用于siRNA的半乳糖簇-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及體內(nèi)靶向遞送RNA干擾(RNAi)多核苷酸到細(xì)胞的組合物。相較于單獨(dú)配體靶向，藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑改善體內(nèi)靶向。靶向配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分靶向的RNAi多核苷酸能單獨(dú)或與共靶向的遞送聚合物共同給予。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于siRNA的半乳糖簇-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分
【背景技術(shù)】
[0001]將多核苷酸和其他基本不能穿透細(xì)胞膜的化合物遞送到活細(xì)胞受到細(xì)胞復(fù)雜膜系統(tǒng)的限制。反義、RNAi和基因治療中使用的藥物是相對(duì)高親水性的聚合物，且通常帶較高負(fù)電荷。這些物理特征均嚴(yán)格限制其直接擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜?；诖嗽颍嗪塑账徇f送的主要障礙是將多核苷酸遞送穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。
[0002]一種已經(jīng)用于體內(nèi)遞送小核苷酸的方法是將所述核酸與小靶向分子或脂質(zhì)或固醇結(jié)合。雖然已在這些偶聯(lián)物中觀察到一些遞送和活性，但這些方法需要的核酸劑量非常大。[0003]還已開(kāi)發(fā)大量轉(zhuǎn)染試劑，其能實(shí)現(xiàn)體外將多核苷酸相當(dāng)有效地遞送到細(xì)胞。然而，用這些相同轉(zhuǎn)染試劑體內(nèi)遞送多核苷酸很復(fù)雜且由于體內(nèi)毒性、不利的血清相互作用和弱靶向而變得無(wú)效。體外作用良好的轉(zhuǎn)染試劑、陽(yáng)離子聚合物和脂質(zhì)，通常形成大的陽(yáng)離子靜電顆粒并使細(xì)胞膜不穩(wěn)定。體外轉(zhuǎn)染試劑的正電荷有助于通過(guò)電荷之間(靜電)的相互作用與核酸結(jié)合，因此形成核酸/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。正電荷還有益于載劑與細(xì)胞非特異性結(jié)合以及膜融合、去穩(wěn)定化或破壞。膜的去穩(wěn)定化有利于遞送基本不能滲透細(xì)胞膜的多核苷酸穿過(guò)細(xì)胞膜。雖然這些特性有利于核酸體外轉(zhuǎn)移，但它們會(huì)造成體內(nèi)毒性和靶向失效。陽(yáng)離子電荷與血清組分相互作用，導(dǎo)致多核苷酸轉(zhuǎn)染試劑相互作用的不穩(wěn)定、較低的生物利用率和弱靶向。體外有效的轉(zhuǎn)染試劑膜活性在體內(nèi)常導(dǎo)致毒性。
[0004]為了體內(nèi)遞送，載劑(核酸和結(jié)合的遞送劑)應(yīng)較小，直徑低于lOOnm，優(yōu)選低于50nm。低于20nm或低于IOnm的甚至更小復(fù)合物會(huì)更有用。大于IOOnm的遞送載劑體內(nèi)很少能到達(dá)血管細(xì)胞之外的細(xì)胞。靜電相互作用形成的復(fù)合物在暴露于生理鹽濃度或血清組分時(shí)傾向于聚集或瓦解。此外，體內(nèi)遞送載劑上的陽(yáng)離子電荷導(dǎo)致不良血清相互作用和因此造成弱生物利用率。有趣的是，高負(fù)電荷還會(huì)通過(guò)妨礙靶向所需的相互作用來(lái)抑制靶向的體內(nèi)遞送，即，靶向配體與細(xì)胞受體的結(jié)合。因此，體內(nèi)分布和靶向需要接近中性的載劑。沒(méi)有仔細(xì)調(diào)控的情況下，膜的破壞或去穩(wěn)定活性在體內(nèi)使用時(shí)有毒。用核酸遞送平衡載劑毒性在體外比體內(nèi)更容易實(shí)現(xiàn)。
[0005]Rozema等在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20040162260中顯示了可逆調(diào)控膜活性多胺的膜破壞活性。該膜活性多胺提供破壞細(xì)胞膜的方式。PH依賴(lài)性可逆調(diào)控提供限制靶細(xì)胞內(nèi)吞體活性，從而限制毒性的方法。其方法依賴(lài)于含2-丙酸-3-甲基馬來(lái)酸酐的多胺上的胺修飾。
[0006]該修飾通過(guò)伯胺轉(zhuǎn)變?yōu)轸然鶎?duì)(β羧基和Y羧基)將聚陽(yáng)離子轉(zhuǎn)變?yōu)榫坳庪x子，并可逆地抑制多胺的膜活性。Rozema等(Bioconjugate Chem.2003，14，51-57)報(bào)道了 β羧基不顯示完全明顯的負(fù)電荷且其自身不能抑制膜活性。已報(bào)道添加Y羧基基團(tuán)對(duì)有效抑制膜活性是必需的。為了能共遞送核酸與遞送載劑，所述核酸共價(jià)連接所述遞送聚合物。它們能用其生物學(xué)上不穩(wěn)定的偶聯(lián)遞送系統(tǒng)將多核苷酸體外遞送到細(xì)胞。然而，由于所述載劑帶有較高負(fù)電荷，且核酸和修飾的聚合物都具有高負(fù)電荷密度，所以此系統(tǒng)對(duì)體內(nèi)遞送無(wú)效。所述負(fù)電荷可能會(huì)抑制細(xì)胞特異靶向，并通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)增加非特異攝取。