專利名稱：一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在體內(nèi)和體外能夠靶向傳遞逆轉(zhuǎn)錄病毒的高效基因治療技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。
背景技術(shù)：
目前，高效的基因治療工具已經(jīng)具備能夠準(zhǔn)確通過適當(dāng)?shù)妮d體將目的基因送達(dá)體內(nèi)特異性細(xì)胞或者組織的特點(diǎn)。逆轉(zhuǎn)錄病毒，如慢病毒，因其自身具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，可整合入基因組長期表達(dá)，以及促進(jìn)感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為非分裂細(xì)胞等功能顯示出了良好的應(yīng)用前
旦
ο許多研究以病毒載體假型嵌和包膜相結(jié)合的方法研制開發(fā)出了針對(duì)慢病毒包膜蛋白的嵌合抗體，目前已經(jīng)提高了慢病毒的基因傳遞特異性。在未來基因治療領(lǐng)域中，這些研究工作為進(jìn)一步修飾和改進(jìn)傳遞載體系統(tǒng)方法的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在眾多方法中一個(gè)相類似的策略就是應(yīng)用非偶聯(lián)的方法靶向識(shí)別細(xì)胞，這種方法是采用融合表達(dá)的方法使獨(dú)立的蛋白表達(dá)在病毒載體的表面。該方法已被證實(shí)，其制備更為簡便，同時(shí)可以促進(jìn)Y逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體靶向特異性細(xì)胞。這種方法采用配體蛋白或者細(xì)胞特異性抗體作為橋梁在體外將載體靶向傳遞到未經(jīng)修飾的具有禽肉瘤或者造血細(xì)胞組織增生病毒的特異性細(xì)胞包膜蛋白處。25年前，單克隆抗體和重組DNA技術(shù)的結(jié)合使得構(gòu)建在正常自然條件下所存在的以抗體為基礎(chǔ)的生物分子成為可能。其中，第一批雙向特異性抗體，其表面類似普通免疫球蛋白分子，但是其中兩個(gè)結(jié)合臂卻具有截然不同的結(jié)合特異性。使用該種方法Staerz等人將雙向特異性抗體結(jié)合于細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而達(dá)到靶向裂解腫瘤細(xì)胞的目的。從那以后， 人們構(gòu)建了不同種類的雙向特異性抗體來靶向腫瘤細(xì)胞。但是，這種方法的特點(diǎn)和局限性也逐漸顯示出來。與此同時(shí)，將雙向特異性抗體結(jié)合于其他細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的生物工程治療方法也已經(jīng)陸續(xù)被研發(fā)和構(gòu)建出來。例如靶向巨噬細(xì)胞表面的FcgRI/CD64和腫瘤細(xì)胞表面的HER2/neU或者EGFR。同時(shí)，越來越多的嵌合抗體及其與化療藥物偶聯(lián)的藥物已經(jīng)在試驗(yàn)中取得了良好的結(jié)果且被批準(zhǔn)應(yīng)用于腫瘤的臨床治療。盡管科研人員不斷改進(jìn)并減少生物工程制劑在臨床應(yīng)用過程中存在的問題，但單克隆抗體治療腫瘤仍然具有其局限性，藥物的靶向傳遞效率依然未能達(dá)到理想水平。然而， 正是這些在臨床治療中存在的問題為生物工程藥物的進(jìn)一步改進(jìn)提出了要求。臨床治療中，針對(duì)不同疾病的有效基因治療方法應(yīng)具備以下特點(diǎn)利用最佳條件高效并特異性靶向傳遞治療基因到目的細(xì)胞；同時(shí)，還要保持該基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和長期表達(dá)特性。目前，常采用血液直接注射的方法將藥物引入體內(nèi)，然后通過載體歸巢的方法將目的基因靶向傳遞至細(xì)胞或者器官。因此，現(xiàn)階段已經(jīng)有研究應(yīng)用生物工程和基因重組的方法以不同病毒載體為基礎(chǔ)開發(fā)出靶向基因治療傳遞系統(tǒng)。腺病毒和腺相關(guān)病毒載體已經(jīng)因?yàn)樗鼈兙哂薪Y(jié)合和感染機(jī)理單一的優(yōu)點(diǎn)而被應(yīng)用于靶向基因傳遞策略。盡管這些經(jīng)過改進(jìn)的病毒載體已經(jīng)被成功應(yīng)用于體外靶向特異性細(xì)胞，但卻因?yàn)樗鼈冏陨淼姆翘禺悓?dǎo)向性(特別是在肝臟細(xì)胞)以及改構(gòu)以后影響病毒載體的感染能力等缺點(diǎn)，使得它們?cè)隗w內(nèi)的應(yīng)用受到了限制。與腺病毒不同，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒是介導(dǎo)多核酸進(jìn)入細(xì)胞(如真核細(xì)胞)的另一種重要工具?！