專利名稱：一種檢測腸道病毒71型rna的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種提取純化和檢測腸道病毒71型(Human enterovirus 71, EV71)RNA的方法，并提供一種相應(yīng)的檢測EV71 RNA的試劑盒。
背景技術(shù)：
EV71是引起嬰幼兒手足口病常見的病毒，學(xué)齡前兒童對EV71普遍易感，且發(fā)病急、進展快。成人亦有感染，一般表現(xiàn)為隱性帶毒，可傳染給嬰幼兒而引起發(fā)病。與其他腸道病毒相似，對EV71感染進行診斷與分類的方法在現(xiàn)階段一般是通過采集適當?shù)呐R床標本后進行病毒分離和病毒鑒定；如果沒有采到合適的臨床標本，或無法進行病毒分離，也可以通過血清學(xué)檢測(如中和實驗)來檢測血清中的中和抗體,或直接從 臨床標本中檢測病毒的核酸來診斷。由于病毒分離培養(yǎng)較困難，加之感染后IgG抗體存在時間長，再感染時IgM和補體結(jié)合抗體又常為陰性，故有時血清學(xué)實驗較難區(qū)分初次感染和再次感染，而特異性核酸的檢測不失為快速、明確的診斷手段。實時熒光PCR技術(shù)(FQ-PCR)把PCR、分子雜交和光化學(xué)融為一體，使PCR擴增和產(chǎn)物分析的全過程均在單管封閉條件下進行。實時熒光PCR技術(shù)與其它檢測技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢(1)與免疫學(xué)檢測比較，其具有更高的靈敏度，從理論上講只要有一個基因拷貝就可以檢測出來。(2)根據(jù)各種病原體獨特的保守基因序列設(shè)計引物，能夠保證PCR反應(yīng)的高度特異性，避免交叉反應(yīng)。(3)能對病毒進行定量檢測，可反映出患者體內(nèi)病原體拷貝數(shù)的高低和復(fù)制情況。定量檢測有助于判斷病原體感染與疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，探討藥物對病原體的作用，了解感染疾病病人用藥后病情的變化情況。這對理解發(fā)病機制和預(yù)測抗病毒治療的有效性十分關(guān)鍵。(4)可擴大檢測人群的范圍，適用于大規(guī)模的流行病調(diào)查。對如手足口病這類自然感染率極高的病原微生物尤其適用。(5)將PCR敏感性與探針特異性相結(jié)合，在很大程度上改變了傳統(tǒng)PCR的缺陷，縮短了反應(yīng)時間，簡化了操作步驟(6)全過程均在單管封閉條件下進行，避免了由于樣本間交叉引起的假陰性和環(huán)境污染(7)實時檢測技術(shù)可連續(xù)不斷的檢測PCR過程中榮耀信號的變化，避免了傳統(tǒng)PCR的“平臺期效應(yīng)”，并且模板的定量不通過終產(chǎn)物，而由Ct值算出，準確性和靈敏性都有提高。目前，國內(nèi)已有多種基于實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測EV71-RNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測中，這些試劑盒所提供的EV71-RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。該類試劑盒存在很多不足之處1)檢測靈敏度低，約在lOOOcopies/ml左右；檢測范圍窄，一般在 L 00E+03copies/ml L 00E+07copies/ml 之間，對于臨床高值(大于 5. 00E+07copies/ml)和低值(小于I. 00E+03copies/ml)的樣本無法檢測；2)無法有效檢測腸道病毒71型A、B、C的各亞型樣本，經(jīng)常有漏檢情況的發(fā)生；3 )酚-氯仿法是最經(jīng)典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對于設(shè)備和人員操作要求高，低病毒載量的標本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法無需高速離心，但是需頻繁更換離心管，用時長，特異性較差；4)無法有效去除樣本中的PCR抑制物(如全血、痰液等)，體系中一般沒有陽性內(nèi)對照(即內(nèi)標)，無法預(yù)防假陰性；5)國外性能優(yōu)異的同類試劑是Biomerieux, inc.的NucliSENS EasyqEnterovirus System試劑。該試劑成本和耗材成本太高,很難在臨床廣泛開展。磁珠(免疫磁珠)法是近年發(fā)展迅速且被廣泛應(yīng)用的一種核酸提取方法，其優(yōu)于傳統(tǒng)方法的特點可以總結(jié)為以下幾點其系列試劑不含氯仿、苯酚等毒性大的有機溶劑；提取純化的核酸質(zhì)量好、產(chǎn)量高；提取步驟更簡單，不需要離心，易于實現(xiàn)自動化；這些優(yōu)點使其有替代其它核酸提取和純化方法的發(fā)展趨勢。