[0007]Rozema等在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20080152661中通過(guò)消除所述經(jīng)修飾膜活性聚合物的高負(fù)電荷濃度而改良了美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20040162260的方法。通過(guò)用中性親水靶向基團(tuán)(半乳糖)和位阻穩(wěn)定基團(tuán)(PEG)替代2-丙酸-3-甲基馬來(lái)酸酐的Y羧基，Rozema等能保持總體水溶性并可逆抑制膜活性，同時(shí)納入有效的體內(nèi)肝細(xì)胞靶向。如前，所述多核苷酸共價(jià)連接所述轉(zhuǎn)染聚合物。通過(guò)阻止所述多核苷酸從所述轉(zhuǎn)染聚合物上解離，保持所述多核苷酸與轉(zhuǎn)染聚合物的共價(jià)結(jié)合以確保體內(nèi)給予期間將所述多核苷酸與轉(zhuǎn)染聚合物共遞送到所述靶細(xì)胞中。需要多核苷酸和轉(zhuǎn)染聚合物的共遞送，這是由于轉(zhuǎn)染聚合物提供將所述多核苷酸從所述細(xì)胞外或內(nèi)吞區(qū)室內(nèi)穿過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20080152661證明了用該新改良生理響應(yīng)多聚偶聯(lián)物將多核苷酸，特別是RNAi寡核苷酸體內(nèi)高效遞送到肝細(xì)胞中。
[0008]然而，所述核酸與多胺的共價(jià)結(jié)合本身具有局限性。用于結(jié)合核酸和掩蔽劑的轉(zhuǎn)染聚合物修飾被電荷相互作用復(fù)雜化。帶負(fù)電核酸與帶正電聚合物的結(jié)合傾向于聚集，從而限制了混合物的濃度?？赏ㄟ^(guò)存在過(guò)量的聚陽(yáng)離子或聚陰離子來(lái)克服聚集。然而，該溶液限制了核酸和聚合物可配制的比率。此外，帶負(fù)電核酸結(jié)合到未修飾的陽(yáng)離子聚合物上引起所述復(fù)合物的濃縮和聚集，抑制聚合物修飾。所述聚合物的修飾形成陰性聚合物，削弱所述核酸的結(jié)合。
[0009]Rozema等還改進(jìn)了美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20080152661、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/307，490所述的技術(shù)。在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/307，490中，Rozema等顯示,通過(guò)謹(jǐn)慎選擇祀向分子并使合適靶向分子獨(dú)立地連接SiRNA和遞送聚合物，所述SiRNA和所述遞送聚合物能偶聯(lián)而仍保持2種元件體內(nèi)有效靶向細(xì)胞，且實(shí)現(xiàn)所述siRNA的有效功能性靶向遞送。在美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20080152661和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/307，490中使用的所述遞送復(fù)合物是相對(duì)較大的合成聚合物、聚(乙烯基醚)和聚(丙烯酸鹽)。所述較大聚合物能通過(guò)用于細(xì)胞特異性結(jié)合的2種靶向配體和用于增加掩蔽的PEG進(jìn)行修飾。較大聚合物對(duì)有效遞送是必需的，可能是通過(guò)膜活性增加和對(duì)于細(xì)胞內(nèi)吞體中核酸保護(hù)的改良。較大聚陽(yáng)離子與膜和陰離子RNA的相互作用更加強(qiáng)烈。
[0010]我們目前開(kāi)發(fā)了使用改良RNA干擾多核苷酸靶向部分的改善SiRNA遞送系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于體內(nèi)遞送RNA干擾多核苷酸到靶細(xì)胞中的組合物，所述組合物包括:與靶向配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向化合物偶聯(lián)的RNA干擾多核苷酸(siRNA-偶聯(lián)物)。所述靶向配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向化合物相較于單獨(dú)靶向配體具有改進(jìn)的體內(nèi)循環(huán)和靶向性質(zhì)。示范性靶向配體包括去唾液酸糖蛋白受體配體和葉酸。所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑在結(jié)合所述靶向配體時(shí)提供增強(qiáng)的組織靶向。然后可以單獨(dú)地或聯(lián)合遞送分子注射siRNA。
[0012]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，我們描述包含具有16個(gè)或更多碳原子的疏水基團(tuán)的藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑。當(dāng)結(jié)合靶向配體時(shí)，所述靶向配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑提供改善的siRNA體內(nèi)遞送。示例性合適疏水基團(tuán)可選自下組:膽固醇、棕櫚酰基、十六醇-8-烯酰基、油酰基、(9E，12E)-十八碳-9，12- 二烯?；?、二辛酰基和C16-C20?；?。具有少于16個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)在增強(qiáng)多核苷酸靶向上不太有效。