敖閷?dǎo)”一詞包括多種將多核苷酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的方法。其中包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)染等。逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，因此病毒基因組是RNA，當(dāng)宿主細(xì)胞感染逆轉(zhuǎn)錄病毒后， 基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成為DNA中間體，介導(dǎo)病毒基因高效整合入感染細(xì)胞的染色體DNA中。整合的DNA中間體是指前病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒家族是包膜單鏈RNA病毒，主要感染哺乳動(dòng)物，如牛、猴、羊和人以及禽類和鼠類等。逆轉(zhuǎn)錄病毒在眾多RNA病毒中，以它們通過RNA合成DNA 拷貝并且能夠整合入感染細(xì)胞的基因組的多種特殊方式而顯示出其獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。逆轉(zhuǎn)錄病毒家族中按照目前國際病毒分類標(biāo)準(zhǔn)，可分為7個(gè)屬α逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Alpharetrovirus, β 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Betaretrovirus, γ 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Gammaretrovirus, δ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬 Deltaretrovirus, ε逆轉(zhuǎn)錄病毒屬Epsilonretrovirus,慢病毒屬 Lentivirus和泡沫病毒屬Spumavirus。其中，慢病毒包括HIV-1、HIV-2和SIV ； γ逆轉(zhuǎn)錄病毒包括白血病病毒(鼠白血病病毒MLVs和貓白血病病毒)。如何將逆轉(zhuǎn)錄病毒應(yīng)用于體內(nèi)靶向特異性細(xì)胞或組織目前還是一個(gè)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法，以克服克服現(xiàn)有技術(shù)存在的靶向傳遞逆轉(zhuǎn)錄病毒制備效率低、體內(nèi)靶向性差的問題。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備方法，依次包括下述步驟 步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及特異性靶向標(biāo)志物的抗體細(xì)胞。步驟二、分別構(gòu)建相應(yīng)的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫，分別篩選能夠與逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白或特異性靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體個(gè)體。步驟三、根據(jù)步驟二中篩選獲得的噬菌體，將編碼抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白與特異性靶向標(biāo)志物的單鏈可變區(qū)片斷的cDNA克隆，重組表達(dá)雙向特異性配體。步驟四、雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合。上述步驟一中，特異性靶向標(biāo)志物的抗體是指抗EGFR (EGF受體)、EpCAM (表皮細(xì)胞粘附分子)、EphA2 (Eph受體酪氨酸激酶A2)、Her2 (人EGF受體2)等特異性腫瘤或某種疾病的標(biāo)志物分子。本發(fā)明中所描述的以雙向特異性配體介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向體內(nèi)細(xì)胞和組織的制備方法通過聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄病毒以及雙向特異性親和配體將基因選擇性傳遞到靶細(xì)胞或者組織。在以下具體的實(shí)施例中，逆轉(zhuǎn)錄病毒為慢病毒。其他逆轉(zhuǎn)錄病毒也可以在該系統(tǒng)中應(yīng)用于靶向傳遞基因。選擇性傳遞基因到靶細(xì)胞或者組織已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療、感染性疾病的治療和基因紊亂疾病的治療等。