eplantpathogens.''JournalofVirological Methods，2008, 154(1-2) :48-55 ;·ZhangZ.，Peng，S.，Jiang，D.，etal·，Developmentofa polyprobeforthesimultaneousdetectionoffourgrapevineviroidsingrapevine plants.EuropeanJournalofPlantPathology，2012, 132:9-16.)和植物總RNA提取米用 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（操作方法按說明書）。
[0063] 2用于探針合成的PCR反應特異性引物的設計
[0064] PLMVd引物參照已發(fā)表文獻（Ambros，S.，Herna'ndez，C.，Desvign es,J.C.etal. ,Genomicstructureofthreephenotypicallydifferent isolatesofPeachlatentmosaicviroid:implicationsoftheexistenceof constraintslimitingtheheterogeneityofviroidquasispecies.Journalof Virology，1998, 72 (9) : 7397-7406.)，為便于合成探針，我們在正向引物Y端加上了EcoR I酶切位點和保護堿基。CGRMV引物根據(jù)GenBank上已發(fā)表的相關序列的保守區(qū)CP基因， 用Primer3.0在線設計，為便于合成探針，正向和反向引物5'端均加上酶切位點和保護 堿基（表1)。
[0065] 表1用于探針合成的PCR反應所用的特異性引物
[0066]
[0067] *序列中加下劃線部分表示限制性內切酶序列。
[0068] 引物CGRMV-F的序列如序列表中序列1所示；引物CGRMV-R的序列如序列表中序 列2所示；引物PLMVd-F的序列如序列表中序列3所示；引物PLMVd-R的序列如序列表中序 列4所示。
[0069] 3cDNA的克隆和地高辛標記cRNA探針的制備 [0070]反轉錄體系
[0071]
[0073] 混勻混合液，室溫放置lOmin，42°C溫育lh，然后進行PCR或_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0074]
[0075]PCR反應循環(huán)參數(shù)：94°C預變性5min，94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 40sec，循環(huán)35次；最后72°C延伸lOmin。4°C保存。PCR產物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行 分析，在DYY-6B型穩(wěn)壓電泳儀，100V下電泳30min左右，電泳膠于KCBI0-2800凝膠成像分 析儀中照相，分析電泳結果。
[0076]PCR產物使用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒進行擴增產物的純化回收和克隆到 pGEM-T載體上。第一步，分別將CGRMV和PLMVd的PCR純化產物連接至帶有T7/SP6啟動 子pGEM-T克隆載體（PROMEGA公司產品，產品目錄號為A3600)，轉化大腸感菌DH5α感 受態(tài)細胞（TaKaRa公司產品，產品目錄號為9057)，篩選白色單菌落置于lmlLB(含氨芐 青霉素Amp)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過對菌液進行PCR檢測來鑒定CGRMV和PLMVd的重組質粒 (pG-CGRMV，pG-PLMVd)，經菌液PCR，篩選陽性菌液送至北京六合華大基因科技有限公司進 行序列測定。對所得序列通過131^1'(111^ ://?^.11(313；[.111111.11；[11.80￥/)與相關序列進行比 對分析，鑒定檢測的目的片段。第二步，以合成的重組質粒為模板，按照地高辛標記試劑盒 (DIGRNALabelingKit(SP6/T7))說明書通過體外轉錄完成CGRMV-cRNA和PLMVd-cRNA單 聚探針（CG-probe和PL-probe)制備。第三步，對第一步克隆獲得的重組質粒pG-CGRMV， pG-PLMVd進行再次PCR擴增，PCR擴增片斷分別用限制性內切酶Ecol(表1)進行酶切和串 聯(lián)，亞克隆到新的pGEM-T載體形成CGRMV+PLMVd重組質粒（pG-CGRMV+PLMVd)并進行序列 測定。同樣，以合成的重組質粒pG-CGRMV+PLMVd為模板，按照地高辛標記試劑盒說明書通 過體外轉錄完成CGRMV+PLMVd-cRNA二聚探針[(CG+PL)-poly2probe]的制備（圖1)。