[0013]用作多核苷酸靶向部分的藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑可選自下組:膽固醇、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基，其各可為線性、分支或環(huán)形。藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑優(yōu)選烴類(lèi)，僅包括碳和氫原子。然而，可允許保持疏水性的取代或雜原子，例如氟。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于體內(nèi)遞送RNA干擾多核苷酸到肝細(xì)胞中的組合物，所述組合物包括=ASGPr靶向的可逆掩蔽膜活性多胺(遞送聚合物)和偶聯(lián)半乳糖簇藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分的RNA干擾多核苷酸(siRNA-偶聯(lián)物)。所述遞送聚合物和所述siRNA-偶聯(lián)物分開(kāi)合成并可在單獨(dú)容器或單一容器中提供。所述RNA干擾多核苷酸沒(méi)有偶聯(lián)所述聚合物。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述膜活性多胺包括:由含胺單體、較低疏水性單體和較高疏水性單體的隨機(jī)多聚化形成的兩親性聚合物。含胺的單體包含選自下組的胺基側(cè)基:伯胺和仲胺。所述較低疏水性單體包含有1-6個(gè)碳原子的疏水側(cè)基。所述較高疏水性單體包含有12-36或更多個(gè)碳原子的疏水側(cè)基。選擇胺基團(tuán)與疏水基團(tuán)的比率以形成具有膜破壞活性的水溶性聚合物，優(yōu)選> I個(gè)胺單體/疏水單體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述聚合物具有60-80%的胺單體。疏水基團(tuán)可選自下組:烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基(其各可為線性、分支或環(huán)形)、固醇、類(lèi)固醇和類(lèi)固醇衍生物。疏水基團(tuán)優(yōu)選烴類(lèi)，僅包括碳和氫原子。然而，可允許保持疏水性且包括例如氟的取代或雜原子。特別合適的膜活性多胺包括聚乙烯基醚隨機(jī)三元共聚物或聚丙烯酸隨機(jī)三元共聚物。
[0016]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，ASGPr靶向的可逆遮蔽蜂毒肽包括通過(guò)所述蜂毒肽上的伯胺和含ASGPr配體的遮蔽劑反應(yīng)可逆修飾的蜂毒肽。若修飾基團(tuán)的切割使胺恢復(fù)則所述胺為可逆修飾。所述蜂毒肽的可逆修飾可逆地抑制所述蜂毒肽的膜活性。用掩蔽劑修飾聚合物胺還優(yōu)選中和胺的電荷。優(yōu)選的包含ASGPr配體的遮蔽劑包含具有雙取代馬來(lái)酸酐胺反應(yīng)基團(tuán)的半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。酐與胺的反應(yīng)可逆修飾所述胺形成馬來(lái)酰胺酸或馬來(lái)酸。在所述掩蔽狀態(tài)，可 逆掩蔽的蜂毒肽未表現(xiàn)膜破壞活性。抑制膜活性并提供細(xì)胞靶向功能即形成可逆遮蔽蜂毒肽，需要對(duì)所述蜂毒肽上的胺進(jìn)行多于80%或多于90%的可逆修飾。
[0017]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可逆掩蔽膜活性多胺包括通過(guò)聚合物上的胺和掩蔽劑之間的反應(yīng)可逆修飾的本發(fā)明膜活性多胺。若修飾基團(tuán)的切割使胺恢復(fù)則所述胺為可逆修飾。膜活性多胺的可逆修飾會(huì)可逆抑制膜活性多胺的膜活性。優(yōu)選地，掩蔽劑還可提供靶向功能和/或避免血清相互作用的功能。用掩蔽劑修飾聚合物胺還優(yōu)選中和胺的電荷。優(yōu)選的掩蔽劑包含具有雙取代馬來(lái)酸酐胺反應(yīng)基團(tuán)的半乳糖胺或半乳糖胺衍生物或聚乙二醇。酐與胺的反應(yīng)可逆修飾所述胺形成馬來(lái)酰胺酸或馬來(lái)酸。在所述掩蔽狀態(tài)，可逆的掩蔽膜活性多胺未表現(xiàn)膜破壞活性。抑制膜活性并提供細(xì)胞靶向功能(即形成可逆掩蔽的膜活化聚合物)可能需要用掩蔽劑對(duì)多胺上超過(guò)50%、超過(guò)55%、超過(guò)60%、超過(guò)65%、超過(guò)70%、超過(guò)75%、或超過(guò)80%的胺進(jìn)行可逆修飾。所述膜活性多胺的膜活性抑制和/或體內(nèi)靶向需要修飾多于50%的聚合物胺。
[0018]可將藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑內(nèi)的RNAi多核苷酸偶聯(lián)物和遞送聚合物給予哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述遞送聚合物和RNAi多核苷酸偶聯(lián)物在給予所述哺乳動(dòng)物前可在溶液中合并。在另一實(shí)施方式中，所述遞送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物可在單獨(dú)的溶液中共給予所述哺乳動(dòng)物。在另一實(shí)施方式中，所述遞送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物可依次給予所述哺乳動(dòng)物。對(duì)于依次給予，所述遞送聚合物可在給予所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物之前給予?；蛘撸瑢?duì)于依次給予，所述RNAi多核苷酸偶聯(lián)物可在給予所述遞送聚合物之前給予。