本發(fā)明中所說的雙向特異性親和配體可以選擇性結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒和靶向細(xì)胞或者組織。該配體可以先與逆轉(zhuǎn)錄病毒混合，然后應(yīng)用于治療；將二者同時(shí)應(yīng)用于治療；或者在病毒應(yīng)用后再用配體治療。雙向特異性配體至少有2個(gè)結(jié)合區(qū)域。一個(gè)可以與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合，另一個(gè)可以與靶細(xì)胞或者組織結(jié)合。2 個(gè)結(jié)合部分通過共價(jià)鍵結(jié)合在一起。好的雙向特異性配體不會(huì)抑制病毒與細(xì)胞的融合。其中，雙向特異性配體包括雙向特異性抗體、雙向特異性適體、雙向特異性小分子及嵌合體 (一個(gè)結(jié)合區(qū)域是小分子，另一個(gè)結(jié)合區(qū)是抗體)。本發(fā)明中，雙向特異性配體可以包括2個(gè)以上的結(jié)合區(qū)域。例如特異性結(jié)合于病毒表面蛋白的多適體?？梢酝ㄟ^多聚體載體(例如多賴氨酸，聚丙烯酸或類似物)形成雙向特異性親和配體被偶聯(lián)于多個(gè)特異性靶向細(xì)胞表面蛋白的抗體。將雙向特異性配體與病毒結(jié)合后，去除多余的未結(jié)合配體后即可用于治療。同時(shí)， 還可以通過偶聯(lián)的方法將雙向特異性配體共價(jià)偶聯(lián)(或加入交聯(lián)試劑進(jìn)行偶聯(lián)，例如戊醛或DIC)于病毒，但需要進(jìn)一步確定雙向特異性配體與病毒復(fù)合物的穩(wěn)定性，。盡管，近來的許多研究證實(shí)慢病毒可以在體內(nèi)以假型病毒的模式傳遞至特異性靶細(xì)胞。然而，重要的是細(xì)胞的非特異性傳遞仍然存在。該問題主要是因?yàn)榍逗习さ鞍咨系姆翘禺愋越Y(jié)合區(qū)未能得到很好的封閉。雙特異性配體則能通過特異性封閉慢病毒載體而較好地解決這個(gè)問題。一個(gè)好的雙向特異性配體可以通過其一端與包膜糖蛋白非特異性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而其另一端則可以特異性將病毒直接導(dǎo)向靶位。這一策略與嵌合包膜蛋白相比具有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)第一，它阻斷了病毒的非特異性結(jié)合區(qū)；第二，在病毒制備的時(shí)候保證了病毒包膜蛋白的完整性，從而降低對(duì)病毒包裝的影響，使病毒的制備達(dá)到較高的滴度。該病毒傳遞系統(tǒng)與傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒靶向策略相比較具有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)
(1)通過雙向配體的封閉端阻斷并封閉所傳遞病毒的非特異性結(jié)構(gòu)表位的結(jié)合能力；
(2)通過本發(fā)明所述的方法篩選并構(gòu)建的雙向特異性配體具有靶向和封閉逆轉(zhuǎn)錄病毒非特異性結(jié)合區(qū)的雙重作用；
(3)通過本發(fā)明所述的方法篩選并構(gòu)建的雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)合不影響逆轉(zhuǎn)錄病毒制備的滴度。
具體實(shí)施例方式下面將通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明
實(shí)施例1 制備雙向特異性抗體靶向Her2腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的具體方法，依次包括下述步驟
步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及抗Her2抗體細(xì)胞。a. VSV-G 抗原選擇
成熟VSV-G蛋白或其結(jié)合區(qū)域可用于免疫小鼠，從而制備單鏈可變區(qū)片斷抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫。b.制備單克隆抗體的抗原免疫方法抗原成熟VSV-G蛋白
佐劑完全弗氏佐劑，不完全弗氏佐劑； 小鼠體重20g, Balb/C小鼠，雄性
