專利名稱：：基于馬傳染性貧血病毒(eiav)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，尤其(但不僅僅)涉及衍生自非靈長類動物慢病毒，并能將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至非分裂或緩慢分裂細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。有段時(shí)間，人們對研制基于慢病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒的小亞組)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)相當(dāng)有興趣。這一興趣的誘因首先是使用基于HIV的載體將抗HIV治療劑靶向HIV易感細(xì)胞的想法，其次是下列推測，即由于慢病毒能感染非分裂細(xì)胞(Lewis&Emerman1993，病毒學(xué)雜志，68，510)，基于這些病毒的載體系統(tǒng)將能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞(如Vile&Russel1995Brit.Med.Bull，51，12)?；贖IV的載體系統(tǒng)已經(jīng)產(chǎn)生(Buchschacher&Panganiban1992，病毒學(xué)雜志，66，2731)，使用該系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)了CD4+細(xì)胞，并按預(yù)期的那樣轉(zhuǎn)導(dǎo)了非分裂的細(xì)胞(Naldini等，1996科學(xué)272，263)。另外，慢病毒載體能很穩(wěn)定地長期表達(dá)所需基因。對經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的大鼠神經(jīng)元細(xì)胞而言至少為3個(gè)月。基于MLV的載體僅能在6周內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)所需基因。迄今為止產(chǎn)生的基于HIV的載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中導(dǎo)致整合的原病毒，其末端具有的HIVLTR限制了這些載體的使用，因?yàn)槌鞘褂脙?nèi)部啟動子，否則LTR不得不用作任何插入基因的表達(dá)信號。內(nèi)部啟動子的使用具有顯著的缺陷，將其它啟動子置于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)會導(dǎo)致不可預(yù)測的后果，其詳細(xì)記載于Bowtell等，1988，病毒學(xué)雜志，62，2464；Correll等，1994，血液84，1812；Emerman和Temin1984細(xì)胞39，459；Ghattas等，1991，分子細(xì)胞生物學(xué)，11，5848；Hantzopoulos等，1989PNAS86，3519；Hatzoglou等，1991，生物化學(xué)雜志，266，8416；Hatzoglou等，1988，生物化學(xué)雜志，263，17798；Li等，1992，人類遺傳學(xué)理論，3，381；McLachlin等，1993，病毒學(xué)，195，1；Overell等，1988，分子細(xì)胞生物學(xué)，8，1803；Scharfman等，1991PNAS88，4626；Vile等，1994，基因理論，1，307；Xu等，1989，病毒學(xué)，171，331；Yee等，1987PNAS84，5197。涉及的因素包括兩個(gè)啟動子的相對位置和方向，啟動子的特性，表達(dá)的基因和所采用的任何選擇方法。內(nèi)部啟動子的存在會影響包裝細(xì)胞系所能達(dá)到的轉(zhuǎn)導(dǎo)效價(jià)和整合載體的穩(wěn)定性。HIV和其它慢病毒LTR對基因表達(dá)具有病毒特異性的需求。例如，HIVLTR在缺乏病毒Tat蛋白時(shí)不具活性(Cullen1995AIDS9，S19)。因此，需要以某種方式修飾LTR以改變基因表達(dá)的需求。一些基因治療應(yīng)用特別地需要組織特異性的基因表達(dá)。HIV載體有很多顯著的缺陷，限制了它們對某些疾病的治療應(yīng)用。HIV-1的缺陷在于它是攜有潛在的致癌蛋白質(zhì)和序列的人類病原體。導(dǎo)入在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生的能表達(dá)HIVgag-pol的載體顆粒會將這些蛋白質(zhì)導(dǎo)入患者體內(nèi)，從而導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)。為此，需要研制不會將HIV蛋白質(zhì)導(dǎo)入患者體內(nèi)的基于慢病毒的載體?，F(xiàn)在，我們已發(fā)現(xiàn)可以提供改良的慢病毒載體，該載體克服了基于HIV載體的局限性。在研制任何逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)時(shí)，重要的是從逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中除去可抑制載體轉(zhuǎn)移異源基因能力的序列或可將不利的蛋白質(zhì)編碼序列轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒可被有效包裝的RNA序列長度有限，因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組長區(qū)域的存在嚴(yán)重限制了載體對異源編碼RNA的編碼能力。我們還發(fā)現(xiàn)可以基于非靈長類動物慢病毒提供慢病毒載體，該載體對異源編碼序列具有高編碼能力，并且將逆轉(zhuǎn)錄病毒的組分轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的能力降低。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)需要從非靈長類動物慢病毒中得到的載體基因組序列的量基本上低于基于HIV的載體所需要的量。對包裝HIV載體基因組的序列需求是復(fù)雜的。HIV-1包裝信號包含剪接供體位點(diǎn)，并含有g(shù)ag基因的5’非翻譯區(qū)域部分，其推定的二級結(jié)構(gòu)含有4個(gè)短莖-環(huán)。基因組別處的其它序列對HIV的有效衣殼化也是至關(guān)重要的。例如，有效包裝可歸功于gag蛋白編碼序列的前350個(gè)bp，并且涉及env未完全確定的區(qū)域。為了構(gòu)建能表達(dá)異源基因的HIV載體，使用了延伸至350bp長的gag蛋白編碼序列的包裝信號。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)非靈長類動物慢病毒的包裝信號結(jié)構(gòu)與HIV的完全不同。不同于4個(gè)莖-環(huán)的短序列后接著不完全確定的gag和env序列區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)gag基因的較短區(qū)域足以進(jìn)行有效包裝。實(shí)際上，EIAV載體中g(shù)ag基因較大區(qū)域的缺失是有利的，其可導(dǎo)致較高滴度的病毒載體產(chǎn)生?？墒褂眠@一信息提供由非靈長類動物慢病毒序列構(gòu)建的改良載體，相對于HIV載體而言，其具有高滴度和有利特征。本發(fā)明的第一方面提供了含有非靈長類動物慢病毒的缺失gag基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組，其中g(shù)ag中的缺失除去了gag編碼序列核苷酸350下游的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。優(yōu)選缺失從核苷酸350至少延伸至gagpol編碼區(qū)的C末端。更優(yōu)選缺失另外還除去了gag編碼區(qū)的核苷酸300，最優(yōu)選缺失僅保留gag編碼區(qū)的前150個(gè)核苷酸。然而，也可使用甚至更多的gag缺失，例如，gag編碼區(qū)含有g(shù)ag編碼區(qū)的前109個(gè)核苷酸。gag編碼區(qū)也可僅含有g(shù)ag編碼區(qū)的前2個(gè)核苷酸。慢病毒基因組的其它特征包含在病毒基因組中，是轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄和整合所必需的。它們至少是含有R區(qū)域和U5區(qū)域的序列，含多嘌呤序列片斷(PPT)的3’LTR序列和非靈長類動物慢病毒的3’LTR序列或含有非靈長類動物慢病毒序列和其它元件的雜合LTR的LTR部分。任選地，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的輔助基因，例如但不限于rev基因，tat基因，vif基因，nef基因，vpr基因或S2基因。也可添加其它組分，例如內(nèi)含子，剪接供體位點(diǎn)，rev效應(yīng)元件(RRE)，克隆位點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。另外，我們已驚奇地闡明可構(gòu)建出非靈長類動物慢病毒基本的載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)在載體生產(chǎn)或轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂細(xì)胞時(shí)既不需要S2，Tat，env也不需要dUTP酶。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，衍生得到載體的非靈長類動物慢病毒基因組缺乏一個(gè)或多個(gè)輔助基因。輔助基因的缺失非常有利。首先，它使產(chǎn)生的載體不含一般與慢病毒(如HIV)感染之疾病相關(guān)的基因。尤其是tat和env與疾病相關(guān)。其次，輔助基因的缺失使載體能包裝更多的異源DNA。第三，可刪除功能未知的基因，例如dUTP酶和S2，從而降低導(dǎo)致不利影響的風(fēng)險(xiǎn)。另外，我們發(fā)現(xiàn)非靈長類動物慢病毒基因組的前導(dǎo)序列是gag和gagpol高效蛋白質(zhì)表達(dá)所必需的。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，衍生得到載體的非靈長類動物慢病毒基因組缺乏tat基因但包括5’LTR末端和gagATG之間的前導(dǎo)序列。這些資料進(jìn)一步確定了一套最佳慢病毒載體的極限必需功能組分。所提供的載體具有最大的遺傳能力和高滴度，但不具有功能未知(S2，UTP酶)因此可能存在風(fēng)險(xiǎn)，或者是與AIDS相關(guān)的HIV蛋白質(zhì)類似物(tat，env)的輔助基因。本發(fā)明提供了衍生自非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其(1)含有缺失的gag基因，其中g(shù)ag中的缺失除去了gag編碼序列核苷酸350下游的一個(gè)或多個(gè)核苷酸；(2)其中非靈長類動物慢病毒基因組中缺失了一個(gè)或多個(gè)輔助基因；(3)其中非靈長類動物慢病毒基因組缺乏tat基因但包括5’LTR末端和gagATG之間的前導(dǎo)序列；以及(1)，(2)和(3)的組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有(1)和(2)和(3)的全部特征。本文所用的“非靈長類動物”載體指的是衍生自最初不是感染靈長類動物，尤其是人的病毒的載體。因此，非靈長類動物病毒載體包括感染非靈長類哺乳動物，如狗，綿羊和馬，爬行動物，鳥類和昆蟲的載體。本文所用的慢病毒載體是含有至少一個(gè)慢病毒組成成分的載體。優(yōu)選該組成成分參與載體感染細(xì)胞，表達(dá)基因或進(jìn)行復(fù)制的生物學(xué)機(jī)制。非靈長類動物慢病毒可以是一般不感染靈長類動物的慢病毒科家族的任何成員，其包括貓免疫缺損病毒(FIV)，牛免疫缺損病毒(BIV)，山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)，梅迪維斯納病毒(MVV)或馬傳染性貧血病毒(EIAV)。優(yōu)選慢病毒是EIAV。馬傳染性貧血病毒感染所有的馬，導(dǎo)致血漿病毒血癥和血小板減少(Clabough等，1991，病毒學(xué)雜志，656242-51)。據(jù)認(rèn)為，單核細(xì)胞變?yōu)榫奘杉?xì)胞的成熟化過程可控制病毒的復(fù)制。EIAV具有最簡單的慢病毒基因組結(jié)構(gòu)。除了gag，pol和env基因外，EIAV還編碼3個(gè)其它基因tat，rev和S2。Tat可作為病毒LTR的轉(zhuǎn)錄激活劑起作用(Derse和Newbold1993，病毒學(xué)，194530-6；Maury等，1994，病毒學(xué)，200632-42)，而Rev通過rev效應(yīng)元件(RRE)調(diào)節(jié)和協(xié)同病毒基因的表達(dá)(Martarano等，1994，病毒學(xué)雜志，683102-11)。據(jù)認(rèn)為，這兩種蛋白質(zhì)的作用機(jī)制與靈長類動物病毒的相應(yīng)機(jī)制非常類似(Martano等，文獻(xiàn)同上)。S2的功能未知。另外，已鑒定出EIAV蛋白質(zhì)Ttm，它是由在跨膜蛋白質(zhì)開始處與env編碼序列剪接到一起的tat第一外顯子編碼的。除蛋白酶外，非靈長類動物慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶含有第4個(gè)編碼dUTP酶的pol基因產(chǎn)物。它對這些慢病毒感染某些非分裂細(xì)胞類型的能力起到一定的作用。本發(fā)明第一方面的病毒RNA由啟動子轉(zhuǎn)錄，所述啟動子可以是病毒或非病毒來源，但能介導(dǎo)真核細(xì)胞如哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。任選在啟動子上游或下游加入增強(qiáng)子。RNA轉(zhuǎn)錄物終止于可以由慢病毒的3’LTR提供的聚腺苷酸化位點(diǎn)或不同的聚腺苷酸化信號。因此，本發(fā)明提供了DNA轉(zhuǎn)錄單位，其含有能介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組表達(dá)的啟動子并任選含有增強(qiáng)子。本文所述轉(zhuǎn)錄單位含有的核酸區(qū)域含有能被轉(zhuǎn)錄的序列。因此，此定義中包括編碼mRNA，tRNA和rRNA的序列。對啟動子而言，序列可以是有義或反義方向。根據(jù)眾所周知的技術(shù)，使用反義構(gòu)建體可抑制基因在細(xì)胞中表達(dá)。核酸可以是例如核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其類似物。編碼mRNA的序列任選包括一些或所有5’和/或3’轉(zhuǎn)錄但一般不翻譯或要不然與翻譯的編碼序列相連的側(cè)翼序列。還可任選包括一般與轉(zhuǎn)錄序列相連的相關(guān)轉(zhuǎn)錄控制序列，例如轉(zhuǎn)錄終止信號，聚腺苷酸化位點(diǎn)和下游增強(qiáng)子元件。