但在現(xiàn)有技術(shù)中，并未見有磁珠法用于提取純化和檢測EV71 RNA的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有腸道病毒71型核酸檢測試劑盒的缺陷，提供一種RNA提取得率高、檢測靈敏度高的腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，應(yīng)用該試劑盒，可以對咽拭 子、糞便等未知樣本中的EV71-RNA濃度進行快速、準確測定，為早期診斷腸道病毒71型感染提供可靠的實驗依據(jù)。本發(fā)明用磁珠法提取樣本核酸，采用實時熒光定量PCR技術(shù)，以EV71基因組的高度保守區(qū)域為擴增靶目標，設(shè)計特異性引物及TaqMan探針，在實時熒光PCR儀上通過PCR擴增對EV71 RNA進行定性檢測。本發(fā)明提供一種檢測EV71 RNA的方法，其中使用磁珠法提取和純化EV71 RNA。在本發(fā)明中，所述磁珠是生物科學(xué)和納米材料科學(xué)二者結(jié)合的產(chǎn)品。它運用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠；該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。它利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下,能將血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來，可應(yīng)用于臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學(xué)鑒定、環(huán)境微生物檢測、食品安全檢測、分子生物學(xué)研究等多種領(lǐng)域。在本發(fā)明中，所述磁珠可經(jīng)商購獲取。在優(yōu)選的情況下，本發(fā)明結(jié)合使用磁珠法和實時熒光PCR技術(shù)提取純化和檢測EV71RNA。具體的，在一個實施方式中，本發(fā)明所述方法包括如下步驟，步驟A，裂解病毒每支離心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待測樣本，混勻后離心；EV71陰性對照和EV71陽性對照參照與待測樣本相同的方法作RNA提取和純化處理；步驟B，磁珠吸附核酸每管加入含4-羥乙基哌嗪乙磺酸和氯化鈉的RNA提取溶液II，混勻后靜置；步驟C，去除雜質(zhì)經(jīng)離心后將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，再緩慢將溶液吸出；步驟D，洗滌每管加入含曲拉通和氯化鈉的RNA提取溶液III和含礦物油的RNA提取溶液IV，混勻后離心，將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，靜置分層后將液體吸出丟棄；步驟E，RNA洗脫加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脫液將離心管壁上的磁珠洗脫到管底，混勻并靜置后將離心管再次置于磁珠分離器上，然后將從磁珠上洗脫下來的RNA吸至新的滅菌離心管中；步驟F，熒光PCR分析將洗脫磁珠后的待測樣本RNA、EV71陰性對照、EV71陽性對照中均加入含PCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物、探針的PCR反應(yīng)液和含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶的EV71酶混合液，在熒光定量PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)，并分析結(jié)果。本發(fā)明還提供一種檢測EV71 RNA的試劑盒，包括含磁珠的RNA提取溶液I、和含用于靶多核苷酸擴增的上游引物EV71-F1、下游引物EV71-R1和用于靶多核苷酸檢測的探針EV71-P1的PCR反應(yīng)液；其中，上游引物EV71-F1的堿基序列為5’ -TCTGTTTCCCCGGACTGAGTAT-3’ ；下游引物 EV71-R1 的堿基序列為 5’ -TGGTGTTACTAGGTTTTCCGAAGTAG-3’ ；探針 EV71-P1 的堿基序列為 5’ FAM-AAAACGTTCGTTATCCGGCT-BHQ13’ ；在本發(fā)明的試劑盒中，發(fā)明人尋找出EV71 RNA的保守序列而設(shè)計出用于靶多核苷酸擴增和檢測的引物和探針序列，為EV71 RNA的實時熒光PCR檢測檢測提供了保障。在本發(fā)明所述試劑盒中，優(yōu)選的是，所述試劑盒中還包括內(nèi)標，所述內(nèi)標即為陽性內(nèi)對照，具體為一段長為78堿基對的人工合成DNA序列插入pUC18T載體的重組體，即質(zhì)粒，濃度為I. 00E+03 copies/ml I. 00E+06 copies/ml ;78堿基對的序列如下所示:5，-AAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTC-3，。在本發(fā)明一個具體實施方式