免疫方法第一天，初始免疫，抗原與完全弗氏佐劑200μ 1混懸成乳濁液，皮下四點(diǎn)注射，每只200 μ 1 ；第14天，第二次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，皮下四點(diǎn)注射，每只200 μ 1 ’第24天，第三次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，皮下四點(diǎn)注射，每只200 μ 1 ；第35天，第四次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，靜脈注射，每只200 μ 1 ；第42天，尾靜脈取血檢測抗體滴度；第45天，第五次免疫，抗原與不完全弗氏佐劑200 μ 1混懸成乳濁液，靜脈注射，每只200 μ 1 ；第66天，第六次免疫，抗原與PBS 200 μ 1混勻，腹腔注射；4天后進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。c.抗腫瘤表面抗原Her2蛋白單鏈可變區(qū)片斷的制備
抗Her2 (人EGF受體2)單鏈可變區(qū)片斷的制備。可以參考有關(guān)文獻(xiàn)中所提示的序列片斷結(jié)構(gòu)構(gòu)建，也可以按照上述a和b的方法免疫小鼠產(chǎn)生抗體細(xì)胞。步驟二、構(gòu)建抗慢病毒或Her2抗體的單鏈可變區(qū)片斷的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫，方法如下
a.抗VSV-G蛋白抗體單鏈可變區(qū)片斷噬菌體呈現(xiàn)文庫的制備(具體方法參見Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Editor(s): Philippa M. 0' Brienl, Robert Aitken. Series: Methods in Molecular Biology, Volume No. : 178, Print ISBN: 978-0-89603-906-3)
從上述經(jīng)免疫雄性Balb/C小鼠脾臟和骨髓中提取總RNA(具體方法參見分子克隆第三版)。使用前保存于-70° C。使用MMuLv、01igo-dT18和隨機(jī)六聚體引物以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA(具體方法參見分子克隆第三版以及ProtoScript M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書，New England Biolabs公司)。通過后續(xù)3次PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增并重組合成重鏈，κ 輕鏈和λ輕鏈的可變區(qū)基因(VH，V κ和νλ)。第一次PCR產(chǎn)物由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成。 重鏈5’引物設(shè)計(jì)時(shí)引入SfiI位點(diǎn)，輕鏈3’引物引入NotI位點(diǎn)。輕鏈5’引物同時(shí)還含有鏈接區(qū)域(Gly4Ser)3。重鏈3’端引物與之相應(yīng)。和νλ基因的等量PCR產(chǎn)物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作方法經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后將VH和Vk混合。第二次PCR，使用pfu (DNA聚合酶)擴(kuò)增并組裝重鏈和輕鏈。組裝PCR反應(yīng)包括等摩爾混合重鏈(VH)和輕鏈(V κ或V λ )基因產(chǎn)物。 第三次PCR反應(yīng)根據(jù)第二次PCR產(chǎn)物加入篩選出的相應(yīng)基因弓I物PCR構(gòu)建全長單鏈可變區(qū)片斷基因。使用Pfu聚合酶和1 μ 1第二次PCR獲得的組合產(chǎn)物反應(yīng)，此次獲得的產(chǎn)物是從 SfiI到NotI經(jīng)過充分?jǐn)U增延長的單鏈可變區(qū)片斷基因，樣品經(jīng)過純化后可用于后續(xù)克隆。使用SfiI和NotI對(duì)PCR擴(kuò)增得到的單鏈可變區(qū)片斷cDNA和pCANTAB5E噬菌體中間載體進(jìn)行雙酶切。將單鏈可變區(qū)片斷產(chǎn)物插入PCANTAB5E載體中產(chǎn)生單鏈可變區(qū)片斷基因融合文庫。b.抗Her2蛋白抗體單鏈可變區(qū)片斷噬菌體呈現(xiàn)文庫的制備方法與a相同。c.篩選文庫獲得高親和力抗體的片斷序列
分別使用成熟的VSV-G結(jié)合區(qū)與Her2抗原蛋白在噬菌體文庫中篩選高親和力克隆。使用96孔板篩選呈現(xiàn)特異性單鏈可變區(qū)片斷的噬菌體顆粒。將不同的蛋白抗原按照 (50-600 μ g/ml)包被于孔中。每個(gè)文庫中加入IO11和IO12個(gè)噬菌體顆粒，室溫孵育2小時(shí)。 用PBST (0. l%Tween-20)洗10次，去除未結(jié)合的噬菌體。然后用PBS洗10次。用50 μ 1 的50mM甘胺鹽酸ρΗ2.0 (10分鐘后立即中和至pH7. 4)。洗脫結(jié)合的噬菌體。將洗脫下來的噬菌體感染指數(shù)生長時(shí)期的大腸桿菌TGl細(xì)胞。挑取單一噬菌體感染的克隆并擴(kuò)增噬菌體顆粒。加入M13K07或KM13輔助噬菌體培養(yǎng)，每個(gè)抗原選擇2_3輪后，使用ELISA方法鑒定抗原結(jié)合能力。