核酸可包括cDNA或基因組DNA(可含有內(nèi)含子)。術(shù)語“啟動子”使用的是本領(lǐng)域的一般含義，例如基因表達(dá)的Jacob-Monod理論中的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語“增強(qiáng)子”包括與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的其它蛋白質(zhì)組分結(jié)合因而利于由其相關(guān)啟動子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動的DNA序列。優(yōu)選編碼第一病毒載體組分的轉(zhuǎn)錄單位的啟動子和增強(qiáng)子具有強(qiáng)活性，或在生產(chǎn)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的條件下能在生產(chǎn)細(xì)胞中被強(qiáng)誘導(dǎo)，和/或在生產(chǎn)第二病毒載體的條件下能在原代靶細(xì)胞中被強(qiáng)誘導(dǎo)。優(yōu)選編碼第二病毒載體組分的轉(zhuǎn)錄單位的啟動子和增強(qiáng)子具有強(qiáng)活性，或能在靶細(xì)胞中被強(qiáng)誘導(dǎo)。啟動子和/或增強(qiáng)子的活性可以是組成型有效的，或受組織或時(shí)間的限制。適當(dāng)?shù)氖芙M織限制的啟動子/增強(qiáng)子例子包括在腫瘤細(xì)胞中具有高活性的啟動子/增強(qiáng)子，例如MUC1基因，CEA基因或5T4抗原基因的啟動子/增強(qiáng)子。受時(shí)間限制的啟動子/增強(qiáng)子例子包括對局部缺血和/或低氧反應(yīng)的啟動子/增強(qiáng)子，例如低氧效應(yīng)元件或grp78或grp94基因的啟動子/增強(qiáng)子。一個(gè)優(yōu)選的啟動子-增強(qiáng)子組合是人巨細(xì)胞病毒(hCMV)主要即時(shí)早期(MIE)啟動子/增強(qiáng)子組合?？梢愿淖兿铝袇^(qū)域中的LTRU3(為了得到強(qiáng)組成型表達(dá)，誘導(dǎo)型表達(dá)或組織特異性表達(dá))；R(為了除去TAR莖環(huán))；或U5(為了使用例如得自牛生長激素基因的增強(qiáng)的不基于U5的聚腺苷酸化信號)。在一個(gè)構(gòu)型中，內(nèi)部啟動子盒是反向的，聚腺苷酸化信號被置于盒的下游。在另一實(shí)施方案中，所用的聚腺苷酸化信號含有至少一個(gè)內(nèi)含子。本發(fā)明的載體可以使用自我滅活的策略。通過缺失轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或3’LTR之U3區(qū)域中的增強(qiáng)子和啟動子已構(gòu)建出自我滅活的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。一輪載體復(fù)制之后，這些改變被拷貝至5’和3’LTR中，產(chǎn)生無活性的原病毒。然而，這種載體中LTR內(nèi)部的任何啟動子仍具有活性。使用此策略消除了病毒LTR中的增強(qiáng)子和啟動子對內(nèi)部置入基因轉(zhuǎn)錄的影響，這種影響包括增加轉(zhuǎn)錄或抑制轉(zhuǎn)錄。還可使用該策略消除3’LTR下游轉(zhuǎn)錄至基因組DNA中。人基因療法對此很在意，因?yàn)樵谠摨煼ㄖ蟹乐辜せ顑?nèi)源性癌基因非常重要。還構(gòu)建出另一種類型的自我滅活載體，該載體具有側(cè)翼于包裝信號的直接重復(fù)序列以使包裝信號在逆轉(zhuǎn)錄的過程中經(jīng)常被缺失，產(chǎn)生包裝缺損病毒。由于足夠長的直接重復(fù)序列的存在，所得原病毒中的大多數(shù)失去其包裝序列。通過設(shè)計(jì)載體，使包裝信號缺失重建在G418中選擇被載體感染之細(xì)胞的neo標(biāo)記nad，缺失率可增加至100％。此策略對基因療法應(yīng)用特別有用，因?yàn)樵诨虔煼ㄖ?，基因轉(zhuǎn)移之后載體的任何擴(kuò)散都是不必要的。在本發(fā)明第一方面的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所需的一個(gè)或多個(gè)目的核苷酸(NOI)被導(dǎo)入載體的克隆位點(diǎn)。這種治療基因可由置于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR中的啟動子表達(dá)，或由導(dǎo)入克隆位點(diǎn)的內(nèi)部啟動子表達(dá)。適當(dāng)?shù)腘OI克隆序列包括治療和/或診斷用的序列，其包括但不限于編碼細(xì)胞因子，趨化因子，激素，抗體，經(jīng)改造的免疫球蛋白-樣分子，單鏈抗體，融合蛋白，酶，免疫共-刺激分子，免疫調(diào)制分子，反義RNA，靶蛋白的transdominant陰性突變體，毒素，條件毒素，抗原，腫瘤抑制蛋白和生長因子，膜蛋白，血管活性蛋白和肽，抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(如連接有報(bào)道基團(tuán))的序列。當(dāng)被包括時(shí)，這種編碼序列一般與適當(dāng)?shù)膯幼涌刹僮飨噙B，所述啟動子可以是驅(qū)動核酶表達(dá)的啟動子或不同的啟動子。NOI編碼序列可編碼融合蛋白或編碼序列區(qū)段?？墒褂帽景l(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將NOI，例如激活前體藥物的酶傳遞至腫瘤位點(diǎn)以治療癌癥。此時(shí)，將適當(dāng)?shù)那绑w藥物與適當(dāng)?shù)募せ钋绑w藥物的酶聯(lián)合使用以治療個(gè)體(如患者)。適當(dāng)?shù)那绑w藥物與載體一起被施用。前體藥物的例子包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷磷酸酯(與堿性磷酸酶聯(lián)合，Senter等，1988，ProcNatlAcadSci854842-4846)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶聯(lián)合，Mullen等，1994，癌癥研究，541503-1506)；阿霉素-N-對羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素-V-酰胺酶聯(lián)合，Kerr等，1990，癌癥免疫及免疫療法31202-206)；對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(與羧肽酶G2聯(lián)合)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸酯(與β-內(nèi)酰胺酶聯(lián)合)；SR4233(與P450還原酶聯(lián)合)；9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(與HSV胸苷激酶聯(lián)合，Borrelli等，1988ProcNatlAcadSci857572-7576)；芥子前體藥物(與硝基還原酶聯(lián)合，F(xiàn)riedlos等，1997，藥物化學(xué)雜志，401270-1275)和環(huán)磷酰胺(與P450聯(lián)合，Chen等，1996，癌癥研究561331-1340)。通過病毒或非病毒載體可將本發(fā)明的載體傳遞至靶位點(diǎn)。眾所周知，載體是允許或便于一個(gè)實(shí)體從一個(gè)環(huán)境轉(zhuǎn)移至另一個(gè)環(huán)境的工具。例如，重組DNA技術(shù)中使用的一些載體能將如DNA區(qū)段(如異源DNA區(qū)段，如異源cDNA區(qū)段)的實(shí)體轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞。任選地，一旦進(jìn)入靶細(xì)胞，載體可發(fā)揮作用以將異源DNA維持在細(xì)胞內(nèi)或可用作DNA復(fù)制單位。重組DNA技術(shù)中所用載體的例子包括質(zhì)粒，染色體，人造染色體或病毒。非病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染方法。本文中的轉(zhuǎn)染包括使用非病毒載體將基因傳遞至靶哺乳動物細(xì)胞的方法。典型的轉(zhuǎn)染方法包括電穿孔，DNAbiolistics，脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，緊密DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體，免疫脂質(zhì)體，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法，陽離子試劑-介導(dǎo)的，陽離子表面的親水脂分子(CFA)(天然生物技術(shù)199614556)及其組合。病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體，腺相關(guān)病毒(AAV)載體，皰疹病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，桿狀病毒載體。載體的其它例子包括來自體內(nèi)的傳遞系統(tǒng)，其包括但不限于DNA轉(zhuǎn)染法，如電穿孔，DNAbiolistics，脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，緊密DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆?！敝傅氖墙?jīng)包裝的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其優(yōu)選能結(jié)合并進(jìn)入靶細(xì)胞。正如論述載體時(shí)所討論的，相對于野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒而言，顆粒的組分可被修飾。例如，可對顆粒的蛋白質(zhì)外膜中的Env蛋白進(jìn)行基因修飾以改變其靶向特異性或獲得一些其它所需的功能。優(yōu)選病毒載體優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)某些細(xì)胞類型。更優(yōu)選病毒載體是靶向載體，即具有相對于天然病毒而言有所改變的組織嗜性從而使載體靶向特定的細(xì)胞。對于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而言，通過修飾Env蛋白可達(dá)到這一目的。逆轉(zhuǎn)錄病毒第二載體的Env蛋白需要在原代靶細(xì)胞中成為無毒性的包膜或以無毒性的量產(chǎn)生的包膜，例如MMLV兼嗜性包膜或經(jīng)修飾的兼嗜性包膜。在這種情況下，優(yōu)選安全性特征是缺失逆轉(zhuǎn)錄病毒組分之間同源的區(qū)域或序列。優(yōu)選包膜可轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì)胞，適當(dāng)?shù)膃nv基因的例子包括但不限于VSV-G，MLV兼嗜性env，如4070Aenv，RD114豬白血病病毒env或流感病毒的血細(xì)胞凝集素(HA)。Env蛋白能與有限量人細(xì)胞類型上的受體結(jié)合，并且可以是含有靶向組成成分的經(jīng)改造的包膜。env和gag-pol編碼序列由在選定包裝細(xì)胞系中具有活性的啟動子和(任選地)增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄單位由聚腺苷酸化信號終止。例如，如果包裝細(xì)胞是人細(xì)胞，適當(dāng)?shù)膯幼?增強(qiáng)子組合是人巨細(xì)胞病毒主要即時(shí)早期(hCMV-MIE)基因的啟動子-增強(qiáng)子，可使用SV40病毒的聚腺苷酸化信號，其它適當(dāng)?shù)膯幼雍途巯佘账峄盘柺潜绢I(lǐng)域已知的。包裝細(xì)胞可以是被治療的個(gè)體體內(nèi)的包裝細(xì)胞，或也可以是體外培養(yǎng)的細(xì)胞，如組織培養(yǎng)細(xì)胞系。適當(dāng)?shù)募?xì)胞系包括哺乳動物細(xì)胞，如得自鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系或人細(xì)胞系。優(yōu)選包裝細(xì)胞系是人細(xì)胞系，例如293細(xì)胞系，HEK292，293-T，TE671，HT1080。或者，包裝細(xì)胞可以是得自被治療的個(gè)體的細(xì)胞，例如單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，干細(xì)胞，血細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。從個(gè)體中分離細(xì)胞，體內(nèi)施用包裝和載體組分，接著再施用自身包裝細(xì)胞?；蛘?，給體內(nèi)包裝細(xì)胞施用包裝和載體組分。將逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和載體組分導(dǎo)入個(gè)體細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，一個(gè)方法是通過瞬時(shí)三聯(lián)轉(zhuǎn)染將產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒所需的不同DNA序列，如env編碼序列，gag-pol編碼序列和缺損的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞(Landau&Littman1992，病毒學(xué)雜志，66，5110；Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體構(gòu)型將3個(gè)轉(zhuǎn)錄單位用作其生產(chǎn)系統(tǒng)，它們可表達(dá)基因組，gag-pol組分和包膜。包膜表達(dá)盒可包括多種包膜之一，如VSV-G或多種鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜，如4070A。通常，這3個(gè)表達(dá)盒由3個(gè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入適當(dāng)細(xì)胞系，如293T的質(zhì)粒表達(dá)或由穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系中的整合拷貝表達(dá)。另一種方法是使用另一種病毒作為3個(gè)表達(dá)盒的表達(dá)系統(tǒng)，所述病毒如桿狀病毒或腺病毒。這些都是核表達(dá)系統(tǒng)。迄今為止，使用痘病毒表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體系統(tǒng)的所有組分尚未見描述。尤其是，盡管慢病毒不尋常的密碼子使用及其RNA操作系統(tǒng)，如rev/RRE系統(tǒng)的需求是給定的，目前仍不清楚所有3個(gè)表達(dá)盒的摻入及其隨后在載體中的表達(dá)是否可行，所述載體在胞質(zhì)而不是核中進(jìn)行表達(dá)。