因組dna提取試劑盒中的試劑和來(lái)自貨號(hào)為dp302的天根生化科技有限公司的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒所包含的試劑。

所述含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的構(gòu)建：將實(shí)施例1合成的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列連接到通用載體puc57上，得到含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的陽(yáng)性質(zhì)粒。

上述內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列質(zhì)粒的構(gòu)建：采用常規(guī)t4噬菌體dna連接酶連接到通用載體puc57，并制備成陽(yáng)性質(zhì)粒凍干粉。在本發(fā)明中此構(gòu)建是由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。按照拷貝數(shù)ncopies/μl＝pcr片段的質(zhì)量(g/μl)/(650g/mol×堿基數(shù))×(6.02×10²³)計(jì)算，將陽(yáng)性質(zhì)粒干粉稀釋至1.83×10³copies/μl。

利用seqidno：1、seqidno：2和上述含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒針對(duì)擬態(tài)弧菌進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，得到的rpa-iac目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)產(chǎn)物的大小分別為467bp、334bp。

實(shí)驗(yàn)證明，上述dna提取試劑、含凍干酶粉管、再水化緩沖液、醋酸鎂溶液，以及其與seqidno：1、seqidno：2和含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的聯(lián)合使用，效果更加優(yōu)越，具體表現(xiàn)在特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高以及質(zhì)控效果佳。

在應(yīng)用上，上述試劑盒可應(yīng)用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌上，例如檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌，或檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)生物樣品是否為或候選為擬態(tài)弧菌；還可以用來(lái)制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品，例如制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品，或制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)病原菌為或候選為擬態(tài)弧菌的產(chǎn)品。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法，例如檢測(cè)或輔助檢測(cè)生物樣品是否感染擬態(tài)弧菌，或檢測(cè)或輔助檢測(cè)病原菌是否為或候選為擬態(tài)弧菌，該方法使用了實(shí)施例1的引物對(duì)或?qū)嵤├?的試劑盒。

上述方法包括如下步驟：

步驟一：rpa-iac擴(kuò)增

以生物樣品或病原菌的dna為模板，添加實(shí)施例2中含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒，采用seqidno：1和seqidno：2組成的引物對(duì)進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照(模板為超純水)。

rpa-iac擴(kuò)增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2mltwistamp反應(yīng)管中加入再水化緩沖液(rehydrationbuffer)29.5μl、上、下游引物(實(shí)施例1的vmh-f和vmh-r)各2μl(引物的終濃度均為0.4μmol/l)，含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒1μl(1.83×10³copies)，模板dna1ul(50ng)，最后再加入醋酸鎂溶液2.5μl(280mmol/l)，用去離子水補(bǔ)足至50μl。

rpa-iac擴(kuò)增反應(yīng)條件：將上述rpa-iac擴(kuò)增體系充分混勻，置于37℃的金屬浴上反應(yīng)40min，得到rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物。

步驟二：rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

rpa-iac反應(yīng)結(jié)束后，向上述擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混勻后12000rpm離心2min，取5μl上清液于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，并對(duì)rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(在建立方法過程中均進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證，本文不再贅述)。

所述rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)為：

若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物僅有大小為467bp的目標(biāo)基因片段，或同時(shí)擁有大小分別為334bp、467bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段和目標(biāo)基因片段，則判定為含有擬態(tài)弧菌，提示所述生物樣品感染擬態(tài)弧菌，或病原菌為或候選為擬態(tài)弧菌；若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物只有大小為334bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段，未含有大小為467bp的目標(biāo)基因片段，則判定為不含有擬態(tài)弧菌，提示所述生物樣品未感染擬態(tài)弧菌，或病原菌不為或候選不為擬態(tài)弧菌；若所述rpa-iac擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物未含有大小為334bp的內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段且未含有大小為467bp的目標(biāo)基因片段，判定為反應(yīng)假陰性，提示需要重新進(jìn)行檢測(cè)。

如果待測(cè)植株或待測(cè)病原菌還未提取dna，上述方法步驟(1)rpa-iac擴(kuò)增之前還可以包括使用動(dòng)物基因組dna提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司，貨號(hào)為dp432)或細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(購(gòu)自天根生化科技有限公司，貨號(hào)為dp302)按照試劑盒說明書對(duì)生物樣品或待測(cè)病原菌中的dna進(jìn)行提取的步驟。