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步驟三、構(gòu)建靶向Her2腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的雙向特異性單鏈可變區(qū)片斷，方法如下
使用連接體(Gly4Ser)混合兩單鏈可變區(qū)片斷(抗VSV-G和抗Her2腫瘤表面抗原)并表達(dá)雙向特異性抗體(具體方法參見Generation of Bispecific and Tandem Diabodies, Chapter 14, Robert Aitken (ed. ), Antibody Phage Display, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 562)。第一次PCR為獨(dú)立產(chǎn)生兩個(gè)不同單鏈可變區(qū)片斷的反應(yīng)。第一個(gè)單鏈可變區(qū)片斷的5’引物與第二個(gè)單鏈可變區(qū)片斷的3’引物分別引入適當(dāng)?shù)目捎糜诳寺〉南拗菩悦盖形稽c(diǎn)。第二個(gè)單鏈可變區(qū)片斷的5’引物含有連接區(qū)域的部分可以與第一個(gè)單鏈可變區(qū)的3’ 引物相配對(duì)。經(jīng)凝膠純化后取兩個(gè)PCR的等量產(chǎn)物混合后，經(jīng)pfu (DNA聚合酶)組裝并延伸(不加引物)。第三次反應(yīng)由第二次PCR產(chǎn)物加入具有適當(dāng)酶切位點(diǎn)的第一次單鏈可變區(qū)片斷5’引物和第二次單鏈可變區(qū)片斷3’引物構(gòu)建全長(2個(gè)單鏈可變區(qū)片斷串聯(lián)體)2。將 PCR產(chǎn)物純化后克隆進(jìn)入CMV載體，并在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生雙向特異性抗體(scFV2)。步驟四、雙向抗體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合將適量抗VSV-G和抗Her2腫瘤表面抗原的雙向抗體與有GFP標(biāo)記或無標(biāo)記的的慢病毒混合。實(shí)施例2 制備雙向特異性抗體靶向PSCA腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的具體方法，依次包括下述步驟
前列腺癌是發(fā)病率較高的腫瘤之一，是目前美洲男性腫瘤致死的第二大病因。前列腺癌常因?yàn)檗D(zhuǎn)移入骨和表現(xiàn)為激素非依賴性腫瘤生長形式而導(dǎo)致死亡。生理性前列腺腫瘤模型的發(fā)現(xiàn)和建立，如LAPC-9移植瘤模型，為前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展機(jī)理和治療相關(guān)領(lǐng)域的研究奠定了基礎(chǔ)。通過前列腺癌細(xì)胞抗原(PSCA)靶向前列腺腫瘤細(xì)胞的具體方法是
步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及抗PSCA抗體細(xì)胞。具體方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于靶向特異性腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物為PSCA蛋白。步驟二、構(gòu)建抗慢病毒或PSCA抗體的單鏈可變區(qū)片斷的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫。具體方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于靶向特異性腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物為PSCA蛋白。步驟三、構(gòu)建靶向PSCA腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的雙向特異性單鏈可變區(qū)片斷，具體方法與實(shí)施例1相同，不同之處在于靶向特異性腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物為PSCA蛋白。步驟四、雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合。具體方法與實(shí)施例1相同。LAPC-9細(xì)胞來源于人骨轉(zhuǎn)移，可經(jīng)過移植入SCID小鼠后形成表達(dá)前列腺特異性抗原和野生型雄激素受體(Id)的荷瘤小鼠模型。經(jīng)過篩選后約一半為激素非依賴性和微轉(zhuǎn)移性小鼠模型，是臨床研究人前列腺腫瘤發(fā)生和發(fā)展機(jī)理的良好模型。