[0077] 其中，地高辛標記cRNA探針的制備方法：以合成的重組質粒為模板，按照地高辛 標記試劑盒（DIGRNALabelingKit(SP6/T7))說明書通過體外轉錄完成cRNA探針制備。 由于CGRMV為單鏈正義RNA病毒，PLMVd為單鏈、共價閉合環(huán)狀RNA分子，在寄主體內多以正 義鏈存在，所以，我們必須制備與其互補的負義RNA探針（cRNA探針），即通過改變外源基因 的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，控制RNA的轉錄方向。首先，用質粒DNA小提試劑盒 (AxyPrepTMPlasmidMiniprepKit250-prepAxyPrep)擴大培養(yǎng)測序鑒定正確的菌液，測 定提取的重組質粒的濃度。取重組質粒3ug，單探針和多聚探針的制備依據(jù)序列方向分別 用Spel和Ncol酶切，使重組質粒線性化，用WizardRSVGelandPCRClean-UpSystem 試劑盒純化酶切產物，分別用T7和SP6RNA聚合酶對線性化質粒（lug)，通過體外轉錄完成 CG-probe，PL-probe單聚探針和（CG+PL)-polyprobe二聚探針的制備（圖1)。按試劑盒 的轉化效率，1μg模板產生10μg標記的RNA探針。取1μ1標記產物通過1. 5%的瓊脂糖 凝膠電泳進行檢測，檢測合格后的探針放于_80°C長期保存。
[0078] 3. 1CGRMV和PLMVd負義RNA單聚探針的制備
[0079] 用設計的帶酶切位點的CGRMV和PLMVd引物對采自福建和山東果園的桃樹葉片 樣品進行RT-PCR檢測，結果表明：在福建3個樣品和山東2個樣品中均擴增出354bp大小 的PLMVd;在福建1個樣品和山東2個樣品中擴增出394bp大小的CGRMV(圖2)。CGRMV 和PLMVdPCR產物切膠回收，克隆測序，通過Blast序列比對分析表明，擴增出的CGRMV和 PLMVd片段與GenBank中注冊相關病毒的核苷酸序列相應片段均具有較高一致性，一致性 分別為81 %~98%和96%~99%。
[0080] 挑選序列為反向插入的CGRMV和PLMVd的重組質粒的菌液，用質粒DNA小提試劑 盒，我們提取到了足量的重組質粒。Spel酶切結果顯示，CGRMV和PLMVd的重組質粒被成功 線性化（圖3)，用T7RNA聚合酶對線性化質粒，通過體外轉錄完成了CGRMV和PLMVd負義 RNA單探針的制備（CG-probe，PL-probe)。CGRMV負義RNA單探針的序列如序列表中序列5 所示；PLMVd負義RNA單探針的序列如序列表中序列6所示。
[0081] 3. 2CGRMV+PLMVd負義二聚RNA探針的制備
[0082] 對3. 1中獲得的重組質粒進行再次PCR擴增，獲得帶EcoRI酶切位點的CGRMV和 PLMVd產物，切膠回收后，兩片段分別用EcoRI酶切，獲得CGRMV和PLMVd的酶切片段，通過 兩片段連接，亞克隆到pGEM-Τ載體，經菌液PCR檢測和測序驗證，獲得了CGRMV和PLMVd成 功串聯(lián)的陽性克隆。經過測序分析，單菌落2, 3, 6, 7, 9, 13, 16菌液為CGRMV和PLMVd串聯(lián) 成功的陽性克?。▓D4)，基因片段大小為740bp(序列如序列表中序列7所示），與GenBank 中注冊相關病毒的核苷酸序列相應片段均具有較高一致性。挑出連接成功的正向插入載 體的CGRMV+PLMVd串聯(lián)的重組質粒的陽性菌液擴大培養(yǎng)，提取了足量的重組質粒。對重組 質粒Ncol酶切結果顯示，CGRMV+PLMVd的重組質粒被成功線性化（圖5)，用SP6RNA聚合 酶對線性化質粒，通過體外轉錄完成CGRMV+PLMVd負義RNA二聚探針的制備（CG+PL-poly 2probe)，CGRMV+PLMVd負義RNA二聚探針的序列如序列表中序列8所示。
[0083] 4斑點雜交檢測探針的靈敏性和特異性
[0084]RNA提取物經甲醛變性后，點到雜交膜上，隨后，利用地高辛標記的CG-probe， PL-probe單聚探針和（CG+PL)-poly2probe二聚探針按照Roche公司地高辛探針標記及檢 測試劑盒說明書進行預雜交和雜交。
[0085] 實驗中主要對不同RNA提取方法及變性方法的樣品，不同雜交溫度的雜交效果進 行了研究，優(yōu)化雜交條件。RNA提取方法包括改進的植物總RNACTAB提取法和多糖多酚植 物總RNA提取試劑盒法。RNA變性方法包括：
[0086] 變性方法一 ：1μ1的RNA加3μ1變性液（甲酰胺500μ1，37 %甲醛162μ1， 10XM0PS100μΙ)，混勻后于 65°C保溫 15min，置于冰上 5min，加入 4μ1 20XSSC。
[0087]變性方法二：4μ1的RNA加6μ1變性液（甲酰胺10μ1，37%甲醛10μ1，20XSSC 10μ1)，60°C保溫 20min，置于冰上 5min。
[0088] 變性方法三：3μ1的RNA加3μ1變性液（甲酰胺500μ1，37 %甲醛162μ1， 10XM0PS100μΙ)，混勻后于60°C保溫 20min，置于冰上 5min，加入 2μ1 20XSSC。
[0089] 變性方法四：：5ylRNA加3μ1 37%甲醛+2μ1 20XSSC，混勻后于60°C保溫 20min，置于冰上5min〇
[0090] 雜交溫度包括：60°C和68°C。
[0091] 經過幾種方法的比較最終確定：植物總RNACTAB提取法，變性方法四及60°C雜交 溫度，雜交16h雜交效果較好，用于本實驗檢測探針的靈敏性和特異性。
[009