中，所述試劑盒中包括如下組分，①RNA提取溶液 I :包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和10(Γ400μ g/ml的磁珠RNA提取溶液II :含4-羥乙基哌嗪乙磺酸和氯化鈉RNA提取溶液III :含曲拉通和氯化鈉RNA提取溶液IV :含礦物油RNA洗脫液含Tris-HCl和EDTA ;⑥內(nèi)標如上所述的可選擇使用的內(nèi)標PCR反應(yīng)液包括5XPCR反應(yīng)緩沖液，脫氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物EV71-FI與EV71-RI，用于靶多核苷酸檢測的探針EV71 -P I，用于內(nèi)標擴增和檢測的上、下游引物dzu-Fl與dzu-Rl和探針dzu-Pl ; EV71酶混合液含mMLV酶和H-TaqDNA聚合酶；@ EV71陽性對照標定已知濃度的慢病毒，其濃度為
I.00 5. 00E+05copies/ml ;和⑩EV71陰性對照滅菌生理鹽水。在本發(fā)明的上述試劑盒中，用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物EV71-F1與EV71-R1和用于靶多核苷酸檢測的探針EV71-P1的序列是本發(fā)明的核心；而用于內(nèi)標擴增的上、下游引物dzu-Fl與dzu-Rl和用于內(nèi)標檢測的探針dzu-Pl均可以據(jù)內(nèi)標的堿基序列而任意選擇。在本發(fā)明中，例如，上游引物dzu-Fl為5’ -AAATCCTAAGGTTCCAGCT-3’ ；下游引物 dzu-Rl 為5’ -GAGATTGCACCTCCAGAAG-3’ ；探針 dzu-Pl 為5 ’ HEX-CAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAG-Dabcyl 3’。在上述試劑盒中，更為優(yōu)選的是，①RNA提取溶液I :由十二烷基硫酸鈉O. 2 1.0%(質(zhì)量/體積)、曲拉通I. 0 4· 0% (體積/體積),異硫氰酸胍O. 2 I. OmoI/L和100 400 μ g/ml的磁珠組成。②RNA提取溶液II :包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸10(T300mmOl/L、氯化鈉100 300mmol/L，溶液II的pH值為6. 5±0· 2 ;③RNA提取溶液III :含曲拉通O. I I. 0%(體積/體積)和氯化鈉10(T300mmol/L。⑤RNA洗脫液含Tris-HCl O. 8^1. 2mol/L和EDTA0. I I. OmoI/L ; PCR反應(yīng)液包括5XPCR反應(yīng)緩沖液10μ 1,0. 2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，O. 2^0. 4ymol/L的用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物EV71-F1與EV71-R1，O. 2^0. 4ymol/L的用于靶多核苷酸檢測的探針EV71-P1，O. Γθ. 2ymol/L的用于內(nèi)標擴增的上、下游引物dzu-Fl與dzu-Rl, O. 05 O. 2 μ mol/L的用于內(nèi)標檢測的探針dzu-Pl ；⑧EV71酶混合液包括mMLV酶10 150U/ μ I和I 10U/ μ I的H-Taq DNA聚合酶。本發(fā)明在對EV71的序列進行比對的基礎(chǔ)上，在EV71的最保守區(qū)域5’ UTR共設(shè)計了兩對引物和探針，經(jīng)定量PCR優(yōu)化，篩選出了擴增效果最好的一對引物和探針，可檢測出EV71陽性樣本，但不能檢測出非EV71病原體，說明本發(fā)明試劑盒具有很好的特異性，并且該試劑所用的引物和探針檢測的序列區(qū)域在腸道病毒71型Α、ΒΓΒ4和Cf C4各亞型的保守位置，能有效檢測各類亞型的樣本，避免了其他同類試劑存在的亞型漏檢的風(fēng)險，避免假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。另外，本發(fā)明對EV71-RNA的提取方法進行了比較和優(yōu)化，選擇了吸附效果好、易于純化的磁珠法提取RNA，可以獲得高純度和高得率的核酸，大大提高了檢測靈敏度、準確度和穩(wěn)定性，檢測靈敏度可達2. 00E+02 copies/ml，線性檢測范圍為2.00E+02copies/ml 2. 00E+08 copies/ml。另外，在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，在樣本提取過程中增加了內(nèi)標，利用內(nèi)標監(jiān)控RNA提取和PCR反應(yīng)過程，監(jiān)控反應(yīng)體系是否有效，防止樣本檢測假陰性。
本發(fā)明中，在熒光定量PCR擴增結(jié)束后，經(jīng)儀器自帶軟件自動分析樣本的Ct值，可定性檢測咽拭子、糞便等未知樣本中的EV71-RNA，可為靈敏、早期診斷腸道病毒71型感染提供可靠的實驗證據(jù)。