我們制備的雙向特異性抗體可以特異性將慢病毒傳遞入活體動(dòng)物的前列腺癌中， 并且我們制備的載體在LAPC-9模型系統(tǒng)中也顯示出了良好的作用。PSCA編碼一個(gè)具有 123位氨基酸的蛋白。氨基末端具有信號(hào)序列(一個(gè)碳端GPI鉚定序列和多氮糖基化位點(diǎn))。 PSCA的mRNA在雄激素依賴和非依賴前列腺荷瘤小鼠體內(nèi)均表達(dá)上調(diào)。PSCA表達(dá)于80%以上的前列腺癌和LAPC-9移植瘤中，是一個(gè)確定的治療靶位。因此，在該實(shí)施例中，我們將具有抗PSCA和抗VSV-G特性的雙向特異性抗體與慢病毒載體相結(jié)合進(jìn)行靶向治療。實(shí)施例3 雙向特異性抗體靶向Her2腫瘤細(xì)胞傳遞慢病毒的體內(nèi)和體外傳遞效果的鑒定方法
a.將混合產(chǎn)物分別加入表達(dá)和不表達(dá)特異性腫瘤表面抗原Her2的腫瘤細(xì)胞:MCF_7 (Her2-)和SK0V-3 (Her2+),分別在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)第2和第3天通過流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組不同腫瘤細(xì)胞GFP的表達(dá)效率。計(jì)數(shù)不同組細(xì)胞中GFP的陽性率，不表達(dá)特異性腫瘤表面抗原的腫瘤細(xì)胞GFP陽性率應(yīng)小于90% ；表達(dá)特異性腫瘤表面抗原的腫瘤細(xì)胞GFP陽性率應(yīng)大于90%。 b.將混合產(chǎn)物經(jīng)靜脈注射入MCF-7 (Her2-^nSK0V_3 (Her2+)荷瘤小鼠體內(nèi)，檢測GFP在腫瘤和其他組織器官細(xì)胞中的表達(dá)情況。腫瘤細(xì)胞中GFP陽性率應(yīng)大于50% ；其余組織器官細(xì)胞GFP陽性率應(yīng)小于90%。
權(quán)利要求
1.一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備方法，依次包括下述步驟步驟一、通過免疫小鼠制備抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白(VSV-G)以及特異性靶向標(biāo)志物的抗體細(xì)胞；步驟二、分別構(gòu)建相應(yīng)的抗體噬菌體呈現(xiàn)文庫，分別篩選能夠與逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白或特異性靶蛋白特異性結(jié)合的噬菌體個(gè)體；步驟三、根據(jù)步驟二中篩選獲得的噬菌體，將編碼抗逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白與特異性靶向標(biāo)志物的單鏈可變區(qū)片斷的cDNA克隆，重組表達(dá)雙向特異性配體；步驟四、雙向特異性配體與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備方法，其特征在于所述的特異性靶向標(biāo)志物的抗體是指抗EGFR (EGF受體)、EpCAM (表皮細(xì)胞粘附分子)、 EphA2 (Eph受體酪氨酸激酶A2)、Her2 (人EGF受體2)等特異性腫瘤或某種疾病的標(biāo)志物分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙向特異性配體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。目前，單克隆抗體和重組DNA技術(shù)的結(jié)合使得構(gòu)建在正常自然條件下所存在的以抗體為基礎(chǔ)的生物分子成為可能，但單克隆抗體治療腫瘤其藥物的靶向傳遞效率依然未能達(dá)到理想水平。本發(fā)明通過應(yīng)用抗體噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)篩選具有抗包膜蛋白的特異性抗體，同時(shí)將其與抗腫瘤表面特異性標(biāo)志物抗體的可變區(qū)片斷構(gòu)建成雙向特異性抗體或者其它生物工程形式分子，從而建立可以在體內(nèi)和體外特異性傳遞逆轉(zhuǎn)錄病毒的系統(tǒng)。本發(fā)明能阻斷并封閉傳遞病毒的非特異性結(jié)構(gòu)表位的結(jié)合能力；具有靶向和封閉逆轉(zhuǎn)錄病毒非特異性結(jié)合區(qū)的雙重作用雙重作用；并且不影響逆轉(zhuǎn)錄病毒制備的滴度。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102344492SQ201010243428
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者劉鐳, 徐學(xué)明, 王天欣 申請(qǐng)人:西安杰諾瓦生物科技有限公司