迄今為止，仍存在這種可能性，即載體組分的表達(dá)及其在基因傳遞載體中的功能需要主要的核因子和核RNA操作途徑。本文描述了這種系統(tǒng)，證明慢病毒組分可在胞質(zhì)中制備，它們裝配成功能性的基因傳遞系統(tǒng)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是使痘病毒易于處理，表達(dá)水平升高，并能將內(nèi)含子維持在載體基因組中。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于體內(nèi)基因傳遞的雜合病毒載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有可得自或基于痘病毒的第一病毒載體和可得自或基于vectroviral載體，優(yōu)選慢病毒載體，甚至更優(yōu)選非靈長類動物慢病毒載體的第二病毒載體。由第一載體DNA編碼的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)必需的基因的表達(dá)可產(chǎn)生第二載體。所述基因包括逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol，包膜病毒和含有一個(gè)或多個(gè)治療或診斷用NOI的缺損逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的env基因。缺損的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一般含有具有逆轉(zhuǎn)錄功能的序列，5’長末端重復(fù)(LTR)的至少一部分，3’LTR的至少一部分和包裝信號。如果需要使第二載體變?yōu)閺?fù)制缺損的，第二載體可由位于單個(gè)或兩個(gè)或多個(gè)腺病毒或其它第一載體上的多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位編碼。在一些治療或?qū)嶒?yàn)的情況下，應(yīng)避免在體外由MVA衍生制備EAIV的需要。MVA-EIAV雜合體被直接傳遞至患者/動物體內(nèi)，例如將MVA-EIAV靜脈內(nèi)注射至小鼠的尾靜脈中，此重組病毒感染鼠的多個(gè)組織，如肺，脾臟等。被感染的細(xì)胞表達(dá)具有轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的EIAV，其含有基因治療用的治療基因。EIAV載體顆粒從這些細(xì)胞中芽出，并轉(zhuǎn)導(dǎo)相鄰的細(xì)胞。被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則含有整合拷貝的EIAV載體基因組并表達(dá)治療基因產(chǎn)物或其它所需的基因產(chǎn)物。如果治療基因產(chǎn)物的表達(dá)對宿主具有潛在的毒性，可通過特異性啟動子，如低氧效應(yīng)元件(HRE)調(diào)節(jié)表達(dá)，該元件可將表達(dá)限制于低氧環(huán)境中的那些細(xì)胞。針對肺/氣管上皮細(xì)胞的基因治療，如治療囊性纖維化，MVA-EIAV可以是鼻內(nèi)傳遞的氣溶膠形式。或者，可體外轉(zhuǎn)導(dǎo)巨噬細(xì)胞，然后再次進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生基于EIAV的載體的巨噬細(xì)胞工廠。另外，由于MVA不具有復(fù)制能力，MVA-EIAV雜合體也可用于治療免疫抑制的宿主。痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒屬的原型成員，它是第一個(gè)用于表達(dá)重組外源蛋白質(zhì)的病毒(Mackett等，1982，Paoletti&Panicalli1982)。痘苗病毒具有大于180kb的大DNA基因組，有報(bào)道表明它可容納大至25kb的外源DNA(Merchlinsky&Moss1992)。幾個(gè)其它的痘病毒株已被改造為重組表達(dá)載體(參見Carroll和Moss1997的綜述)，例如禽痘病毒(Taylor&Paoletti1988)，金絲雀痘病毒(Taylor等1991)，豬痘病毒(vanderLeek等1994)和昆蟲痘病毒(Li等1997)。另外，出于對安全性的考慮，已開發(fā)出幾個(gè)高度減毒的痘苗病毒株，它們對人和其它哺乳動物細(xì)胞無害，例如經(jīng)修飾的痘苗病毒Ankara(MVA)(Mayr1978，Sutter1992)，NYVAC(Paoletti等1994)，DNA復(fù)制酶缺損的痘苗病毒(Holzer等1997)。這些病毒都可以用于本發(fā)明。MVA得自具有復(fù)制能力的痘苗天花疫苗株Ankara。在雞胚成纖維細(xì)胞中傳代＞500次之后，病毒分離株在包括小鼠的多種免疫缺損動物模型中表現(xiàn)出高度減毒(Mayr等1978)。用減毒的分離株MVA接種120，000個(gè)人，大多數(shù)人無免疫應(yīng)答(Mahnel1994)，也沒有不良反應(yīng)。研究表明MVA可感染多種哺乳動物細(xì)胞，但僅在倉鼠腎細(xì)胞BHK-21中觀察到生產(chǎn)性的感染(Carroll1997)。在所有其它受試的哺乳動物細(xì)胞系中，觀察到早期表達(dá)，DNA復(fù)制和晚期表達(dá)導(dǎo)致非感染性的不成熟病毒顆粒的產(chǎn)生(Carroll1997，Meyer1991)。病毒復(fù)制研究表明極少數(shù)哺乳動物細(xì)胞可支持很低水平的感染性病毒產(chǎn)生，即每個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生1個(gè)感染性MVA顆粒的BS-C-1細(xì)胞(Carroll和Moss1997)。晚期基因表達(dá)通常產(chǎn)生比受早期啟動子控制的那些基因多10倍以上的蛋白質(zhì)(Chakrabarti等1997，Wyatt等1996)。在所有其它減毒痘病毒株中，很少在哺乳動物細(xì)胞中觀察到晚期基因表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，如MLV-HIV和慢病毒載體系統(tǒng)的產(chǎn)生需要構(gòu)建表達(dá)病毒基因組和必需結(jié)構(gòu)蛋白的生產(chǎn)細(xì)胞系以制備具有轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的病毒。一般說來，這是相對無效的方法，當(dāng)病毒是具有毒性包膜蛋白，如VSV-G的假型病毒時(shí)，該方法會進(jìn)一步復(fù)雜化。由重組痘病毒表達(dá)功能性基因組和所需的結(jié)構(gòu)蛋白可避免很多目前無效的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體生產(chǎn)技術(shù)。另外，這種重組痘病毒可直接注射至患者體內(nèi)以在體內(nèi)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒。因其非-復(fù)制表型及其進(jìn)行早期和強(qiáng)晚期表達(dá)以產(chǎn)生高滴度載體制品的能力，MVA是特別適于構(gòu)建痘病毒-逆轉(zhuǎn)錄病毒或痘病毒-慢病毒雜合體的痘病毒。為了產(chǎn)生功能性的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體基因組，RNA基因組的5’端應(yīng)是精確無誤的(Cannon等，1996)。對基于痘苗病毒的生產(chǎn)系統(tǒng)而言，這是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)楹芏喽幻绮《締幼雍修D(zhuǎn)錄效力的下游決定因素(Davison1989b，Moss1996)。然而，我們找到了幾個(gè)解決問題的方法a．使用T7啟動子和T7終止序列。b．使用早期啟動子(其中RNA起始位點(diǎn)下游的序列不是高度保守的)(Davison1989a)。c．使用痘苗病毒中期和晚期啟動子，其需要起始位點(diǎn)下游的其它序列與產(chǎn)生真正的5’末端的策略相結(jié)合，或者將其它下游序列置于兩個(gè)R區(qū)域。對晚期啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游4個(gè)核苷酸的特定序列是有要求的(Davison1989b,Moss1996)。在第一種情況下，核酶被置于啟動子下游，R區(qū)域上游。核酶被設(shè)計(jì)成順式裂解RNA以產(chǎn)生正確的5’末端。在第二種情況下，方法是修飾R區(qū)域以摻入額外的序列。對5’和3’LTRR區(qū)域都必須這么做。具有依賴于T7的系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是它需要通過兩個(gè)重組痘苗病毒感染細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)EIAV病毒顆粒。例如，一個(gè)MVA可攜有載體基因組(在T7啟動子的控制之下)和gag/pol和env序列(在痘苗病毒啟動子的控制之下)。其它MVA可攜有受痘苗病毒啟動子控制的T7聚合酶基因(Wyatt等1995)。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒也能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)不能被非慢病毒，如MLV有效轉(zhuǎn)導(dǎo)的緩慢分裂的細(xì)胞。緩慢分裂的細(xì)胞約3至4天分裂1次，其包括某些腫瘤細(xì)胞。盡管腫瘤含有快速分裂的細(xì)胞，但一些腫瘤細(xì)胞，尤其是腫瘤中心的細(xì)胞分裂仍很緩慢?；蛘撸屑?xì)胞可以是能進(jìn)行細(xì)胞分裂的生長停滯的細(xì)胞，例如腫瘤塊中央部分的細(xì)胞或干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞或CD34-陽性細(xì)胞?；蛘撸屑?xì)胞可以是分化細(xì)胞的前體，例如單核細(xì)胞前體，CD33-陽性細(xì)胞或骨髓前體?；蛘?，靶細(xì)胞可以是分化細(xì)胞，例如神經(jīng)元，星形細(xì)胞，膠質(zhì)細(xì)胞，微膠質(zhì)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞或肝細(xì)胞。從人個(gè)體分離之后，靶細(xì)胞可被體外轉(zhuǎn)導(dǎo)或直接進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明載體系統(tǒng)對一個(gè)或多個(gè)治療基因的傳遞可以單獨(dú)使用或與其它治療或治療組分聯(lián)合使用。例如，可使用本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體傳遞一個(gè)或多個(gè)可用于治療WO-A-98/05635中所列疾病的NOI。為了易于參考，下面列出其中的一部分疾病癌癥，炎癥或炎性疾病，皮膚病，發(fā)燒，心血管病，出血，凝結(jié)和急性期反應(yīng)，惡病質(zhì)，厭食，急性感染，HIV感染，休克狀態(tài)，移植物-抗-宿主反應(yīng)，自身免疫病，重復(fù)灌注損傷，腦膜炎，偏頭痛和依賴于阿斯匹林的抗-血栓形成；腫瘤生長，發(fā)病和擴(kuò)散，血管生成，轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤，腹水，惡性胸膜滲漏；大腦局部缺血，局部缺血性心臟病，骨關(guān)節(jié)炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨質(zhì)疏松，氣喘，多發(fā)性硬化，神經(jīng)退化，早老性癡呆，動脈粥樣硬化，中風(fēng)，脈管炎，局限性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎；牙周炎；齦炎；牛皮癬，特應(yīng)性皮炎，慢性潰瘍，大皰性表皮松解；角膜潰瘍，視網(wǎng)膜病和外科傷口愈合；鼻炎，過敏性結(jié)膜炎，濕疹，過敏癥；再狹窄，充血性心臟病，子宮內(nèi)膜異位，動脈粥樣硬化或endosclerosis。另外，或者，可使用本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體傳遞一個(gè)或多個(gè)可用于治療WO-A-98/07859中所列疾病的NOI。為了易于參考，下面列出在人或獸藥中可治療的其中一部分疾病細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖/分化活性；免疫抑制劑或免疫刺激劑活性(如治療免疫缺損，包括如免疫缺損病毒感染；調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞生長；治療癌癥和很多自身免疫病，防止移植排斥或誘導(dǎo)腫瘤免疫力)；調(diào)節(jié)血細(xì)胞生成，如治療骨髓或淋巴疾?。淮龠M(jìn)骨，軟骨，腱，韌帶和神經(jīng)組織的生長，如愈合創(chuàng)傷，治療燒傷，潰瘍，牙周病和神經(jīng)退化；抑制或激活促濾泡激素(調(diào)制能育性)；趨化活性(例如將特異性細(xì)胞類型移動至受傷或感染位點(diǎn))；止血和溶栓活性(如治療嗜血桿菌病和中風(fēng))；抗炎癥活性(如治療膿毒性休克或局限性回腸炎)；抗微生物劑；代謝或行為的調(diào)制劑，止痛劑；治療特異性缺損疾病；治療例如牛皮癬。另外，或者，可使用本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體傳遞一個(gè)或多個(gè)可用于治療WO-A-98/07859中所列疾病的NOI。