[0019]結(jié)合附圖，根據(jù)下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1.兩親聚(乙烯醚)隨機(jī)三元共聚物的聚合化反應(yīng)圖解。
[0021]圖2.顯示siRNA-膽固醇偶聯(lián)物對(duì)基因敲除的影響。
[0022]圖3.顯示疏水物大小對(duì)siRNA-疏水物偶聯(lián)物靶向肝臟的影響。
[0023]圖4.顯不就數(shù)種疏水基團(tuán)而目siRNA-疏水物偶聯(lián)物對(duì)基因敲除的影響。
[0024]圖5.顯示遞送聚合物對(duì)siRNA-疏水物偶聯(lián)物遞送到肝臟的影響。
[0025]圖6.GalNAc簇與RNA的連接。
[0026]圖7.顯示血漿中siRNA與不同藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑相連的持久性。
[0027]發(fā)明詳述
[0028]本文描述改進(jìn)的RNA干擾多核苷酸靶向部分。本發(fā)明的多核苷酸靶向部分包括與藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑聯(lián)合的靶向配體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述靶向配體和所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑彼此共價(jià)連接，然后與所述siRNA共價(jià)連接。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過(guò)生理上不穩(wěn)定的共價(jià)鍵連 接siRNA。
[0029]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，我們描述由疏水基團(tuán)構(gòu)成的藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑。更具體地，藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑由具有16個(gè)或更多碳原子的疏水基團(tuán)組成。示例性合適疏水基團(tuán)可選自下組:膽固醇、棕櫚?；?、十六醇-8-烯?；?、油酰基、(9E, 12E)-十八碳-9，12-二烯?；⒍刘；虲16-C20酰基。具有少于16個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)在增強(qiáng)多核苷酸靶向上不太有效。
[0030]用作多核苷酸靶向部分的藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑可選自下組:膽固醇、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基，其各可為線性、分支或環(huán)形。藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑優(yōu)選烴類(lèi)，僅包括碳和氫原子。然而，可允許保持疏水性的取代或雜原子，例如氟。
[0031]靶向配體和藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑相連以通過(guò)支架分子形成靶向配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分。所述靶向部分支架可以是能夠使所述靶向配體與所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑相連并且還能連接所述RNAi多核苷酸的任何小分子。一個(gè)示范性支架是賴(lài)氨酸或鳥(niǎo)氨酸。賴(lài)氨酸或鳥(niǎo)氨酸分子包括兩個(gè)胺基團(tuán)和一個(gè)羧基基團(tuán)，通過(guò)所述胺基團(tuán)可連接靶向配體和所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑，通過(guò)所述羧基基團(tuán)可以實(shí)現(xiàn)與所述RNAi多核苷酸的連接。舉例而言，也可以合成能夠共價(jià)連接所述半乳糖簇和所述siRNA多核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑。
[0032]本文描述體內(nèi)遞送RNA干擾(RNAi)多核苷酸到哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞的改良方法。之前，體內(nèi)遞送多核苷酸需要所述多核苷酸與所述遞送載劑的物理結(jié)合。所述多核苷酸靜電結(jié)合遞送載劑如聚陽(yáng)離子/核酸復(fù)合物、被所述遞送載劑包封如脂質(zhì)體和穩(wěn)定的核酸-脂質(zhì)顆粒(SNALP)、或共價(jià)連接遞送載劑如動(dòng)態(tài)聚偶聯(lián)物(Rozema等，2007)。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用合適的RNAi多核苷酸偶聯(lián)分子和合適的靶向遞送聚合物，所述RNAi多核苷酸可與所述遞送聚合物分離且仍實(shí)現(xiàn)所述多核苷酸的有效肝細(xì)胞遞送。
[0033]分離多核苷酸與遞送肽在配制、合成和生產(chǎn)上提供了優(yōu)勢(shì)。[0034]a)通過(guò)消除對(duì)多核苷酸和聚合物結(jié)合(通過(guò)共價(jià)連接或電荷之間的相互作用)的需求，所述聚合物和多核苷酸的濃度和二者的比率僅受到組分溶解度的限制，而不是所述結(jié)合復(fù)合物的溶解度或生產(chǎn)復(fù)合物的能力。溶解度提高使多核苷酸或遞送聚合物濃度增加，因此增加了劑量。
