逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別是涉及生物制品安全性檢測領(lǐng)域，更具體的說，是涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物制品是以微生物、細胞、動物或人源組織和體液等為原料，應(yīng)用傳統(tǒng)技術(shù)或現(xiàn)代生物技術(shù)制成，用于人類疾病的預(yù)防、治療和診斷的產(chǎn)品。人用生物制品包括:細菌類疫苗(含類毒素)、病毒類疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、細胞因子、生長因子、酶、體內(nèi)及體外診斷制品，以及其他生物活性制劑，如毒素、抗原、變態(tài)反應(yīng)原、單克隆抗體、抗原抗體復(fù)合物、免疫調(diào)節(jié)及微生態(tài)制劑等。
[0003]在生物制品的生產(chǎn)和應(yīng)用過程中會遇到一些諸如安全性的問題。如抗體藥物，單克隆抗體中小鼠雜交瘤細胞的使用，容易使單抗制品出現(xiàn)鼠源性病毒污染的可能；而多克隆抗體主用采用動物血清制備，也同樣存在動物血清來源的安全性問題。目前，很多基因制品涉及蛋白表達載體的構(gòu)建，這種構(gòu)建的細胞系容易出現(xiàn)病毒感染的隱患。如皰疫病毒(EBV)轉(zhuǎn)染的人成淋巴細胞系與小鼠骨髓瘤細胞融合后，其分泌的單克隆抗體容易出現(xiàn)小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染。再者，基因重組蛋白制品所使用的表達細胞系本身含有內(nèi)源性病毒，如中國倉鼠卵巢細胞自身存在內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，這也使得其分泌的蛋白存在安全隱患。作為生物制品的來源，均存在被細菌、病毒等微生物污染的可能性，因此在藥品安全性問題上，生物制品與傳統(tǒng)藥品最大的不同是:生物制品存在內(nèi)源性然染的可能。因此，WH0、美國FDA、中國CFDA以及歐洲相關(guān)部門已經(jīng)出具相應(yīng)法規(guī)并規(guī)定:存在內(nèi)源性污染的生物制品，在生產(chǎn)工藝中必須具備去除/滅活內(nèi)源性污染的工藝，而且，必須對此工藝及產(chǎn)品進行生物安全性檢測以排除生物制品制備工藝及產(chǎn)品沒有潛在的病毒污染。
[0004]傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法，主要有感染性實驗技術(shù)、PCR法或電鏡法等，這些檢測方法存在的主要問題是檢測靈敏度和特異性不高，且對于主流的PCR法檢測病毒基因片段的方法存在非議。因為病毒的檢測多是在病毒滅活之后，而病毒滅活后其基因組可能會裂解成小片段，加之定量PCR的擴增產(chǎn)物分子量一般都很小，所以很容易造成假陽性的出現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法，它檢測靈敏度和特異性高。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法，包括以下步驟:
[0007]1)選擇支持所述逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的宿主細胞；
[0008]2)將待測樣品與所述宿主細胞共培養(yǎng)；
[0009]3)收集上清液，接種指示細胞系，檢測上清液是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。
[0010]所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包括A-MuLv、E-Mulv等遺傳信息錄在核糖核酸(RNA)上的病毒。
[0011]步驟1)，所述宿主細胞包括Mus Dunni (小鼠尾細胞克隆)等。
[0012]步驟2)，共培養(yǎng)條件為:逆轉(zhuǎn)錄病毒按一定的滴度加入到宿主細胞的培養(yǎng)液中，細胞、病毒在37±1°C下、5±1% C02中共同培養(yǎng)，細胞每5天傳代一次，共傳代2次。
[0013]步驟3)，所述指示細胞系包括PG4 S+L (莫洛尼式肉瘤轉(zhuǎn)化貓正常星型膠質(zhì)細胞)。
[0014]本發(fā)明用共培養(yǎng)法檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒，大幅提高了逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測的靈敏度和特異性，相比傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法更為準確、靈敏、可靠，重復(fù)性也更好，可廣泛地應(yīng)用于單克隆抗體、體外診斷制品等生物制品的檢測(例如無菌檢測、支原體檢測、物種鑒定、病毒檢測、細胞增殖測定等)，以及對生物制品生產(chǎn)過程中去除/滅活內(nèi)源性污染的工藝所進行的生物安全性檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1是無病毒的陰性對照細胞PG4 S+L。
[0016]圖2是逆轉(zhuǎn)錄病毒A-MuLV感染PG4 S+L細胞形成的斑。
【具體實施方式】