為了易于參考，下面列出其中一部分疾病巨噬細(xì)胞抑制和/或T細(xì)胞抑制活性，因此，抗炎癥活性；抗-免疫活性，即針對細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)，包括與炎癥不相關(guān)之反應(yīng)的抑制作用；抑制巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞粘附細(xì)胞外基質(zhì)組分和纖連蛋白的能力，以及上調(diào)T細(xì)胞中的fas受體表達(dá)；抑制不必要的免疫反應(yīng)和炎癥，包括關(guān)節(jié)炎(包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，與超敏反應(yīng)相關(guān)的炎癥，變態(tài)反應(yīng)，氣喘，全身性紅斑狼瘡，膠原病和其它自身免疫病，與動脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥，動脈粥樣硬化，粥樣硬化性心臟病，重復(fù)灌注損傷，心動停止，心肌梗塞，血管炎，呼吸窘迫綜合征或其它心肺病，與消化道潰瘍相關(guān)的炎癥，潰瘍性結(jié)腸炎和其它胃腸道疾病，肝纖維變性，肝硬變或其它肝病，甲狀腺炎或其它腺病，腎小球腎炎或其它腎和泌尿道疾病，耳炎或其它耳-鼻-喉疾病，皮炎或其它皮膚病，牙周炎或其它牙病，睪丸炎或睪丸附睪炎，不育癥，睪丸外傷或其它與免疫相關(guān)的睪丸病，胎盤功能異常，胎盤機(jī)能不全，習(xí)慣性流產(chǎn)，驚厥，驚厥前期和其它與免疫和/或炎癥相關(guān)的婦科疾病，前眼色素層炎，中眼色素層炎，后眼色素層炎，結(jié)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，眼色素層視網(wǎng)膜炎，視神經(jīng)炎，眼內(nèi)炎癥，如視網(wǎng)膜炎或類囊腫斑水腫，交感性眼炎，鞏膜炎，視網(wǎng)膜著色，退化性fondus病的免疫和炎癥成分，眼外傷的炎癥成分，由感染引起的眼炎癥，增生的玻璃體-視網(wǎng)膜病，急性缺血性視覺神經(jīng)病，過多瘢痕形成，例如青光眼濾過手術(shù)之后的瘢痕形成，抗眼移植物的免疫和/或炎癥反應(yīng)和其它與免疫和炎癥相關(guān)的眼炎，與自身免疫病相關(guān)的炎癥(此時(shí)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或任何其它器官中，免疫和/或炎癥抑制將是有利的)，帕金森氏病，治療帕金森氏病引起的并發(fā)癥和/或副作用，AIDS-相關(guān)的癡呆綜合征，HIV相關(guān)的腦病，視神經(jīng)脊髓炎，Sydenham舞蹈病，早老性癡呆和其它CNS退化性疾病或紊亂，Stokes氏病的炎癥成分，脊髓灰質(zhì)炎后綜合征，精神病的炎癥成分，脊髓炎，腦炎，亞急性致硬化全腦炎，腦脊髓炎，急性神經(jīng)病，亞急性神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病，急性感染性多神經(jīng)炎，Sydenham舞蹈病，重癥肌無力，假-腫瘤腦，Down氏綜合征，Huntington氏綜合征，肌萎縮性側(cè)索硬化，CNS受壓或CNS外傷或CNS感染的炎癥成分，肌肉萎縮和營養(yǎng)不良的炎癥成分，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的免疫和炎癥相關(guān)疾病，外傷后炎癥，膿毒性休克，傳染病，手術(shù)的炎癥并發(fā)癥或副作用，骨髓移植或其它移植并發(fā)癥和/或副作用，基因治療的炎癥和/或免疫并發(fā)癥和副作用(例如因?yàn)楸徊《据d體感染)，或與AIDS相關(guān)的炎癥，阻遏或抑制體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過減少單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的量來治療或緩解單核細(xì)胞或白細(xì)胞增殖性疾病，例如白血病，移植天然或人造細(xì)胞，組織和器官(例如角膜，骨髓，器官，晶狀體，起搏器，天然或人造皮膚組織)時(shí)預(yù)防和/或治療移植排斥。本發(fā)明還提供了通過基因療法治療個(gè)體的藥物組合物，其中組合物含有治療有效量的本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或由其產(chǎn)生的或得自該載體的病毒顆粒，所述載體含有一個(gè)或多個(gè)可傳遞的治療和/或診斷用NOI。藥物組合物可用于人或動物。一般說來，醫(yī)生可決定最適于個(gè)體受試者的實(shí)際劑量，該劑量取決于特定個(gè)體的年齡，體重和反應(yīng)。組合物可任選含有藥物可接受的載體，稀釋劑，賦形劑或佐劑。藥物載體，賦形劑或稀釋劑的選擇取決于給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥物學(xué)操作方法。除載體，賦形劑或稀釋劑外，藥物組合物可含有任何適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合劑，潤滑劑，懸浮劑，包被劑，增溶劑和其它能輔助或增加病毒進(jìn)入靶位點(diǎn)的載體試劑(例如脂質(zhì)傳遞系統(tǒng))，也可含有這些試劑作為載體，賦形劑或稀釋劑。適當(dāng)時(shí)，可通過下列方式中的任何一種或多種施用藥物組合物吸入劑，栓劑或陰道藥栓的形式，典型地為洗劑，溶液，乳劑，軟膏或撒粉的形式，使用皮膚貼片，以含有如淀粉或乳糖之賦形劑的片劑形式口服，或者以單獨(dú)或與賦形劑混合的膠囊或卵狀小體形式口服，以含有調(diào)味劑或著色劑的酏劑，溶液或懸浮液的形式口服，或者可以非腸道注射，例如intracavernosally，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或皮下注射。對于非腸道給藥而言，最好以無菌水溶液的形式使用組合物，所述溶液可含有其它物質(zhì)，例如足夠的鹽或單糖以制備與血液等滲的溶液。對于口或舌下給藥而言，可以按常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式施用組合物。通過本發(fā)明的載體系統(tǒng)傳遞一個(gè)或多個(gè)治療基因的方法可以單獨(dú)使用，或與其它治療或治療成分聯(lián)合使用?？芍委煹募膊“ǖ幌抻诎┌Y，神經(jīng)病，遺傳病，心臟病，中風(fēng)，關(guān)節(jié)炎，病毒感染和免疫系統(tǒng)疾病。適當(dāng)?shù)闹委熁虬ň幋a腫瘤抑制蛋白，酶，前體藥物激活酶，免疫調(diào)制分子，抗體，經(jīng)改造的免疫球蛋白樣分子，融合蛋白，激素，膜蛋白，作用于血管的蛋白質(zhì)或肽，細(xì)胞因子，趨化因子，抗病毒蛋白質(zhì)，反義RNA或核酶。在本發(fā)明治療方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的載體系統(tǒng)將編碼前體藥物激活酶的基因傳遞至腫瘤，隨后用適當(dāng)?shù)那绑w藥物治療個(gè)體。前體藥物的例子包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷磷酸酯(與堿性磷酸酶聯(lián)合，Senter等，1988，ProcNatlAcadSci854842-4846)；5-氟胞嘧啶(與胞嘧啶脫氨酶聯(lián)合，Mullen等，1994，癌癥研究，541503-1506)；阿霉素-N-對羥基苯氧基乙酰胺(與青霉素-V-酰胺酶聯(lián)合，Kerr等，1990，癌癥免疫及免疫療法31202-206)；對-N-雙(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(與羧肽酶G2聯(lián)合)；頭孢菌素氮芥氨基甲酸酯(與β-內(nèi)酰胺酶聯(lián)合)；SR4233(與P450還原酶聯(lián)合)；9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(與HSV胸苷激酶聯(lián)合，Borrelli等，1988ProcNatlAcadSci857572-7576)；芥子前體藥物(與硝基還原酶聯(lián)合，F(xiàn)riedlos等，1997，藥物化學(xué)雜志，401270-1275)和環(huán)磷酰胺或異環(huán)磷酰胺(與細(xì)胞色素P450聯(lián)合，Chen等，1996，癌癥研究561331-1340)。根據(jù)本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)。文獻(xiàn)中完整描述了該技術(shù)。例見Sambrook等(1989)分子克隆；實(shí)驗(yàn)室手冊；Hames和Glover(1985-1997)DNA克隆操作方法，第Ⅰ-Ⅳ卷(第2版)；免疫球蛋白基因工程方法，McCafferty等(1996)，“抗體工程操作方法”。參照下列附圖，在實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明圖1-顯示出質(zhì)粒pESP，pONY3和pONY2.1nIsLacZ之轉(zhuǎn)錄單位的結(jié)構(gòu)。圖2-顯示出整合EIAV載體的PCR分析，用EIAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(泳道1和5)或模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(泳道2和6)的基因組DNA進(jìn)行PCR。pONY2.1nIsLacZ(泳道3和7)和pONY3(泳道4和8)被用作對照。A.PCR檢測EIAVLTR。B.PCR檢測pol。圖3-顯示出用于鑒定EIAV載體之包裝需求的缺失質(zhì)粒的載體轉(zhuǎn)錄單位結(jié)構(gòu)。圖4-顯示出得自pONY2.13LacZ中存在的gag轉(zhuǎn)錄單位的RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖5描述了衍生自EIAV基因組的載體。圖6描述了衍生自EIAV的gagpol構(gòu)建體。圖7描述了含有S2缺失的EIAV載體。圖8描述了具有缺失的S2和dUTP酶基因的EIAVgagpol構(gòu)建體。圖9描述了EIAV基本載體。圖10描述了顯示出本發(fā)明EIAVgagpol構(gòu)建體分析的凝膠。圖11顯示出pONY4載體的例子。圖12顯示出兩個(gè)SIN載體。圖13描述了具有割裂polyA信號的載體。圖14描述了具有割裂polyA信號的載體。圖15描述了具有割裂polyA信號的載體。圖16顯示出具有割裂polyA信號的pONY4-GFP的構(gòu)建。圖17顯示出MLV/EIAV載體的構(gòu)建。圖18顯示出構(gòu)建MLV/EIAV載體所用的引物。圖19顯示出pONY-小鼠的完整序列。圖20和21顯示出PCR的引發(fā)過程。圖22顯示出pEMVA4(用引物EMAV1-8進(jìn)行PCR之后)。圖23顯示出pEMVA4。圖24顯示出pEMVA5。圖25和26顯示出5’末端形成的錘頭策略的例子。圖27顯示出pEMVA6。圖28顯示出pEMVA7和pSynpONY4.1。圖29顯示出EMVA10/11。圖30顯示出pEMVA9。圖31顯示出pEMVA10。圖32顯示出pLWHORSE3.1。圖33顯示出pMCRev。圖34顯示出pYFVSVG。圖35顯示出pYFAmpho。圖36顯示出重組的MVA構(gòu)建體。圖37顯示出pSC65的完整序列。圖38顯示出pLW22的完整序列。詳細(xì)解釋圖1．該研究中使用的質(zhì)粒。顯示出EIAV的基因組結(jié)構(gòu)，其包括剪接供體(d1，d2和d3)和剪接受體位點(diǎn)(a1，a2和a3)。也顯示出gag,pol,env,tat,rev,S2和病毒LTR的位置。質(zhì)粒pESP是含有SV40啟動子和嘌呤霉素抗性基因的EIAV載體基因組。質(zhì)粒pONY3是EIAVgagpol表達(dá)質(zhì)粒。pONY2.1nIsLacZ是含有HCMVIE增強(qiáng)子/啟動子和β-半乳糖苷酶基因(nlslacZ)的EIAV載體基因組。圖2顯示出整合EIAV載體的PCR分析，用EIAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(泳道1和5)或模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(泳道2和6)的基因組DNA進(jìn)行PCR。pONY2.1nIsLacZ(泳道3和7)和pONY3(泳道4和8)被用作對照。A．PCR檢測EIAVLTR。B．PCR檢測pol。表2。轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂細(xì)胞。根據(jù)Lewis等(Lewis,P.F和M.Emerman，1994，病毒學(xué)雜志，68510-6)的方法，用(空心柱)或不用(陰影柱)蚜腸霉素處理293T細(xì)胞，然后用EIAV載體pONY2.1nIsLacZ或MLV載體HIT111(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。48小時(shí)之后，用X-gal染色細(xì)胞，將兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的滴度平均值計(jì)算為每ml的lacZ集落形成單位。實(shí)驗(yàn)之間的誤差不超過10％。圖10顯示出gagpol表達(dá)構(gòu)建體的分析。通過SDS/PAGE電泳分離30微克總細(xì)胞蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用抗-EIAV抗體進(jìn)行探測。第二抗體是抗馬HRP(Sigma)。，將三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的滴度平均值計(jì)算為每ml的lacZ集落形成單位。實(shí)驗(yàn)之間的誤差不超過10％。用EIAVgagpol共轉(zhuǎn)染pONY2.1nIsLacZ和包膜表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)施例1-構(gòu)建含有缺失的gag基因的EIAV載體為了構(gòu)建無復(fù)制能力的EIAV載體系統(tǒng)，我們將Payne等(1994，普通病毒學(xué)雜志，75425-9)所述的感染性原病毒克隆pSPEIAV19(登記號為U01866)用作起點(diǎn)。根據(jù)Payne等(文獻(xiàn)同上)的編號系統(tǒng)除去對應(yīng)于5835/6571位的HindⅢ/HindⅢ片斷以簡單地缺失部分env，籍此構(gòu)建原始的基于EIAV的載體。此片斷被pTIN500(Cannon等，1996，病毒學(xué)雜志，708234-8240)中受SV40早期啟動子控制的嘌呤霉素抗性基因所取代，產(chǎn)生pESP(圖1)。通過用pESP和pRV67(Kim等，1998，病毒學(xué)雜志，72(1)811-6)磷酸鈣轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)產(chǎn)生病毒原種，質(zhì)粒pRV67中的水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)由HCMV-IE增強(qiáng)子/啟動子表達(dá)。也可使用其它VSV-G表達(dá)質(zhì)粒，例見Yee等，1994，PNAS919564-9568。按下述使用所得上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)人腎(293T)和犬骨肉瘤細(xì)胞(D17)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，收集組織培養(yǎng)液，流過0.45μm濾器進(jìn)行過濾。用含有8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物的培養(yǎng)基制備10倍稀釋物，然后將500μl等分試樣置于前一天接種有1.6×105個(gè)細(xì)胞/孔D17細(xì)胞的12孔培養(yǎng)板中。2小時(shí)后，加入1ml培養(yǎng)基。2天后，加入嘌呤霉素至終濃度為4μg/ml，再持續(xù)保溫7天。作為陽性對照，將基于鼠白血病病毒(MLV)的載體(pTIN500)與pHIT60(MLVgagpol)和pRV67(Cannon等，1996，病毒學(xué)雜志，708234-8240)聯(lián)合使用，其中pTIN500含有受SV40早期啟動子控制的嘌呤霉素抗性基因。用EIAV載體進(jìn)行嘌呤霉素選擇達(dá)7天之后，在任一種細(xì)胞類型上都未觀察到抗性集落。