[0035]b)所述多核苷酸和遞送聚合物可在給予前的任何時(shí)候混合，或甚至分開(kāi)給予。因此，分離使所述組分以溶液或干燥形式分別儲(chǔ)存。
[0036]c)相比更大的內(nèi)在不穩(wěn)定的非共價(jià)遞送系統(tǒng)，可使用更小更穩(wěn)定的制劑。
[0037]d)沒(méi)有共價(jià)結(jié)合帶負(fù)電多核苷酸或不需要共價(jià)結(jié)合帶負(fù)電多核苷酸時(shí)，掩蔽遞送聚合物的生產(chǎn)更容易。
[0038]e)在多核苷酸沒(méi)有物理結(jié)合遞送聚合物時(shí)生產(chǎn)被簡(jiǎn)化且需要更少的步驟。
[0039]本發(fā)明包含下述通式結(jié)構(gòu)的偶聯(lián)遞送系統(tǒng):
[0040](M1 - L) x - P - (L - M2) y+N_T,
[0041]式中，N是RNAi多核苷酸，T是靶向配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑多核苷酸靶向部分，P是膜活性多胺，并且，包括靶向部分(例如對(duì)用于遞送至肝的唾液酸糖蛋白受體具有親和性的半乳糖或半乳糖衍生物)的遮蔽劑M1與P通過(guò)生理上可逆連接L (例如馬來(lái)酰胺酸連接)共價(jià)連接。L的切割在多胺P上恢復(fù)未修飾的胺。遮蔽劑M2是可選的。若存在，M2是通過(guò)生理可逆連接L如馬來(lái)酰胺酸連接與P共價(jià)連接的親水位阻穩(wěn)定劑。X和y各為整數(shù)。在其未修飾狀態(tài)中，P是膜活性多胺。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了適合于體內(nèi)遞送多核苷酸的膜活性多胺。遞送聚合物(M1-L)x-P-Oj- M2)y非膜活性。P胺通過(guò)結(jié)合M1和任選M2的可逆修飾來(lái)可逆地抑制或滅活P的膜活性并降低P的凈正電荷。足夠的掩蔽劑結(jié)合P以抑制聚合物的膜活性。x+y的值大于多胺P上50%，優(yōu)選大于60%，更優(yōu)選大于70%的胺，通過(guò)沒(méi)有任何掩蔽劑時(shí)P上的胺含量測(cè)定。如`果P是膜活性肽，例如蜂毒肽，則x+y的值大于多胺P上胺的80%，更優(yōu)選大于90%，如沒(méi)有任何遮蔽劑存在時(shí)P上的胺含量所確定?？赡孢B接L切割后恢復(fù)了未修飾的胺，從而P回復(fù)為其未修飾的膜活性狀態(tài)。選擇可逆連接L的可逆鍵，從而所述切割在所需的生理?xiàng)l件下發(fā)生，例如存在于所需組織、器官或亞細(xì)胞位置中。優(yōu)選的可逆連接是對(duì)pH不穩(wěn)定的連接。分別合成或生產(chǎn)(M1-L)x-P- (L-M2)y (ASGPr靶向的可逆掩蔽膜活性聚合物(掩蔽聚合物))和T-N (多核苷酸聚合物)。T或N都不直接或間接與P'UM1或M2共價(jià)連接。多核苷酸或多核苷酸偶聯(lián)物與所述掩蔽或未掩蔽聚合物的靜電或疏水連接不是體內(nèi)肝臟遞送多核苷酸所需。掩蔽聚合物和多核苷酸偶聯(lián)物可在同一容器中或分開(kāi)的容器中提供。其可在給予前合并、共同給予或依次給予。
[0042]聚合物
[0043]本發(fā)明的聚合物為兩親膜活性多胺。聚合物是通過(guò)稱(chēng)為單體的較小單元一起重復(fù)結(jié)合建立的分子。聚合物可為使用單一單體的同聚物或聚合物可為使用兩種或更多不同單體的共聚物或異聚物。聚合物的主鏈由原子組成，其鍵為聚合物長(zhǎng)度延伸所需。聚合物的側(cè)鏈由原子組成，其鍵不是聚合物長(zhǎng)度延伸所需。
[0044]更具體地，本發(fā)明的聚合物為兩親膜活性隨機(jī)共聚物。隨機(jī)共聚物中的單體沒(méi)有沿著主鏈的定義或排列，書(shū)面表示為例如-Ax - By -或-Ax - By - Cz -。所述聚合物的一般組成反映了輸入單體比率。然而，一種單體與另一種的精確比率在各主鏈間不同。單體的分布還可根據(jù)單一聚合物的長(zhǎng)度而不同。而且，單體的化學(xué)特性可能影響其納入到隨機(jī)共聚物中的比例及其在所述聚合物中的分布。雖然單體在隨機(jī)聚合物中的比率取決于單體的輸入率，但所述輸入率不精確匹配納入單體的比率。
[0045]兩親性
[0046]本領(lǐng)域熟知并了解兩親性或兩親聚合物，其具有親水(極性，水溶性)和疏水(非極性，親脂性，水不溶性)基團(tuán)或部分。
[0047]親水基團(tuán)定性指示所述化學(xué)部分偏好水。通常，所述化學(xué)基團(tuán)為水溶性，且為水的氫鍵供體或受體。親水基團(tuán)可以帶電荷或不帶電荷。帶電基團(tuán)可帶正電(陰離子)或帶負(fù)電(陽(yáng)離子)或二者(兩性離子)。親水基團(tuán)的例子包括下述化學(xué)部分:碳水化合物、聚氧乙烯、某些肽、寡核苷酸、胺、酰胺、烷氧基酰胺、羧酸、硫磺和羥基。
[0048] 疏水基團(tuán)定性指示所述化學(xué)部分避開(kāi)水。通常此類(lèi)化學(xué)基團(tuán)非水溶性，且不傾向于形成氫鍵。親脂基團(tuán)溶于脂肪、油、脂質(zhì)和非極性溶劑且只有很小或沒(méi)有能力形成氫鍵。含兩個(gè)(2)或更多碳原子的烴類(lèi)、某些取代烴、膽固醇和膽固醇衍生物為疏水基團(tuán)和化合物的示例。
[0049]如本文所用，涉及兩性聚合物時(shí)，部分定義為當(dāng)一個(gè)共價(jià)鍵斷裂并由氫代替時(shí)衍生的分子。例如，丁胺中碳和氮鍵間斷裂并由氫替代會(huì)產(chǎn)生氨(親水)和丁烷(疏水)。若在氮-碳鍵處切割1，4-二氨基丁烷并用氫替代，所得分子再次是氨(2X)和丁烷。然而，1，4，- 二氨基丁烷不視作兩性，因?yàn)槭杷糠值牡男纬尚枰獌蓚€(gè)鍵的斷裂。