[0017]為對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合附圖及具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案詳述如下:
[0018]本實施例檢測A-MuLV (鼠白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法，具體包括以下步驟:
[0019]步驟1，選擇合適的支持A-MuLV逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的宿主細胞。
[0020]宿主細胞在有效擴增病毒、給病毒提供養(yǎng)分方面起重要作用。本實施例經(jīng)實驗結(jié)果最終選擇的宿主細胞是Mus Dunni (小鼠尾細胞克隆)。
[0021]步驟2，將待測樣品與步驟1所選的Mus Dunni宿主細胞進行共培養(yǎng)，即逆轉(zhuǎn)錄病毒按一定的滴度加入到宿主細胞的培養(yǎng)液中，宿主細胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒在37±1°C下、5±1%C02中共同培養(yǎng)，細胞每5天傳代一次，共傳代2次。通過共培養(yǎng)可進一步提高可能存在的逆轉(zhuǎn)錄病毒在樣品中的含量。
[0022]步驟3，收集上清液。
[0023]步驟4，接種合適的指示細胞系(本實施例的指示細胞系選擇的是PG4 S+L，A-MuLV病毒可以在該指示細胞系上形成特異性空斑)，檢測待測上清液是否存在A-MuLV逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染，如存在A-MuLV逆轉(zhuǎn)錄病毒，則在顯微鏡下可看到特異性空斑，并可以計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果可分析統(tǒng)計樣品中A-MuLV逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度。
[0024]上述逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法可廣泛應(yīng)用于細胞庫(如PG4 S+L-、mus dunn1、XC等細胞)生產(chǎn)與鑒定實驗(例如無菌檢測、支原體檢測、物種鑒定、病毒檢測、細胞增殖測定等)，或逆轉(zhuǎn)錄病毒模式病毒MuLV的生產(chǎn)與鑒定試驗(例如效價測定、純度檢測、一致性檢測、生物負荷檢測等)。
【主權(quán)項】
1.逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法，其特征在于，步驟包括: 1)選擇支持所述逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的宿主細胞； 2)將待測樣品與所述宿主細胞共培養(yǎng)； 3)收集上清液，接種指示細胞系，檢測上清液是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒包括A-MuLv、E-Mulv。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)，所述宿主細胞包括MusDunni。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)，共培養(yǎng)條件為:將逆轉(zhuǎn)錄病毒加入到宿主細胞的培養(yǎng)液中，在37 ± 1 °C、5 ± 1 % C02中共同培養(yǎng)，細胞每5天傳代一次，共傳代2次。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，所述指示細胞系包括PG4S+L。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)，檢測方法為:上清液接種指示細胞系所在的六孔板，6天后，顯微鏡下觀察指示細胞形成的空斑的數(shù)量并計數(shù)，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法，步驟包括：1)選擇支持所述逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的宿主細胞；2)將待測樣品與所述宿主細胞共培養(yǎng)；3)收集上清液，接種指示細胞系，檢測上清液是否存在逆轉(zhuǎn)錄病毒的污染。本發(fā)明用共培養(yǎng)法檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒，相比傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法，大幅提高了逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測的靈敏度和特異性，可廣泛地應(yīng)用于單克隆抗體、體外診斷制品等生物制品的檢測，以及對生物制品生產(chǎn)過程中去除/滅活內(nèi)源性污染的工藝所進行的生物安全性檢測。
【IPC分類】C12R1/93, C12Q1/70, C12Q1/06
【公開號】CN105420413
【申請?zhí)枴緾N201511017971
【發(fā)明人】馬鈴蘭, 董運海, 劉大鈞
【申請人】蘇州藥明康德檢測檢驗有限責任公司, 無錫藥明康德生物技術(shù)股份有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月30日