MLV載體在293T細(xì)胞上產(chǎn)生了5.0×104c.f.u./ml，在D17細(xì)胞上產(chǎn)生了1.0×104c.f.u./ml。對此結(jié)果作類似的擴(kuò)展，即在缺乏tat，因而不能產(chǎn)生足夠量的重要成分，如gagpol和tat時(shí)，EIAVLTR在人細(xì)胞中不具有功能。因此，構(gòu)建了另一個(gè)載體系統(tǒng)，其含有3個(gè)轉(zhuǎn)錄單位以產(chǎn)生1)載體基因組RNA；2)env和3)gag-pol。為了確保產(chǎn)生足夠量的每種成分，env和gag-pol轉(zhuǎn)錄單位由在選定人包裝細(xì)胞系中具有活性的啟動子-增強(qiáng)子轉(zhuǎn)錄。通過這種方式，產(chǎn)生了足夠量的gag-pol(最可能是tat)以確保有效產(chǎn)生有轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的載體顆粒。構(gòu)建了載體基因組，該基因組的pol區(qū)域內(nèi)具有下述報(bào)道基因。通過將由pSPEIAV19經(jīng)PCR擴(kuò)增的EIAVLTR插入pBluescriptⅡKS+(Stratagene)構(gòu)建出質(zhì)粒pONY1。使用pfu聚合酶，用下列引物PCR擴(kuò)增EIAV克隆pSPEIAV19的5’LTR5’GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG3’GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC通過補(bǔ)平5’突出端使擴(kuò)增子成為平端，使用T4DNA聚合酶將其插入用BssHⅡ切割，通過除去3’突出端而成為平端的pBluescriptⅡKS+中。此構(gòu)建體被稱為pONY1，相對于pBluescriptⅡKS+的β-半乳糖苷酶而言，其方向?yàn)?’至3’。對pONY1的測序未顯示出有突變。用MluⅠ(216/8124)切割載體基因組pSPEIAV19DH，插入用MluⅠ(216)切割的pONY1中以制備pONY2。用BssHⅡ消化(619/792)pBluescriptⅡKS+得到多克隆位點(diǎn)。通過補(bǔ)平5’突出端使其成為平端，連接至用BglⅡ和NcoⅠ(1901/4949)切割的pONY2中，通過補(bǔ)平5’突出端使其成為平端。相對于EIAV序列而言，方向?yàn)?’至5’，稱之為pONY2.1。通過將pLNCX(登記號M28246)(PstⅠ/HindⅢ)插入pSP72(Promega)產(chǎn)生pSPCMV。將pTIN414(CannonPM等，病毒學(xué)雜志，70，8234-8240)的β-半乳糖苷酶基因插入pSP72(XhoⅠ/SphⅠ)中產(chǎn)生pSPlacZ。β-半乳糖苷酶基因的5’末端被pAD.RSVbgal(J.Clin.Invet.90626-630，1992)的SV40T抗原核定位信號取代。用XhoⅠ/ClaⅠ切割pAD.RSVbgal，并插入用XhoⅠ/ClaⅠ切割的pSPlacZ中產(chǎn)生pSPnlslacZ。用PstⅠ切下pSPlacZ和pSPnlslacZ中CMV核定位和非核定位的β-半乳糖苷酶，以EIAV的5’至3’方向?qū)⑵洳迦雙ONY2.1的PstⅠ位點(diǎn)。所得構(gòu)建體被稱為pONY2.1nlslacZ和pONY2.1lacZ。將pONY2ΔH的MluⅠ/MluⅠ片斷插入哺乳動物表達(dá)載體pCl-neo(Promega)中以制備EIAVgagpol表達(dá)質(zhì)粒(pONY3)，從而使gag-pol基因由hCMV-MIE啟動子-增強(qiáng)子表達(dá)。具體地說，用MluⅠ(216/8124)切割gagpolpSPEIAV19DH并插入用MluⅠ(216)切割的pCl-neo(Promega)中以制備pONY3。質(zhì)粒pONY3不應(yīng)產(chǎn)生功能性的基因組，因?yàn)槠淙狈m當(dāng)?shù)腖TR序列。按與基于MLV的載體相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)，通過用3種質(zhì)粒pRV67，pONY3和pONY2.10nlsLacZ瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以產(chǎn)生病毒，然后按下述用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞和D17細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，收集組織培養(yǎng)液，流過0.45μm濾器進(jìn)行過濾。用含有8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物的培養(yǎng)基制備10倍稀釋物，然后將500μl等分試樣置于前一天接種有1.6×105個(gè)細(xì)胞/孔D17細(xì)胞的12孔培養(yǎng)板中。2小時(shí)后，加入1ml培養(yǎng)基，再持續(xù)保溫48小時(shí)，使用大腸桿菌β-半乳糖苷酶的X-gal染色方法評估LacZ基因的表達(dá)(macGregor等，1991，分子生物學(xué)方法，Vol7，EJMurray編，p217-235)。在這兩種情況下，病毒以約105LacZ-轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞-形成單位(l.f.u.)/ml的頻率轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該頻率比由pHIT111產(chǎn)生的基于MLV的載體約低10倍。這些數(shù)據(jù)表明我們已制備出基于EIAV的載體系統(tǒng)，也暗示著用外源DNA取代env的HindⅢ/HindⅢ片斷可破壞基因組的功能。接著，我們鑒定了EIAV載體顆粒成為假型病毒的能力，所述假型病毒具有得自其它病毒的包膜蛋白。用產(chǎn)生MLV兼嗜性(pHIT456)和MLV親嗜性(pHIT123)包膜(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)以及VSV-G(pRV67)的包膜表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染pONY2.10nlsLacZ和pONY3(表1)。用包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染pHIT111(MLV載體基因組)和pHIT60(MLVgagpol表達(dá)質(zhì)粒)作為陽性對照(表1)。用病毒上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細(xì)胞系，包括人腎(293T)，鼠胚(NIH3T3)和犬骨肉瘤(D17)細(xì)胞系。如所預(yù)期的，病毒的細(xì)胞嗜性在很大程度上由包膜決定。EIAV可以是具有兼嗜性包膜的假型病毒，但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有所不同。兼嗜性假型病毒在D17細(xì)胞上的滴度約為102，在NIH3T3細(xì)胞上的滴度約為103，在293T細(xì)胞上的滴度約為104。這些差異的原因未被深究。EIAV也可以是具有MLV親嗜性包膜的假型病毒，這些病毒以104l.f.u./ml的滴度轉(zhuǎn)導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞，用具有VSV-G包膜的EIAV假型病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)所有受試細(xì)胞系。不同包膜和細(xì)胞類型之間的滴度不同，對非鼠細(xì)胞而言，整體效率相對較高，但仍低于鼠載體系統(tǒng)的效率?？傊@些數(shù)據(jù)表明EIAV載體系統(tǒng)并不依賴于EIAV包膜，其可有效地成為具有3個(gè)賦予寬宿主范圍之包膜的假型病毒。這使得該系統(tǒng)與目前使用的基于MLV的系統(tǒng)一樣有用。按相同的方式，使用RD114包膜，例如使用pRDF(Cosset等，1995，病毒學(xué)雜志，697430-7436)也可使EIAV載體成為假型病毒。為了鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，我們進(jìn)一步對被具有VSV-G的EIAV假型病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的293T細(xì)胞進(jìn)行了PCR分析。具體地說，我們想知道與具有g(shù)agpol表達(dá)質(zhì)粒pONY3的重組體相反的載體基因組是否已成為β-半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。當(dāng)使用分離自轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的基因組DNA時(shí)，使用特異于EIAVLTR的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期的310bp的PCR產(chǎn)物(圖2A，泳道1)。當(dāng)將模擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的293T細(xì)胞DNA用作模板時(shí)，未檢測到PCR產(chǎn)物(圖2A，泳道2)。pONY2.10nlsLacZ被用作陽性對照(圖2A，泳道3)。當(dāng)pONY3被用作模板時(shí)未檢測到PCR產(chǎn)物(圖2A，泳道4)。使用pol特異性引物時(shí)PCR產(chǎn)物的缺乏(圖2B)進(jìn)一步證實(shí)pONY3中的gagpol序列未整合至宿主染色體中?？傊?，這些數(shù)據(jù)說明真正的載體基因組轉(zhuǎn)導(dǎo)了細(xì)胞。為了測定EIAV載體是否保留了轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞的能力，根據(jù)已知方法(Lewis和Emerman1994)，通過用蚜腸霉素處理將293T細(xì)胞滯留在G1/S相，然后用具有VSV-G的基于EIAV和基于MLV的假型病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在經(jīng)蚜腸霉素處理的細(xì)胞中，MLV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率要低4個(gè)數(shù)量級。MLV細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的不完全阻斷可能是分裂細(xì)胞小群體所致。與之形成對照的是，在基于EIAV的載體中未觀察到顯著差異。這表明EIAV載體與HIV載體一樣都可有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。載體基因組pONY2.10lacZ含有1377個(gè)核苷酸長的gag。使用RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測(“http://www.ibc.wustl.edu/～zuker/ma/”)鑒定gag前導(dǎo)序列和5’末端內(nèi)可能的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)這些預(yù)測，在pONY2.10lacZ的gag區(qū)域進(jìn)行4種缺失(圖1)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過PCR誘變進(jìn)行缺失。pONY2.1lacZ含有1377個(gè)核苷酸長的gag(從1901位核苷酸開始缺失)pONY2.11lacZ含有354個(gè)核苷酸長的gag(從878位核苷酸開始缺失)pONY2.12lacZ含有184個(gè)核苷酸長的gag(從708位核苷酸開始缺失)pONY2.13lacZ含有109個(gè)核苷酸長的gag(從633位核苷酸開始缺失)pONY2.14lacZ含有2個(gè)核苷酸長的gag(從526位核苷酸開始缺失)按與基于MLV的載體相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)在3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染中使用這些載體，將產(chǎn)生的病毒滴定在293T細(xì)胞和D17細(xì)胞上。發(fā)現(xiàn)gag編碼序列的前109個(gè)核苷酸是除非翻譯區(qū)域外的最大包裝所需的；pONY2.13lacZ(表2)。在D17細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)類似的滴度。圖4顯示出得自pONY2.13lacZRNA之gag序列的推測的二級結(jié)構(gòu)。根據(jù)圖4中推測的二級結(jié)構(gòu)，在pONY2.13lacZ的主要剪接供體密碼子的上游和下游區(qū)域內(nèi)又進(jìn)行了4種缺失。pONY2.21lacZ含有第409至421位核苷酸的缺失pONY2.22lacZ含有第424至463位核苷酸的缺失pONY2.23lacZ含有第470至524位核苷酸的缺失pONY2.24lacZ含有第529至582位核苷酸的缺失pONY2.25lacZ含有第584至645位核苷酸的缺失pONY2.26lacZ含有第409至421位核苷酸的缺失和第470至524位核苷酸的缺失按上述方法，在3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染中使用這些載體，將產(chǎn)生的病毒滴定在D17細(xì)胞上。發(fā)現(xiàn)此區(qū)域的缺失嚴(yán)重影響病毒的滴度(表3)。構(gòu)建體pONY2.23和2.26給出最低的滴度。它們都含有第470至524位核苷酸的缺失。最不嚴(yán)重的缺失是第409至421位核苷酸的缺失。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，主要剪接供體周圍的區(qū)域?qū)ψ罴寻b是有用的。可使用類似的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和缺失分析來鑒定其它非靈長類動物慢病毒的包裝信號。表1．病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率<tablesid="table1"num="001"><table>載體包膜滴度(l.f.u./ml)aD17NIH3T3293TpONY2.1nlslacZ模擬＜1＜1＜1pONY2.1nlslacZpHIT456(MLVamp)1.0×1028.4×1022.0×104pONY2.1nlslacZpHIT123(MLVeco)＜11.5×104＜1pONY2.1nlslacZpRV67(VSVG)1.0×1053.6×1032.0×105pHIT111模擬＜1＜1＜1pHIT111pHIT456(MLVamp)1.3×1052.6×1062.0×107pHIT111pHIT123(MLVeco)＜12.8×106＜1pHIT111pRV67(VSVG)3.0×1062.0×1055.0×106</table></tables>a轉(zhuǎn)導(dǎo)了每種細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞48小時(shí)之后，染色β-半乳糖苷酶活性。