[0050]如本文所用，表面活性聚合物降低水的表面張力和/或與其他相的界面張力，從而正吸附于液/氣界面。表面活性特征通常源于物質(zhì)分子是兩親性或兩性。
[0051]膜活性
[0052]如本文所用，膜活性聚合物是表面活性的兩親性聚合物，其能在生物膜上誘導(dǎo)一種或多種下述影響:膜變化或破壞從而使膜不透性分子進(jìn)入細(xì)胞或穿過(guò)膜，在膜上形成孔，膜分裂，或所述膜的破壞或溶解。如本文所用，膜或細(xì)胞膜包括脂雙層。膜的變化或破壞可用至少一個(gè)下述試驗(yàn)中的聚合物活性來(lái)進(jìn)行功能性定義:紅血細(xì)胞裂解(溶血)、脂質(zhì)體滲漏、脂質(zhì)體融合、細(xì)胞融合、細(xì)胞裂解、和內(nèi)吞體釋放?？梢鸺?xì)胞膜裂解的膜活性聚合物也稱(chēng)為膜裂解聚合物。優(yōu)選在質(zhì)膜上引起內(nèi)吞體或溶酶體破壞的聚合物被認(rèn)為是內(nèi)吞體裂解性。膜活性聚合物對(duì)細(xì)胞膜的影響可以是短暫的。膜活性聚合物具有對(duì)膜的親和性，并引起雙層結(jié)構(gòu)的變性或變形。膜活性聚合物可為合成的或非天然兩親性聚合物。
[0053]如本文所述，膜活性聚合物不同于稱(chēng)為細(xì)胞滲透肽的一類(lèi)聚合物或例如源自HIVTAT蛋白的富含精氨酸的肽、觸角肽、VP22肽、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、富含精氨酸的人工肽、富含胍鹽的人工小聚合物等化合物所代表的聚合物。雖然細(xì)胞滲透化合物看起來(lái)能轉(zhuǎn)運(yùn)一些分子穿過(guò)膜，從脂雙層的一側(cè)到其另一側(cè)，明顯不需要胞吞也不需要破壞膜的完整性，但其機(jī)制尚不理解。
[0054]多核苷酸遞送到細(xì)胞中由膜活性聚合物介導(dǎo)，其破壞或使質(zhì)膜或內(nèi)囊泡膜(如內(nèi)吞體或溶酶體)不穩(wěn)定，包括在膜上形成孔、或破壞內(nèi)吞體或溶酶體囊泡從而允許所述囊泡的內(nèi)含物釋放到細(xì)胞胞質(zhì)中。
[0055]內(nèi)吞體裂解
[0056]內(nèi)吞體裂解性聚合物是響應(yīng)pH變化的聚合物，能引起內(nèi)吞體的破壞或裂解，或者使通常細(xì)胞膜不透性化合物如多核苷酸或蛋白從細(xì)胞內(nèi)膜包裹的囊泡如內(nèi)吞體或溶酶體中釋放。內(nèi)吞體裂解聚合物在生理相關(guān)PH范圍內(nèi)(通常pH5.5-8)物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化。該變化可為電荷、疏水性、或親水性改變引起的所述聚合物溶解度或與其他分子或膜相互作用的能力發(fā)生變化。示例性內(nèi)吞體裂解聚合物具有PH不穩(wěn)定基團(tuán)或鍵?？赡嫜诒文せ钚跃酆衔镏醒诒蝿┩ㄟ^(guò)PH不穩(wěn)定鍵結(jié)合聚合物，所以可被認(rèn)為是內(nèi)吞體裂解聚合物。
[0057]蜂毒肽是蜂毒中天然產(chǎn)生的一種小兩親性膜活性肽。蜂毒肽可從生物來(lái)源分離或可合成。合成的聚合物“由人”通過(guò)化學(xué)過(guò)程配制或生產(chǎn)且不是通過(guò)天然發(fā)生的生物過(guò)程產(chǎn)生。本文中使用的蜂毒肽包括天然產(chǎn)生的蜂毒肽家族的多種蜜蜂毒液肽，所述蜂毒肽家族可以在以下物種的毒液中找到:西方蜜蜂(Apis mellifera)、中國(guó)蜜蜂(Apis cerana)、額斑黃胡蜂(Vespula maculifrons)、大胡蜂(Vespa magnifica)、墨胸胡蜂(Vespa velutinanigrithorax)、馬蜂屬 HQL-2001 (Polistes sp.HQL-2001)、小蜜蜂(Apis florae)、大蜜蜂(Apis dorsata)、中華蜜蜂(Apis cerana cerana)、亞非馬蜂(Polistes hebraeus)。本文中使用的蜂毒肽還包括具有與天然產(chǎn)生的蜂毒肽相同或類(lèi)似氨基酸序列的合成肽。具體而言，蜂毒肽氨基酸序列包括表1中所示的那些。合成的蜂毒肽可包含天然產(chǎn)生的L形式氨基酸或?qū)τ丑wD形式氨基酸(反(inverso))。然而，蜂毒肽應(yīng)基本包括所有L形式或所有D形式的氨基酸。所述蜂毒肽氨基酸序列也可以是逆向(逆(retro))。逆蜂毒肽可以具有L形式氨基酸或D形式氨基酸(逆反)。兩個(gè)蜂毒肽也可以共價(jià)連接以形成蜂毒肽二聚物。蜂毒肽可以具有連接所述肽的氨基末端或羧基末端的修飾基團(tuán)。然而，本文所用的蜂毒肽不包括含有彼此共價(jià)連接或與另一個(gè)聚合物或支架共價(jià)連接的兩個(gè)以上蜂毒肽的鏈或聚合物。
[0058]疏水基團(tuán)優(yōu)選烴類(lèi)，僅包括碳和氫原子。然而，可允許保持疏水性且包括例如氟的非極性取代或非極性雜原子。所述術(shù)語(yǔ)包括脂族基團(tuán)、芳族基團(tuán)、?；⑼榛?、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基，其各可為線性、分支或環(huán)形。所述術(shù)語(yǔ)疏水基團(tuán)還包括:固醇、類(lèi)固醇、膽固醇和類(lèi)固醇及膽固醇的衍生物。如本文所用，低疏水性單體或基團(tuán)包括具有二(2)-六(6)個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)。如本文所用，中等疏水性單體或基團(tuán)包括具有七(7)-十一(11)個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)。如本文所用，高疏水性單體或基團(tuán)包括具有十二