實(shí)施例4

本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1的引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列進(jìn)行了有效性和特異性驗(yàn)證，所用的供試材料如下：副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌，這些菌株為購(gòu)買并經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)菌株，均保存在汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。

步驟一：基因組dna的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號(hào)為dp302的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒按照試劑盒說明書分別提取溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的基因組dna。

步驟二：rpa-iac擴(kuò)增

采用各種基因組dna模板：

組1以擬態(tài)弧菌的基因組dna混合物為模板(陽(yáng)性對(duì)照)。

組2以創(chuàng)傷弧菌的基因組dna為模板。

組3以副溶血弧菌的基因組dna為模板。

組4以河流弧菌的基因組dna為模板。

組5以溶藻弧菌的基因組dna為模板。

組6以霍亂弧菌的基因組dna為模板。

組7以哈維氏弧菌的基因組dna為模板。

組8以沙門氏菌的基因組dna為模板。

組9以大腸桿菌的基因組dna為模板。

組10以金黃色葡萄球菌的基因組dna為模板

組11以單增李斯特菌的基因組dna為模板。

分別以組1-組11為模板，進(jìn)行rpa-iac擴(kuò)增，rpa-iac擴(kuò)增的方法同實(shí)施例3的步驟一。

步驟三：rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)的方法同實(shí)施例3的步驟二。

結(jié)果分析：

結(jié)果如圖1所示，組1-組11分別對(duì)應(yīng)泳道1-11，泳道1顯示在334bp和467bp處均有擴(kuò)增條帶，根據(jù)實(shí)施例3的判斷標(biāo)準(zhǔn)，為陽(yáng)性，即順利檢出擬態(tài)弧菌，其余泳道2-泳道11顯示只有在334bp處有擴(kuò)增條帶，根據(jù)實(shí)施例3的判斷標(biāo)準(zhǔn)，這就排除了假陰性可能性，進(jìn)一步提高了結(jié)果的可靠性。綜上，上述陽(yáng)性判定和陰性判定結(jié)果均準(zhǔn)確且所有組的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)均成功擴(kuò)增，由此證明本發(fā)明實(shí)施例1的引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列具有有效性、高特異性和良指示性；進(jìn)一步的，本發(fā)明基于引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列及試劑盒建立的檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法能夠準(zhǔn)確的對(duì)擬態(tài)弧菌進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例5

本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1的引物對(duì)和內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列進(jìn)行了靈敏度驗(yàn)證，并與不添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(即不添加實(shí)施例2中含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒)進(jìn)行比較，所用的供試材料如下：擬態(tài)弧菌，此菌株為購(gòu)買并經(jīng)嚴(yán)格驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)菌株，保存于汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心。

步驟一：基因組dna的提取

采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號(hào)為dp302的細(xì)菌基因組dna提取試劑盒按照試劑盒說明書分別提取擬態(tài)弧菌的基因組dna，并將得到的基因組dna進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備得到不同濃度的擬態(tài)弧菌的基因組dna。

步驟二：rpa擴(kuò)增和rpa-iac擴(kuò)增

采用不同濃度的擬態(tài)弧菌的基因組dna作為模板：

組1：以100ng/μl的擬態(tài)弧菌基因組dna(1μl)為模板。

組2：以10ng/μl的擬態(tài)弧菌基因組dna(1μl)為模板。

組3：以1ng/μl的擬態(tài)弧菌基因組dna(1μl)為模板。

組4：以0.1ng/μl的擬態(tài)弧菌基因組dna(1μl)為模板。

組5：以0.01ng/μl的擬態(tài)弧菌基因組dna(1μl)為模板。

組6：以0.001ng/μl的擬態(tài)弧菌基因組dna(1μl)為模板。

分別以組1-組6為模板，分別進(jìn)行rpa擴(kuò)增及rpa-iac擴(kuò)增，rpa-iac擴(kuò)增的方法同實(shí)施例3的步驟一，rpa擴(kuò)增與rpa-iac擴(kuò)增的區(qū)別為擴(kuò)增體系里不添加實(shí)施例2中含有如seqidno：3所示內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒。

步驟三：rpa擴(kuò)增產(chǎn)物和rpa-iac擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