將3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均滴度計(jì)算為每ml的lacZ形成單位。實(shí)驗(yàn)之間的誤差不超過10％。用EIAVgagpol表達(dá)質(zhì)粒(pONY3)共轉(zhuǎn)染pONY2.1nlslacZ和包膜表達(dá)質(zhì)粒。用MLVgagpol表達(dá)質(zhì)粒(pHIT60)共轉(zhuǎn)染pHIT111和包膜表達(dá)質(zhì)粒。表2<tablesid="table2"num="002"><table>載體基因組滴度(l.f.u./ml)pONY2.103.30E+04pONY2.111.60E+05pONY2.121.40E+05pONY2.131.70E+05pONY2.145.40E+02模擬1.0E+01</table></tables>表3<tablesid="table3"num="003"><table>載體基因組滴度(l.f.u./ml)2.211.20E+042.223.80E+032.231.20E+022.245.20E+022.255.60E+022.261.00E+022.134.00E+04</table></tables>實(shí)施例2-構(gòu)建pEGASUS-1按下述制備基于EIAV的載體(pEGASUS-1)，其僅含有759個(gè)核苷酸長的EIAV序列(第268-675位核苷酸和第7942-8292位核苷酸)。通過PCR擴(kuò)增，由pONY2.10LacZ得到包含EIAV多嘌呤序列片斷(PPT)和3’LTR的序列，所用引物為PPTEIAV+(Y8198)GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG和3’NEGSpeⅠ(Y8199)CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG。純化產(chǎn)物，用SpeⅠ(ACTAGT)消化，并連接至用SpeⅠ消化并用堿性磷酸酶處理而制備的pBSⅡKS+中。篩選轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL-1Blue之后得到的菌落中是否存在3’LTR，所述LTR的方向應(yīng)使3’LTR的U5區(qū)域鄰近pBSⅡKS+接頭的NotⅠ位點(diǎn)。測定克隆插入物的序列，結(jié)果表明與EIAV克隆pSPEIAV19(ACU01866)相比，它僅含有一個(gè)變化，即R區(qū)域的堿基3和4之間的‘C’插入。在PCR反應(yīng)所用的模板中也發(fā)現(xiàn)了相同變化。該克隆被稱為pBS.3’LTR。接著，將報(bào)道基因盒CMV啟動子/LacZ導(dǎo)入pBS.3’LTR的PstⅠ位點(diǎn)。CMV/LacZ盒為pONY2.10LacZ(見上文)的PstⅠ片斷。連接上述片斷，用連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue。大量克隆中CMV/LacZ插入物的定向使得LacZ基因鄰近3’LTR，通過使用標(biāo)準(zhǔn)方法將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞系中來評估CMV/LacZ盒的活性。選擇轉(zhuǎn)染后48小時(shí)通過用X-gal顯色而呈現(xiàn)藍(lán)色細(xì)胞的克隆待用，并稱之為PBSCMVLacZ.3’LTR。在表達(dá)載體pCIEneo中構(gòu)建EIAV載體的5’區(qū)域，pCIEneo是pCIneo(Promega)經(jīng)修飾的衍生物，其另外包含上述完整CMV啟動子之5’末端的約400bp片斷。使用引物VSAT1(GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT)和VSAT2(TATTAATAACTAGT)，pHIT60為模板，通過PCR擴(kuò)增得到該400bp的片斷。用BglⅡ和SpeⅠ消化產(chǎn)物，連接到已經(jīng)過類似消化的pCIneo中。使用引物CMV5’EIAV2(Z0591)(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG)和3’PSI.NEG(GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG)，以？為模板DNA擴(kuò)增從R區(qū)域至gag編碼區(qū)之第150位核苷酸(核苷酸268至675)的EIAV基因組片斷。引物CMV5’EIAV2的5’區(qū)域含有緊接CMV啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的序列，并可被SacⅠ切割。3’PSI.NEG與通過缺失分析(上文)限定的EIAV包裝序列的3’端結(jié)合，并含有XbaⅠ位點(diǎn)。用SacⅠ和XbaⅠ切下PCR產(chǎn)物，連接至為連接而制備的經(jīng)相同酶消化的pCIEneo中。該操作將EIAVR區(qū)域的起點(diǎn)置于CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，如此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物從EIAV所用的真正的起始位置開始，并延伸至包裝信號的3’端。通過限制性分析評估正確的克隆，測定其序列，選擇被稱為pCIEneo.5’EIAV的克隆供進(jìn)一步研究。接著，將pBS.CMVLacZ.3’LTR中的CMVLacZ和3’LTR盒導(dǎo)入pCIEneo.5’EIAV。用ApaⅠ消化pBS.CMVLacZ.3’LTR，用T4DNA聚合酶除去3’突出端，然后用NotⅠ消化。通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)純化含有CMVLacZ.3’LTR的片斷。用SalⅠ消化pCIEneo.5’EIAV，接著用T4DNA聚合酶補(bǔ)平5’突出端，籍此制備與上述片斷連接用的載體。然后用NotⅠ消化DNA，純化后用于連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue之后，通過限制性分析篩選出存在插入物的菌落以鑒定出被稱為pEGASUS-1的所需克隆。使用實(shí)施例1所述的3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)比較pEGASUS-1EIAV載體與pONY2.10LacZ的功能。得自兩個(gè)載體的滴度差不多，這表明pEGASUS-1含有以良好效率包裝所需的所有序列。實(shí)施例3-將RRE導(dǎo)入EIAV載體通過導(dǎo)入其它元件改善滴度對EIAV載體pEGASUS-1作進(jìn)一步改進(jìn)。方便導(dǎo)入所述元件的位點(diǎn)是SalⅠ位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于包裝信號3’端XbaⅠ與pEGASUS-1之CMV/LacZ盒上游之間。例如，可將HIV或EIAV的RRE插入該位點(diǎn)。使用引物RRE(+)GTCGCTGAGGTCGACAAGGCAAAGAGAAGAG和RRE(-)GACCGGTACCGTCGACAAGGCACAGCAGTGG，通過PCR擴(kuò)增由HIV-1分子克隆pWI3(Kimpton和Emerman1992，病毒學(xué)雜志，662232-2239)得到HIV-1RRE。用SalI消化DNA片斷和pEGASUS-1，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue。篩選存在HIVRRE的菌落，將含有正向或反向HIVRRE的兩個(gè)克隆用于進(jìn)一步研究。通過進(jìn)行4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染在293T細(xì)胞中檢測載體pEGASUS-2.HIVRRE(+)或pEGASUS-2.HIVRRE(-)，其中表達(dá)HIV-1rev蛋白的質(zhì)粒pCIneoHIVrev與載體pONY3和pRV67質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。按下述通過PCR擴(kuò)增得到文獻(xiàn)中限定(Martarano等，1994)的EIAVRRE。使用pONY2.10LacZ作為模板進(jìn)行2次擴(kuò)增，得到兩部分EIAVRRE。使用引物ERRE1(TTCTGTCGACGAATCCCAGGGGGAATCTCAAC)和ERRE2(GTCACCTTCCAGAGGGCCCTGGCTAAGCATAACAG)得到5’元件，使用引物ERRE3(CTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAAGGTGAC)和引物ERRE4(AATTGCTGACCCCCAAAATAGCCATAAG)得到3’元件。這些產(chǎn)物互相退火，因此可用于第二次PCR反應(yīng)，得到‘編碼’EIAVRRE的DNA。前10輪循環(huán)不用引物ERRE1和ERRE4，然后在反應(yīng)中加入這兩種引物再進(jìn)行10輪擴(kuò)增循環(huán)，籍此建立PCR擴(kuò)增。用SalⅠ消化所得PCR產(chǎn)物和pEGASUS-1，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue。篩選含有正向或反向EIAVRRE的克隆用于進(jìn)一步研究。在4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染中評估這些載體的活性，用SalⅠ消化pEGASUS-1，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue。篩選含有正向或反向EIAVRRE的克隆用于進(jìn)一步研究。在3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染(EIAVrev由pONY3提供)或上述4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(使用pCIneo.EIAVRev提供其它的EIAVrev)中評估這些載體的活性。為了構(gòu)建pCIneo.EIAVREV，通過PCR擴(kuò)增得到EIAVREV編碼序列。使用上述EIAVRRE所用的兩步“重疊”PCR擴(kuò)增法得到EIAVREV序列。兩次反應(yīng)的模板是pONY3，5’片斷的引物是EIAVREV5’O(CCATGCACGTCTGCAGCCAGCATGGCAGAATCGAAG)和EIAVREVIN(CCTGAGGATCTATTTTCCACCAGTCATTTC)，3’產(chǎn)物的引物是EIAVREVIP(GTGGAAAATAGATCCTCAGGGCCCTCTGG)和EIAV.REV3’O(GCAGTGCCGGATCCTCATAAATGTTTCCTCCTTCG)。10輪循環(huán)之后加入引物EIAVREV5’O和EIAV.REV3’O進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。將所得產(chǎn)物與PCR片斷“TA”克隆載體pCR2.1(Invitrogen)連接，通過限制性酶分析評估EIAVREV插入物的方向，進(jìn)一步證實(shí)了正確EIAVREV序列的存在。該構(gòu)建體被稱為pTopoRevpos。通過用SpeⅠ和NotⅠ消化從pTopoRevpos中切下EIAVREV插入物，連接至已用NheⅠ和NotⅠ消化的pCIneo中。實(shí)施例4-轉(zhuǎn)導(dǎo)人巨噬細(xì)胞按下述從富含白細(xì)胞的血液(得自國立輸血機(jī)構(gòu)，SouthmeadRdBristol,UK)中得到人原代單核細(xì)胞。根據(jù)廠商說明，通過在Ficoll不連續(xù)梯度(Pharmacia)上離心富集外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將該細(xì)胞群體粘附至含有RPMI1640培養(yǎng)基(Dutch改良的；Sigma)的組織培養(yǎng)用塑料板上，從中得到巨噬細(xì)胞，所述培養(yǎng)基含有2％熱滅活人AB血清(Sigma)或10％FCS(Sigma)。用培養(yǎng)基充分洗滌培養(yǎng)板以除去未粘附的細(xì)胞。將3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中可得到轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所用的病毒。實(shí)驗(yàn)所用載體是pONY2.13衍生物，其中CMV/LacZ報(bào)道基因盒已被CMV/綠色熒光蛋白(GFP)取代。按下述制備載體pONY2.13GFP。用BglⅡ和XbaⅠ從pEGFP-N1(Clontech“http://www.clontech.com/”)中切下編碼紅移GFP的序列和真核翻譯信號，并連接至已用相同酶消化的通用克隆載體pSP72(Promega)中。然后使用XhoⅠ切下編碼GFP的序列，連接至已用XhoⅠ切割(籍此釋放LacZ編碼區(qū))的pONY2.13中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1Blue之后，通過限制性分析測定GFP插入物相對于CMV啟動子的方向能使表達(dá)按預(yù)期完成的克隆，通過將DNA轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)一步證實(shí)GFP的表達(dá)。將3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞并在轉(zhuǎn)染后42-48小時(shí)收集回收載體將組織培養(yǎng)液流過0.45μm濾器進(jìn)行過濾，4℃，用SW40Ti轉(zhuǎn)子，以50，000g(20Krpm)的轉(zhuǎn)速離心90分鐘以沉淀病毒。將病毒重新懸浮于50-100μl完全培養(yǎng)基中達(dá)2小時(shí)，再用于轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。按下述用pONY2.13GFP載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)用培養(yǎng)基將按5×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于48孔培養(yǎng)板的巨噬細(xì)胞洗滌1次，然后在細(xì)胞孔中再放300μl培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入病毒，緩慢吸放2至3次以確保混勻。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3至5天評估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。使用熒光顯微鏡測定被轉(zhuǎn)導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的數(shù)目。監(jiān)測一段時(shí)間(例如幾周)內(nèi)GFP的表達(dá)?