(12)-三十六(36)個(gè)或更多碳原子的疏水基團(tuán)。
[0059]選擇胺基團(tuán)與疏水基團(tuán)的比率以形成具有膜破壞活性的水溶性聚合物。本發(fā)明的優(yōu)選膜活性聚合物在≤lmg/mL、≤5mg/mL、≤10mg/mL、≤15mg/mL、≤20mg/mL、≤25mg/mL、和> 30mg/mL時(shí)可溶于水。本發(fā)明的優(yōu)選膜活性聚合物為表面活性。本發(fā)明的膜活性聚合物優(yōu)選大小范圍為約3kDa~約300kDa。由于所述聚合物是兩親性的，其在水溶液中自結(jié)合，臨界締合濃度為< lmg/mL。
[0060]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述膜活性多胺三元共聚物的單體納入率為約4~8個(gè)胺單體:3~5個(gè)低疏水性單體:1個(gè)高疏水性單體。在另一實(shí)施方式中，所述膜活性多胺的單體納入率為約5.4~7.5個(gè)胺單體:3~3.5個(gè)低疏水性單體:1個(gè)高疏水性單體。在另一實(shí)施方式中，所述膜活性多胺的單體納入率為約6個(gè)胺單體:約3個(gè)低疏水性單體:約I個(gè)高疏水性單體。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述疏水單體的疏水基團(tuán)由烷基組成。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述胺/低疏水性基團(tuán)共聚物用進(jìn)料率為約4~8個(gè)胺單體:約3~5個(gè)低級(jí)烷基單體的單體合成。在另一實(shí)施方式中，所述胺/低疏水性基團(tuán)共聚物用進(jìn)料率為約15個(gè)胺單體:4個(gè)低疏水性基團(tuán)單體的單體合成。[0062]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述胺/低疏水性基團(tuán)/高疏水性基團(tuán)三元共聚物用進(jìn)料率為約4~8個(gè)胺單體:約3~5個(gè)低級(jí)烷基單體:1個(gè)高級(jí)烷基單體的單體合成。在另一實(shí)施方式中，所述胺/低疏水性基團(tuán)/高疏水性基團(tuán)三元共聚物可用進(jìn)料率為約15個(gè)胺單體:4個(gè)低疏水性單體:1個(gè)高疏水性基團(tuán)單體的單體合成。
[0063]在一個(gè)實(shí)施方式中，特別合適的膜活性多胺包括具有含胺單體、含丁基單體和含高疏水性基團(tuán)單體的共聚物，其中所述高疏水性基團(tuán)含12~18碳原子。特別合適的膜活性多胺包括聚乙烯基醚隨機(jī)三元共聚物或聚丙烯酸隨機(jī)三元共聚物。
[0064]掩蔽
[0065]本發(fā)明的遞送聚合物包括可逆修飾的兩親性膜活性多胺，其中可逆修飾抑制膜活性、中和多胺以降低正電荷并形成幾乎中性電荷的聚合物、提供細(xì)胞類(lèi)型特異性靶向，并抑制所述聚合物的非特異性相互作用。所述多胺的可逆修飾是通過(guò)該多胺上胺的可逆修飾。
[0066]本發(fā)明的膜活性多胺能破壞質(zhì)膜或溶酶體/內(nèi)吞體膜。所述膜活性是多核苷酸細(xì)胞遞送的必要特征。然而，所述聚合物體內(nèi)給予時(shí)膜活性產(chǎn)生毒性。多胺還容易與許多陰離子組分體內(nèi)相互作用，導(dǎo)致不需要的生物分布。因此，體內(nèi)使用需要可逆掩蔽所述多胺的膜活性。所述掩蔽通過(guò)掩蔽劑與膜活性多胺的可逆結(jié)合形成可逆掩蔽膜活性聚合物即遞送聚合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。除了抑制膜活性外，所述掩蔽劑使聚合物免于非特異相互作用，減少血清相互作用，增加循環(huán)時(shí)間并提供細(xì)胞特異性相互作用即靶向。
[0067]掩蔽劑的必要特征總體為:抑制聚合物的膜活性、使聚合物免于非特異相互作用(降低血清相互作用、增加循環(huán)時(shí)間)和提供體內(nèi)肝細(xì)胞靶向。所述膜活性多胺在未修飾(未掩蔽)狀態(tài)時(shí)為膜活化，而在修飾(掩蔽)狀態(tài)時(shí)非膜活化(滅活)。足夠數(shù)量的掩蔽劑連接聚合物以實(shí)現(xiàn)所需水平的滅活。用合適的聚合物活性試驗(yàn)容易測(cè)定通過(guò)掩蔽劑結(jié)合的所需聚合物修飾水平。例如，若聚合物在給定試驗(yàn)中具有膜活性，則充足水平的掩蔽劑連接所述聚合物以在該試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)所 需水平的膜活性抑制。掩蔽需要修飾所述聚合物上> 50%、^ 60%, ^ 70%或> 80%的胺基團(tuán)，如沒(méi)有任何掩蔽情況下對(duì)聚合物上胺的定量所檢測(cè)。掩蔽劑的優(yōu)選特征還包括其結(jié)合所述聚合物會(huì)降低聚合物的正電荷，從而形成更中性的遞送聚合物。理想上所述掩蔽聚合物保持水溶性。
[0068]如本文所用，若修飾的聚合物沒(méi)有在體內(nèi)表現(xiàn)膜活性或顯示細(xì)胞特異性(即肝細(xì)胞)靶向，則膜活性多胺被掩蔽。若切割連接掩蔽劑和聚合物的鍵使得聚合物上的胺恢復(fù)從而回復(fù)膜活性，則所述膜活性多胺被可逆掩蔽。
[0069]另一必要特征是掩蔽劑通過(guò)生理可逆鍵共價(jià)結(jié)合膜活性多胺。通過(guò)使用生理可逆連接或鍵，所述掩蔽劑能在體內(nèi)從聚合物上切割，從而暴露所述聚合物且恢復(fù)所述未掩蔽聚合物的活性。通過(guò)選擇合適的可逆連接，可在所述膜活性聚合物被遞送或靶向所需細(xì)胞類(lèi)型或細(xì)胞位置后形成恢復(fù)其活性的偶聯(lián)物。連接的可逆性提供所述膜活性多胺的選擇性激活?？赡婀矁r(jià)連接包括可選自下組的可逆或不穩(wěn)定鍵:生理不穩(wěn)定鍵、細(xì)胞生理上不穩(wěn)定鍵、pH不穩(wěn)定鍵、pH極不穩(wěn)定鍵和極端pH不穩(wěn)定鍵。