圖I為本發(fā)明方法檢測EV71線性梯度樣本，濃度為2. 00E+02copies/ml 2.00E+08copies/ml ；圖2為本發(fā)明方法檢測EV71企業(yè)參考品的陽性參考品Pl-PlO ；圖3為本發(fā)明方法檢測EV71企業(yè)參考品的陰性參考品；圖4為本發(fā)明方法檢測EV71企業(yè)參考品的精密度參考品，濃度為5.00E+02copies/ml ；圖5為本發(fā)明方法檢測EV71企業(yè)參考品的靈敏度參考品，濃度為2.00E+03copies/ml ；圖6為本發(fā)明方法檢測EV71企業(yè)參考品的靈敏度參考品，濃度為2.00E+02copies/ml ；圖7為本發(fā)明方法檢測EV71企業(yè)參考品的靈敏度參考品，濃度為I.00E+02copies/ml ；圖8為本發(fā)明方法檢測EV71相應(yīng)內(nèi)標；圖9為本發(fā)明方法檢測科薩奇病毒A16型、腺病毒、流感病毒、EB病毒、巨細胞病毒、肺炎支原體、解脲脲原體、結(jié)核桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌樣本；圖10為本發(fā)明方法檢測測腸道病毒71型A、BfB4和Cf C4各亞型的陽性病毒樣本。
具體實施例方式以下僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明公開的技術(shù)范圍內(nèi)，可很容易進行的改變或變化都涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)以權(quán)利要求書的保護范圍為準。實施例I本實施例提供一種腸道病毒71型核酸檢測試劑盒(檢測EV71 RNA的試劑盒)，它包括如下組分①RNA提取溶液I :由十二烷基硫酸鈉O. 6 (質(zhì)量/體積)％、曲拉通3. 5 (v/v)%,異硫氰酸胍O. 8mol/L和300 μ g/ml的磁珠組成；②RNA提取溶液II :包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸100mmol/L、氯化鈉200mmol/L，溶液II的pH值為6·5±0·2 ;③RNA提取溶液III 曲拉通O. 5 (ν/ν) %、氯化鈉300mmol/L ；④RNA提取溶液IV :礦物油；⑤RNA 洗脫液:Tris-HCl I. 2mol/L (ρΗ8· 0)、EDTA1. Omol/L (ρΗ8· 0)和純化水組成；⑥內(nèi)標(陽性內(nèi)對照)一段長為78堿基對的人工合成DNA序列插入pUC18T載體的重組體，即質(zhì)粒，濃度為I. 00E+03copies/ml I. 00E+06copies/ml ；78喊基對的序列如下所示5， -AAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTC-3’⑦PCR反應(yīng)液PCR反應(yīng)液由引物、探針、dNTPs、5XPCR反應(yīng)緩沖液、滅菌純化水等組成。每人份EV7IPCR反應(yīng)液為43 μ I，單人份用量配方如表I :表I
權(quán)利要求
1.ー種檢測腸道病毒71型RNA的方法，其中使用磁珠法提取和純化腸道病毒71型(EV71) RNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，結(jié)合使用磁珠法和實時熒光PCR技術(shù)提取純化和檢測EV71 RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟 步驟A，裂解病毒每支離心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待測樣本，混勻后離心；EV71陰性對照和EV71陽性對照參照與待測樣本相同的方法作RNA提取和純化處理； 步驟B，磁珠吸附核酸每管加入含4-羥こ基哌嗪こ磺酸和氯化鈉的RNA提取溶液II，混勻后靜置； 步驟C，去除雜質(zhì)經(jīng)離心后將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，再緩慢將溶液吸出； 步驟D，洗滌每管加入含曲拉通和氯化鈉的RNA提取溶液III和含礦物油的RNA提取溶液IV，混勻后離心，將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，靜置分層后將液體吸出丟棄； 步驟E，RNA洗脫加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脫液將離心管壁上的磁珠洗脫到管底，混勻并靜置后將離心管再次置于磁珠分離器上，然后將從磁珠上洗脫下來的RNA吸至新的滅菌離心管中； 步驟F，熒光PCR分析將洗脫磁珠后的待測樣本RNA、EV71陰性對照、EV71陽性對照中均加入含PCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物、探針的PCR反應(yīng)液和含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶的EV71酶混合液，在熒光定量PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)，并分析結(jié)果。