；蛘?，用攜有LacZ標(biāo)記物的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在該實(shí)驗(yàn)中，通過使用免疫學(xué)方法檢測β-半乳糖苷酶的存在來評估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。實(shí)施例5-體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)EIAV載體至大鼠腦用含有1份Nembutal(0.1ml/35gm體重)，1份Novetal(0.1ml/35gm體重)和2份dH2O的溶液麻醉成年Wistar大鼠，并置于腦功能區(qū)定位儀中。沿著頭皮的腹側(cè)至尾側(cè)長度進(jìn)行中線切開，將皮膚拉向一邊以露出顱骨。使用3.00mm后和3.00mm側(cè)的腦功能區(qū)定位坐標(biāo)(由Bregma測定)，在顱骨中鉆一個(gè)直徑為1mm的孔。使用10μlHamilton注射器或1.0μl細(xì)玻璃毛細(xì)管單側(cè)皮質(zhì)內(nèi)注射EIAV載體至距腦表面不同深度處。將注射器在注射部位放5分鐘以防止回流。對照動物只接受用10μlHamilton注射器或1.0μl細(xì)玻璃毛細(xì)管皮質(zhì)內(nèi)注射的鹽水。然后縫合動物待其恢復(fù)。48小時(shí)之后，按上述將這些動物深度麻醉，用200ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)灌流心臟。然后解剖取出腦，在干冰制冷的異戊烷(-30℃)中冷凍，用低溫控制器在10μm處進(jìn)行冠切割。將穿過注射位點(diǎn)和2mm腹側(cè)和尾側(cè)的每第5個(gè)切片集中到Super-Frost載玻片上，固定，用X-gal染色或進(jìn)行免疫染色或用CresylViolet染色。實(shí)施例6-轉(zhuǎn)導(dǎo)在培養(yǎng)中分化的支氣管細(xì)胞上皮細(xì)胞可分化形成上皮樣單層，該單層顯示出(＞1000Ωcm3)電阻和骰狀形態(tài)。有多種方法可做到這一點(diǎn)，例如Fuller等，1984。這會產(chǎn)生極化細(xì)胞。該極性是功能性的，它模擬了體內(nèi)上皮細(xì)胞。因此按實(shí)施例1至3所述，用載體和制品穿過基底外側(cè)表面或尖頂表面即可用EIAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞。實(shí)施例7-基本EIAV系統(tǒng)為了消除輔助基因或具有有害作用的編碼序列對治療應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)，構(gòu)建了缺乏tat，S2和dUTP酶的載體系統(tǒng)。構(gòu)建S2突變體A)載體基因組pONY2.13lacZ含有g(shù)ag的109個(gè)核苷酸(第633-4949位核苷酸缺失)(pONY2.13lacZ的描述見上文)。使用該載體制備EIAV載體基因組，通過缺失第5345-5397位的核苷酸從中消除了S2表達(dá)。除去了S2的ATG起始密碼子和env的起始密碼子。為了制備S2中的缺失，使用pONY2.13DNA為模板，用SY2/SY5和SY3/SY4進(jìn)行PCR。收集這兩種PCR產(chǎn)物，用引物SY5和SY3進(jìn)行PCR。將1.1kb的產(chǎn)物連接至pGEMT-easy(Promega)中以制備pGEMS2，測序以進(jìn)一步證實(shí)缺失。通過用CelⅡ從pGEMS2中切下1.1kbS2區(qū)域并連接至pONY2.13lacZ中可制備pONY2.13lacZDS2。B)gagpol構(gòu)建體將pONY3中S2的相同區(qū)域缺失以防止pONY3DS2和pONY2.13DS2之間的重組重建S2基因。使用pONY3DNA為模板，用SY1/SY2和SY3/SY4進(jìn)行PCR擴(kuò)增以制備pONY3DS2。收集這兩種PCR產(chǎn)物，用引物SY1和SY3進(jìn)行PCR。將0.7kb的產(chǎn)物連接至pGEMT-easy(Promega)中以制備pGEMS22，測序以進(jìn)一步證實(shí)缺失。通過用NotⅠ從pGEMS22中切下0.7kbS2編碼區(qū)域并插入pBluescriptKS+(Stratagene)中可制備pBPCRS2。將pONY3(2.2kb)的EcoRV和NcoⅠ片斷插入已用EcoRV和NcoⅠ切割的pBPCRS2中可制備pBpONYS2。然后用EcoRV和CelⅡ進(jìn)行切割(2.9kb片斷)并插入已用EcoRV和CelⅡ切割過的pONY3中以制備pONY3DS2。構(gòu)建dUTP酶突變體通過將第4176位核苷酸由T定點(diǎn)誘變?yōu)锳殘基可制備pONY3DdUTPase(Payne等，病毒學(xué)，210302-313)。該突變使天冬氨酸變?yōu)楣劝彼?。使用PCR引物dUTPaseF和dUTPaseR，通過PCR擴(kuò)增可實(shí)現(xiàn)該突變。模板DNA是pONY3。將PCR產(chǎn)物插入pGEMT-easy中，測序以進(jìn)一步證實(shí)突變。所得載體為pGDdUTPase。用NotⅠ和EcoRV切割pONY3(4.6kb)并插入pBluescriptKS+(Stratagene)中以制備pBEV。用PacⅠ和PstⅠ切割pGDdUTPase，將0.4kb的帶插入用PacⅠ和PstⅠ切割過的pBEV中，所得載體被稱為pONY3pBDUTPase。經(jīng)NotⅠ和EcoRV切割后(4.6kb)插入pONY3中以制備pONY3DdUTPase。構(gòu)建S2和dUTP酶雙突變體為了制備pONY3的雙突變體，使用了構(gòu)建體pBpONYS2。用PacⅠ和PstⅠ切割pGDdUTPase，將片斷插入用PacⅠ和PstⅠ切割過的pBpONYS2中以制備構(gòu)建體pS2DdUTPase。然后用EcoRV和CelⅡ切割并插入用EcoRV和CelⅡ切割過的pONY3中以制備pONY3DS2DdUTPase。分析S2和dUTP酶突變體按與基于MLV的載體相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)，在3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的多種組合中使用pONY2.13lacZDS2，pONY3DdUTPase和pONY3DS2DdUTPase載體產(chǎn)生病毒，在處于分裂或非分裂狀態(tài)的293T和D17細(xì)胞上滴定產(chǎn)生的病毒。通過用蚜腸霉素處理(9)將細(xì)胞滯留在G1/S相，然后用具有VSV-G的基于EIAV和基于MLV的假型病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(表4)。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，在經(jīng)蚜腸霉素處理的細(xì)胞中，MLV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率要低4個(gè)數(shù)量級。MLV細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的不完全阻斷可能是分裂細(xì)胞小群體所致。與之形成對照的是，在基于EIAV的載體中未觀察到顯著差異。這表明基于EIAV的系統(tǒng)在生產(chǎn)或轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)不需要S2或dUTP酶。Payne等(Payne等，病毒學(xué)，210302-313)和其他人已證明EIAVdUTP酶是感染馬巨噬細(xì)胞所必需的。這表示EIAV感染巨噬細(xì)胞的限制。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的海馬胚胎第14天的神經(jīng)元細(xì)胞以檢測S2和dUTP酶突變體的特性。多種EIAV載體之間沒有顯著差異。然而，MLV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯著降低。這表明S2和dUTP酶不是轉(zhuǎn)導(dǎo)生理學(xué)上非分裂細(xì)胞所必需的。簡單地說，我們得出結(jié)論對于載體生產(chǎn)或轉(zhuǎn)導(dǎo)而言，載體系統(tǒng)的任何部分都不需要tat，S2和dUTP酶。實(shí)施例8-添加Rev/RRE上文已描述了pEGASUS-1的構(gòu)建。該載體含有759bp長的EIAV序列。當(dāng)反式提供Rev時(shí)，將EIAVRRE(0.7kb)導(dǎo)入pEGASUS-1產(chǎn)生pEGASUS/RRE，導(dǎo)致滴度增加4倍(表2)。該載體目前含有1.47kbEIAV。實(shí)施例9-構(gòu)建改良的gagpol表達(dá)質(zhì)粒在pONY3中，gagpol編碼序列的起始位點(diǎn)之前有一段延伸的5’非翻譯區(qū)域。這一異常長的序列可能會使gagpol盒的表達(dá)受到損害。為了改良gagpol的表達(dá)，可修飾pONY3以除去其余的5’LTR。通過用NarⅠ和EcoRV切割pONY3可做到這一點(diǎn)。將2.4kb的片斷插入pBluescriptKS+(Stratagene)的ClaⅠ和EcoRV位點(diǎn)以制備構(gòu)建體pBSpONY3.0。用XhoⅠ和EcoRV切割pBSpONY3.0，將2.4kb的片斷插入pONY3的XhoⅠ和EcoRV位點(diǎn)以制備pONY3.1。該操作除去了引物結(jié)合區(qū)域內(nèi)5’LTR至NarⅠ位點(diǎn)這一段序列(386個(gè)核苷酸)。該構(gòu)建體使滴度增加了2倍，蛋白質(zhì)的表達(dá)也有所增加(圖10)。pONY3.1與pONY3類似，也編碼gag，gagpol，tat，S2和Rev。由于S2突變實(shí)驗(yàn)證明S2不是生產(chǎn)系統(tǒng)或EIAV載體基因組所必需的，因此可以設(shè)計(jì)不含S2的gagpol表達(dá)構(gòu)建體。產(chǎn)生了兩個(gè)這種構(gòu)建體，即pHORSE和pHORSE3.1。使用pONY3為模板DNA，用EGAGP5’OUTER/EGAGPINNER3和EGAGP3’OUTER/EGAGPINNER5經(jīng)PCR擴(kuò)增制備pHORSE。純化這兩個(gè)PCR產(chǎn)物，集中并使用引物EGAGP5’OUTER/EGAGP3’OUTER再次進(jìn)行擴(kuò)增。將該產(chǎn)物插入pSP72的XhoⅠ和SalⅠ位點(diǎn)，制備出pSP72EIAVgagpol0’lap。用PvuⅡ和NcoⅠ切割pONY3，將4.3kb的片斷插入用PvuⅡ和NcoⅠ切割過的pSP72EIAVgagpolO’lap中，制備出pSPEGP。用XhoⅠ和SalⅠ切割該載體(4.7kb)并插入pCI-Neo的XhoⅠ和SalⅠ位點(diǎn)。該構(gòu)建體被稱為pCIEGP。用SalⅠ切下pEGASUS中的RRE(0.7kb)，插入pCIEGP構(gòu)建體的SalⅠ位點(diǎn)，制備出pHORSE。當(dāng)在存在或缺乏pCI-Rev(表達(dá)EIAVRev開放閱讀框的構(gòu)建體，見上文)時(shí)檢測pHORSE構(gòu)建體的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它與預(yù)期的相同，對Rev有依賴性。然而，蛋白質(zhì)表達(dá)水平低于pONY3.1。另外，當(dāng)用于產(chǎn)生病毒時(shí)，滴度比pONY3.1的低100倍。出乎意料地是，當(dāng)將pONY3.1的前導(dǎo)序列(含有從5’LTR之U5末端至gag383-524nt的ATG起始密碼子的序列)插入pHORSE，制備出pHORSE3.1時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)和病毒生產(chǎn)得以改善。通過用pONY3.1的1.6kbXhoⅠ/XbaⅠ片斷取代pHORSE中1.5kb的XhoⅠ/XbaⅠ片斷制備出pHORSE3.1。用pHORSE3.1得到的滴度類似于用pONY3.1得到的滴度。相對于pONY3.1而言，pHORSE3.1滴度略低的原因可能是用pHORSE3.1進(jìn)行4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染(因?yàn)樵撓到y(tǒng)依賴于Rev)的需求所致。因此，我們得出結(jié)論基本的EIAV載體系統(tǒng)應(yīng)具有該前導(dǎo)序列以使gagpol的表達(dá)水平最大化。當(dāng)pHORSE3.1，pRV67，pCIRev和pEGASUS/RRE被用于4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)(表6)，產(chǎn)生了高滴度的病毒(2.0×104l.f.u./ml)。該系統(tǒng)缺乏Tat中負(fù)責(zé)Tat反式激活的第二個(gè)外顯子(Southgate等，病毒學(xué)雜志，1995，692605-2610)。這表明Tat不是基于EIAV的載體系統(tǒng)所必需的。通過對pHORSE3.1的骨架進(jìn)行改造以表達(dá)Rev(用EIAVRev的開放閱讀框取代Neo開放閱讀框)可消除對4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的需求。通過用StuⅠ和BstⅪ切割pCI-Neo并用T4DNA聚合酶補(bǔ)平5’突出端即可做到這一點(diǎn)。籍此產(chǎn)生4.6kb的載體片斷，其中插入了得自pTopoRevpos的Rev開放閱讀框(用SacⅠ和XbaⅠ切割產(chǎn)生0.6kb的帶，其中使用T4DNA聚合酶補(bǔ)平5’突出端)。該載體被稱為pCREV。用XhoⅠ和NotⅠ從pHORSE3.1中切下包括RRE和前導(dǎo)序列的EIAVgagpol讀碼框(5.5kb)，插入pCREV的XhoⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，得到pEGPR3.1。EIAVgagpol的密碼子最優(yōu)化應(yīng)消除gagpol蛋白質(zhì)表達(dá)對RRE/Rev系統(tǒng)的依賴性。使用異源RNA輸出系統(tǒng)，如得自摩-傅猴病毒(MPMV)的組成型運(yùn)輸元件(CTE)也可消除pEGASUS-1對Rev/RRE的需求(Bray等，PNAS，1994，911256-1260，Kim等，1998)。表4載體gagpolD17細(xì)胞上的比例滴度(l.f.u./ml)(非分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞非分裂細(xì)胞/分裂細(xì)胞)S2+S2+,dUTPase+2.2×1051.1×1050.5S2-S2+,dUTPase+l.5×l051.3×1050.9S2-S2-,dUTPase+1.0×1051.2×1051.2S2-S2-,dUTPase-1.5×1051.6×1051.1S2+S2-,dUTPase+2.2×1052.3×1051.0S2+S2-,dUTPase-1.5×1051.4×1051.0S2+S2+,dUTPase-1.5×1051.4×1051.0MLV載體1.2×1076.7×1050.0006模擬實(shí)驗(yàn)＜1＜11pONY2.10LacZ和pEGASUS+/-EIAVRRE的比較具有Rev的滴度高于pEGASUS-l的滴度，甚至在不舍RRE時(shí)也是如此，REV的作用可能由gagpol表達(dá)增強(qiáng)來體現(xiàn)。