[0070]本發(fā)明優(yōu)選的掩蔽劑能修飾水溶液中的聚合物(與該聚合物形成可逆鍵)。優(yōu)選的胺反應(yīng)基團(tuán)包含雙取代的馬來(lái)酸酐。優(yōu)選的掩蔽劑由下述結(jié)構(gòu)表示:
[0071]
【權(quán)利要求】
1.一種用于體內(nèi)遞送寡核苷酸至細(xì)胞的組合物，所述組合物包括:共價(jià)連接靶向配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分的RNA干擾多核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述RNA干擾多核苷酸通過(guò)生理不穩(wěn)定連接來(lái)共價(jià)連接靶向-配體-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑由具有16個(gè)或更多碳原子的疏水基團(tuán)組成。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑由具有16~20個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)組成。
5.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑選自下組:棕櫚?；?、十六碳-8-烯酰基、油?；?、(9E, 12E)-十八碳-9，12-二烯?；?、二辛?；虲16-C20?；?。
6.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑由膽固醇組成。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述靶向配體由細(xì)胞受體配體組成。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞受體配體包括去唾液酸糖蛋白受體靶向部分。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述去唾液酸糖蛋白受體靶向部分選自下組:半乳糖、半乳糖胺、N-甲?；肴樘前?、N-乙?；肴樘前?、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-異丁?；肴樘前贰?br> 10.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述去唾液酸糖蛋白受體靶向部分包括半乳糖簇。`
11.如權(quán)利要求10中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述半乳糖簇由N-乙?；肴樘前啡垠w組成。
12.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞受體配體包括葉酸。
13.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括多核苷酸遞送聚合物。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述多核苷酸遞送聚合物包括可逆改性的膜活性多胺。
15.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述RNA干擾多核苷酸選自下組:DNA、RNA、dsRNA、RNA 干擾多核苷酸、siRNA 和 miRNA。
16.一種用于體內(nèi)遞送多核苷酸至肝細(xì)胞的組合物，所述組合物包括:所述多核苷酸共價(jià)連接ASGPr靶向部分-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述ASGPr靶向部分選自下組:半乳糖、半乳糖胺、N-甲?；肴樘前贰-乙?；肴樘前贰-丙?；肴樘前?、N-正丁酰基半乳糖胺、N-異丁?；肴樘前贰肴樘谴睾蚇-乙酰基半乳糖胺三聚體。
18.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑選自下組:具有16個(gè)或更多碳原子的疏水基團(tuán)、具有16~20個(gè)碳原子的疏水基團(tuán)、棕櫚?；?、十六碳-8-烯?；?、油酰基、(9E，12E)-十八碳-9，12- 二烯酰基、二辛?；虲16-C20?；?，以及膽固醇。
19.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述ASGPr靶向部分-藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑靶向部分通過(guò)生理不穩(wěn)定鍵連接所述多核苷酸。
20.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述ASGPr靶向部分和藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)劑通過(guò)支架分子連接所述多核苷酸。
【文檔編號(hào)】C07H21/04GK103492568SQ201180060354
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月17日
【發(fā)明者】P·海德威格, T·霍夫曼, E·基塔斯, P·莫爾, I·魯爾, L·瓦利斯, D·B·羅澤瑪, D·L·劉易斯, D·H·維基菲爾德 申請(qǐng)人:箭頭研究公司