二者擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)的方法同實(shí)施例3的步驟二。

結(jié)果分析：

rpa-iac擴(kuò)增的結(jié)果如圖2所示，組1-4均在467bp處有條帶且組2-6在334bp處有條帶，這說明組1-6的結(jié)果均有效且組5-組6無(wú)假陰性可能性，同時(shí)也說明本發(fā)明實(shí)施例1的引物對(duì)具有較高的靈敏度，可檢測(cè)出樣品中僅含有0.1ng的微量dna；rpa擴(kuò)增的結(jié)果如圖3所示，靈敏度結(jié)果同rpa-iac擴(kuò)增。綜上可知添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)并沒有降低檢測(cè)的靈敏度。

對(duì)比例1

實(shí)際上，在尋求到本發(fā)明的引物對(duì)之前，嘗試了本發(fā)明的包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒(來(lái)自實(shí)施例2)與非常多的引物對(duì)組合，在本對(duì)比例中只摘取其中之若干進(jìn)行闡述，其余不予贅述，具體為：

利用實(shí)施例1的引物對(duì)以及用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)并選取其中排分靠前的引物對(duì)，用實(shí)施例3建立的檢測(cè)或輔助檢測(cè)擬態(tài)弧菌的方法對(duì)50份出口海產(chǎn)品分別進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)參考食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：gb4789.7-2013)中對(duì)這50份海產(chǎn)品進(jìn)行了擬態(tài)弧菌的分離和系統(tǒng)生化鑒定，靈敏度試驗(yàn)的取樣和模板濃度梯度設(shè)置均按照實(shí)施例5進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2

結(jié)果顯示：鑒于存在包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒的情況下本發(fā)明引物對(duì)的檢測(cè)結(jié)果與參考標(biāo)準(zhǔn)和已公開的檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果完全一致，這說明本發(fā)明引物對(duì)組合特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性很好，而采用引物設(shè)計(jì)軟件隨機(jī)選取的若干種引物的組合則或多或少的存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高、重復(fù)性不好以及干擾擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)等各種缺陷。

對(duì)比例2

本對(duì)比例提供了不同的試劑與本發(fā)明的引物對(duì)(來(lái)自實(shí)施例1)、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒(來(lái)自實(shí)施例1)組合在一起檢測(cè)擬態(tài)弧菌時(shí)的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比。

各種試劑與本發(fā)明的引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒組合:

組合1：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售動(dòng)物基因組dna提取試劑盒1+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒1

組合2：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售動(dòng)物基因組dna提取試劑盒2+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒2

組合3：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+某市售動(dòng)物基因組dna提取試劑盒3+某市售rpa擴(kuò)增試劑盒3

本發(fā)明組合：本發(fā)明引物對(duì)和包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒+來(lái)自天根生化科技有限公司貨號(hào)為dp432的動(dòng)物基因組dna提取試劑盒所包含的試劑+來(lái)自twistdx公司的貨號(hào)為tabas03kit的rpa擴(kuò)增試劑盒twistampbasickits所包含的試劑。

利用上述本發(fā)明組合檢測(cè)擬態(tài)弧菌時(shí)，其方法采用實(shí)施例3中的方法進(jìn)行。靈敏度試驗(yàn)的取樣和模板濃度梯度的設(shè)置均按照實(shí)施例5進(jìn)行。

利用上述組合1、組合2和組合3檢測(cè)擬態(tài)弧菌時(shí)，凡是用到市售試劑盒，均按照其試劑盒說明書進(jìn)行操作進(jìn)行，其余條件均同本發(fā)明組合。同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)已公開的對(duì)比方法(見對(duì)比例1)進(jìn)行檢測(cè)。

受檢樣品同對(duì)比例1中的50份出口海產(chǎn)品。

檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表3

結(jié)果顯示：本發(fā)明引物對(duì)、包含有內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的質(zhì)粒和各特定試劑的組合的檢測(cè)結(jié)果與歐盟標(biāo)準(zhǔn)和已公開的檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果完全一致，這說明本發(fā)明引物對(duì)、內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列和各特定試劑的組合所組成的試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，而在存在內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增序列的情況下采用本發(fā)明引物對(duì)與其它隨機(jī)選取的若干試劑的組合則或多或少的存在特異性不強(qiáng)、靈敏度不高和重復(fù)性不好的各種缺陷。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

sequencelisting

<110>廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心；汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120>檢測(cè)擬態(tài)弧菌的rpa-iac引物及方法

<130>17cn

<160>3

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