4.一種檢測EV71 RNA的試劑盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸擴增的上游引物EV71-Fl、下游引物EV71-Rl和用于靶多核苷酸檢測的探針EV71-Pl的PCR反應(yīng)液；其中，上游引物EV71-F1的堿基序列為5’ -TCTGTTTCCCCGGACTGAGTAT-3’ ；下游引物EV71-R1 的堿基序列為 5’ -TGGTGTTACTAGGITTTCCGAAGTAG-3’ ；探針 EV71-P1 的堿基序列為5’ FAM-AAAACGTTCGTTATCCGGCT-BHQI 3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內(nèi)標，其為一段長 為78堿基對的人工合成DNA序列插入pUC18T載體的重組體，即質(zhì)粒，其序列為5’ -AAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTC-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在干，試劑盒中包括如下組分， ①RNA提取溶液I:包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和10(T400 u g/ml的磁珠; ②RNA提取溶液II:含4-羥こ基哌嗪こ磺酸和氯化鈉； ③RNA提取溶液III:含曲拉通和氯化鈉； ④RNA提取溶液IV:含礦物油； ⑤RNA洗脫液含Tris-HCl和EDTA； ⑥內(nèi)標如上所述的可選擇使用的內(nèi)標； ⑦PCR反應(yīng)液包括5X PCR反應(yīng)緩沖液，脫氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物EV71-Fl與EV71-Rl，用于靶多核苷酸檢測的探針EV71-PI，用于內(nèi)標擴增和檢測的上、下游引物dzu-Fl與dzu-Rl和探針dzu-Pl ；⑧EV71酶混合液含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶；⑨EV71陽性對照標定已知濃度的慢病毒，其濃度為I. 00 5. 00E+05COpieS/ml ； ⑩EV71陰性對照滅菌生理鹽水。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，在試劑盒中， ①RNA提取溶液I:由十二烷基硫酸鈉0. 2^1. 0% (質(zhì)量/體積)、曲拉通I. (T4. 0% (體積/體積)，異硫氰酸胍0. 2^1. Omol/L和10(T400 u g/ml的磁珠組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，在試劑盒中， ②RNA提取溶液II:包括4-羥こ基哌嗪こ磺酸10(T300mmol/L、氯化鈉10(T300mmol/し溶液II的pH值為6.5±0.2 ;③RNA提取溶液III:含曲拉通0. ri. 0% (體積/體積)和氯化鈉IOOlOOmmoI/し
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，在試劑盒中，⑤RNA 洗脫液含 Tris-HCl 0. 8 I. 2mol/L 和 EDTA0. I I. Omol/L ； ⑦PCR反應(yīng)液包括5XPCR反應(yīng)緩沖液10U 1,0. 2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0. 2^0. 4umol/L的用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物EV71-F1與EV71-R1，.0.2^0. 4umol/L的用于靶多核苷酸檢測的探針EV71_P1，0. ro. 2umol/L的用于內(nèi)標擴增的上、下游引物dzu-Fl與dzu-Rl, 0. 05 0. 2 u mol/L的用于內(nèi)標檢測的探針dzu-Pl ；⑧EV71酶混合液包括mMLV酶10 150U/ U I和I IOU/ U I的H-Taq DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提取純化和檢測EV71 RNA(腸道病毒71型RNA)的方法，并提供一種相應(yīng)的檢測EV71 RNA的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒中包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸擴增的上游引物EV71-F1、下游引物EV71-R1和用于靶多核苷酸檢測的探針EV71-P1的PCR反應(yīng)液。本發(fā)明提供的試劑盒可檢測出EV71陽性樣本，但不能檢測出非EV71病原體，說明本發(fā)明試劑盒具有很好的特異性；另外，本發(fā)明選擇了吸附效果好、易于純化的磁珠法提取RNA，可以獲得高純度和高得率的核酸，大大提高了檢測靈敏度、準確度和穩(wěn)定性，其檢測下限即靈敏度可達200copies/ml，檢測范圍(試劑盒的定量線性范圍)為2.00E+02~2.00E+08copies/ml。
文檔編號C12N15/10GK102851394SQ20121031543
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月30日
發(fā)明者戴立忠, 鄧中平, 付亞成 申請人:湖南圣湘生物科技有限公司