表6用pCI-Rev和pRV67對293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將病毒滴定至D17細(xì)胞上。引物SY5ACCCCGTACGTCTTCCCGAGCG(下劃線的是SunⅠ)dUTPaseFGTTATTAATTAATGGAGGAATAATTGAAGAAGGATATAC(下劃線的是PacⅠ)(黑體的堿基是由T至A的單堿基變化，該變化使dUTP酶滅活)dUTPaseRTCTTCTGCAGGTCCTGATCCTTGCTTAGTGC(下劃線的是PstⅠ)S2StopRGACCATGTTACCCCTTTACCATTAACTCCCTAATATCAAAC(黑體的堿基是由TATGG至TTAGG的變化，該變化除去了S2的起始密碼子)S2StopFGTAAAGGGGTAACATGGTCAGCATCGCATTCTACGGGGGAATCC(黑體的堿基是由TATGG至TACGG的變化，該變化除去了S2的起始密碼子)EGAGP5’OUTERCCATGCACGTCTCGAGCCAGCATGGGAGACCCTTTGAC(下劃線的是XhoⅠ)EGAGP3’OUTERCGAGCTAGAGGTCGACTCAATTTGGTTTATTAGTAAC(下劃線的是SalⅠ)EGAGPINNER3GCAATGGAATGACATCCCTCAGCTGCCAGTCC(下劃線的是PvuⅡ)EGAGPINNER5GGGATGTCATTCCATTGCCACCATGGGAAGTATTTATCACTA(下劃線的是NcoⅠ)實(shí)施例10-pONY4載體系列為了避免在轉(zhuǎn)錄EIAV基因組時(shí)使用Tat并增加全長轉(zhuǎn)錄物的量，對pEGASUS載體(實(shí)施例2)而言可用HCMV增強(qiáng)子/啟動子取代EIAVU3(5’LTR)。質(zhì)粒構(gòu)建pONY2.11lacZ的gag中含有缺失，僅保留了373bp的gagORF。通過用pEGASUS-1的CMVLTR取代5’LTR可制備pONY4。用BglⅡ/XhoⅠ切割pEGASUS-1釋放出3.2kb片斷(含有CMVLTR)，將該片斷插入用BglⅡ/XhoⅠ切割的pSP72中。該構(gòu)建體被稱為pSPPEG213。用HpaⅠ/NarⅠ切割該構(gòu)建體，將1.3kb的片斷(包含CMVLTR)插入用NaeⅠ/NarⅠ切割的pONY2.11lacZ中。pONY4.1在lacZ基因下游(SfuⅠ和SalⅠ位點(diǎn)之間)含有缺失(2.1kb)，使得tat,S2,env,rev和RRE或者缺失或者被大大截短(圖11c)。通過用SfuⅠ/SalⅠ切割，用Klenow聚合酶使之成為平端并進(jìn)行再連接可制備出pONY4.1。通過用pEGFP-N1(Clontech)的GFP基因平端片斷(BamHⅠ/XbaⅠ切割后再用Klenow聚合酶使之成為平端)取代pONY4的lacZ基因(SacⅡ/KpnⅠ切割后再用Klenow聚合酶使之成為平端)可制備pONY4G。載體的產(chǎn)生和檢測用16微克載體質(zhì)粒，16微克gagpol質(zhì)粒和8微克包膜質(zhì)粒，通過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染鋪于10cm培養(yǎng)皿中的人腎293T細(xì)胞以產(chǎn)生載體原種。轉(zhuǎn)染36-48小時(shí)之后，過濾(0.45μm)上清液，等分成小份，儲存于-70℃。4℃，以20000rpm超速離心(SW40Ti轉(zhuǎn)子)90分鐘以制備濃縮的載體制品。將病毒重新懸浮于PBS中達(dá)3-4小時(shí)，等分成小份，儲存于-70℃。在8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。始終可觀察到pONY2.11lacZ產(chǎn)生的滴度比較少缺失的pONY2.10lacZ產(chǎn)生的滴度約高2至4倍。對pONY4而言，當(dāng)其5’LTR中的U3被CMV增強(qiáng)子/啟動子取代時(shí)，滴度又增加了5至10倍。實(shí)施例11-EIAV“自我-滅活”的載體(SIN-載體)LTR中的元件會影響得自EIAV載體的轉(zhuǎn)基因在特定細(xì)胞類型中的表達(dá)。為了除去該元件，可構(gòu)建SIN(自我滅活的)載體，然而，有效產(chǎn)生載體所必需的某些序列必須維持，這一需求影響到該載體的精確構(gòu)型(分子細(xì)胞生物學(xué)，1996，Sep；16(9)4952-5l)。RNA結(jié)構(gòu)是通過裂解和聚腺苷酸化特異性因子進(jìn)行poly(A)位點(diǎn)識別的決定因素，GraveleyBR,FlemingES,GilmartinGM，病毒學(xué)雜志，1996，Mar；70(3)1612-7，兩個(gè)不大相關(guān)的慢病毒中通過U3序列增強(qiáng)mRNA3’加工的共有機(jī)制，GraveleyBR,GilmartinGM。另外，SIN載體提供了避免在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中產(chǎn)生全長轉(zhuǎn)錄物的途徑。制備了兩個(gè)SIN載體一個(gè)含有推定的重要序列(用于聚腺苷酸化)，該序列位于MluⅠ和MunⅠ位點(diǎn)之間，另一個(gè)中缺失了所述序列。缺失的5’邊界是距3’LTR之U3區(qū)域的5’末端112個(gè)堿基處。圖12中示出了兩個(gè)SIN載體的結(jié)構(gòu)。pONY4G.SIN-MLU和pONY4G.SIN-MUN載體中存在的缺失以破折線表示，引物以斜體表示。使用pONY4G為模板，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增得到核苷酸7300至8079(根據(jù)登記號為U01866的EIAV克隆pSPEAIV19計(jì)數(shù))之間的DNA序列。擴(kuò)增的有義引物為ERRE3，反義引物為SIN-MLU(C7143GTCGAGCACGCGTTTGCCTAGCAACATGAGCTAG，黑體為MluⅠ位點(diǎn))或SIN-MUN(C7142GTCGAGCCAATTGTTGCCTAGCAACATGAGCTAG，黑體為MunⅠ位點(diǎn))，其中下劃線序列與(pSPEIAV19)的核苷酸8058-8079互補(bǔ)。分別用NspⅤ和MluⅠ或MunⅠ消化PCR產(chǎn)物，然后連接至分別用NspⅤ(SfuⅠ)和MluⅠ(部分消化)或MunⅠ消化過的pONY4G中。實(shí)施例12-具有反向構(gòu)型內(nèi)部啟動子-報(bào)道基因盒的EIAV載體在如pONY4Z或pONY4G的EIAV載體中，內(nèi)部CMV-報(bào)道基因盒的定向使自5’LTR和內(nèi)部啟動子的轉(zhuǎn)錄方向相同，在兩個(gè)啟動子的轉(zhuǎn)錄物中使用了3’LTR的聚腺苷酸化信號。通過調(diào)轉(zhuǎn)內(nèi)部啟動子-報(bào)道基因盒的方向得到另一種構(gòu)型，然而，聚腺苷酸化信號必需置于盒的下游。按下述制備一例“反向”載體。用PstⅠ消化pONY4Z，用T4DNA聚合酶補(bǔ)平突出的末端。將其用作“載體”片斷與pEGFP-C1的MluⅠ/AseⅠ片斷(含有包括CMV-GFP-SV40早期mRNApolyA信號盒的序列)進(jìn)行連接。連接前，用T4DNA聚合酶使該片斷成為平端。載體編碼質(zhì)粒被稱為pONY4Greverse。通過與分別表達(dá)EIAVgag/pol和VSV-G蛋白的pONY3.1和pRV67共轉(zhuǎn)染，從pONY4Greverse中回收載體顆粒。pONY4Greverse對D17犬細(xì)胞的滴度比平行回收的pONY4G載體低13倍。pONY4Greverse的滴度較低可能是驅(qū)動基因組轉(zhuǎn)錄的CMV啟動子和GFP相互之間的干擾所致，然而，插入的CMV-GFP-polyA盒中存在的得自SV40的聚腺苷酸化信號對基因組RNA的截短作用也是一個(gè)原因。通過用牛生長激素聚腺苷酸化(BGHpA)信號取代pONY4Greverse的聚腺苷酸化信號可制備改良載體。為了進(jìn)行這種改良，用BstAPⅠ消化pONY4Greverse，用T4DNA聚合酶使其成為平端，用PstⅠ進(jìn)行切割。將該“載體”片斷與代表BGHpA的DNA片斷連接，后一片斷的制備方法如下用SphⅠ消化pcDNA3.1+(Invitrogen)，然后用T4DNA聚合酶使其成為平端，再用PstⅠ進(jìn)行切割。實(shí)施例13-構(gòu)建并使用含有內(nèi)含子的polyA信號在本文所述的pONY載體中，所用聚腺苷酸化信號得自EIAV，其位于3’LTR的R和U5邊界。該信號可能不是最優(yōu)化的，因?yàn)樗鼈儾皇枪灿行蛄?見Whitelaw和Proudfoot，1986EMBO5；2915-2922和Levitt等，1989，Gen.andDev.3；1019-1025，其中描述了聚腺苷酸化信號的共有序列)。改良病毒聚腺苷酸化的一個(gè)方法是用共有的/強(qiáng)聚腺苷酸化信號的polyA取代3’LTRpolyA信號。通過這種方法，使生產(chǎn)細(xì)胞中的信號最優(yōu)化。然而，轉(zhuǎn)導(dǎo)后丟失了該信號，因?yàn)樵趶?fù)制過程中，5’LTR是polyA信號的來源(見逆轉(zhuǎn)錄病毒1998CSH出版社(J.Coffin編)，有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄病毒生命周期的綜述)。解決這一問題(轉(zhuǎn)導(dǎo)后沒有強(qiáng)的聚腺苷酸化信號)的新方法是以下列詳細(xì)描述的方式導(dǎo)入polyA信號該方法使用“割裂的polyA信號”，其中通過內(nèi)含子將aataaa基元與必需的g/u盒分開。Liu等人(1993N.A.R.21；5256-5263)以前使用過該信號，他們闡明aataaa和g/u盒之間的大缺口會使polyA信號失去功能，聚腺苷酸化過程先于剪接。通過將割裂的polyA信號置于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，該信號在轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞之前不再起作用。這是因?yàn)榫巯佘账峄扔诩艚?，因此生產(chǎn)細(xì)胞中的載體表達(dá)過程中不使用上游割裂的polyA信號。圖13圖示了含有割裂的polyA信號的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在生產(chǎn)和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中是如何起作用的。首先，該圖闡明盡管存在上游共有的聚腺苷酸化信號，但必要時(shí)使用病毒或其它polyA信號仍可使原始載體轉(zhuǎn)錄物平常的3’LTR聚腺苷酸化。這是因?yàn)楸M管上游polyA信號在最終的載體基因組中是有功能的，但聚腺苷酸化機(jī)器并沒有讀出該信號，因?yàn)樵撔盘栔辉诔?nèi)含子時(shí)產(chǎn)生，而并不存在于主要的RNA轉(zhuǎn)錄物中。第二，該圖闡明通過轉(zhuǎn)導(dǎo)，所得載體轉(zhuǎn)錄物在第一信號處被聚腺苷酸化；該信號已成為正常的強(qiáng)的聚腺苷酸化信號，而沒有內(nèi)含子將必需的aataaa和g/u盒分開。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中包含這種割裂的polyA信號有下列很多優(yōu)點(diǎn)(1)在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)使用強(qiáng)的不基于病毒的聚腺苷酸化信號會增強(qiáng)所述細(xì)胞中的基因表達(dá)。(2)使用基于天然LTR(見圖13)之信號上游的polyA信號，轉(zhuǎn)導(dǎo)后會產(chǎn)生較短的在其3’端含有較少病毒序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，因此不能進(jìn)行隨后的逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)際上，如果目的基因由內(nèi)部啟動子(如CMV)而不是LTR表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)所得的轉(zhuǎn)錄物可被設(shè)計(jì)成根本不含病毒序列(見圖13A)。(3)包含3’LTR上游信號意味著割裂polyA信號下游RNA的表達(dá)僅限于生產(chǎn)細(xì)胞，因?yàn)檗D(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄這種RNA。因此將某些序列的表達(dá)(如IRESneo；見圖14B)限于生產(chǎn)細(xì)胞。(4)生產(chǎn)細(xì)胞中內(nèi)含子的存在將有助于載體RNA由核輸出。(5)由于轉(zhuǎn)導(dǎo)后存在內(nèi)部功能性的polyA信號，因此必要時(shí)可除去/缺失5’LTR中的病毒polyA信號(逆轉(zhuǎn)錄過程中為3’位置的拷貝)。這么做的用途是防止生產(chǎn)細(xì)胞中自5’LTR啟動子-近側(cè)的聚腺苷酸化過程(見Scott和Imperiale1997(分子細(xì)胞生物學(xué)，172127-35))，因此促進(jìn)病毒全長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。實(shí)例為了闡明該信號在逆轉(zhuǎn)錄病毒中的用途；按圖15所述構(gòu)建“割裂的polyA信號”盒；其中內(nèi)含子序列得自pCI(Promega)。制備好以后，使用與pONY4-GFP(圖16)唯一的sse8387位點(diǎn)相容的PstⅠ將該盒克隆至pONY4GFP載體中。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，所得載體的3’LTR之前被聚腺苷酸化，因此3’至lacZ的病毒RNA不能被轉(zhuǎn)錄(圖16)。實(shí)施例14-構(gòu)建MLV/EIAV載體通過用MLV等同物取代EIAVLTR序列，pONY載體的重復(fù)區(qū)域(R)內(nèi)不再具有功能性的tar元件，結(jié)果，U3啟動子不需要轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的Tat即可行使功能。圖17描述的是用圖18所述引物經(jīng)重疊PCR制備載體的過程。使用引物Me1和Me2由MLV載體pHIT111(Soneoka等，1995，NAR23628-633)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，而使用引物Me3和Me4由pONY4lacZ擴(kuò)增產(chǎn)物。然后在無引物的PCR反應(yīng)中將所得的兩個(gè)產(chǎn)物混合以重疊它們(圖17的陰影部分顯示出兩個(gè)產(chǎn)物之間的同源性)。用BglⅡ和XbaⅠ切割最終的全長產(chǎn)物，并用于取代pONY4lacZ(含有CMV/R/U5)的Bgl1-XbaⅠ片斷，制備出pONY4-5’MLV。所得載體具有得自MLV的CMV/R/U5序列，該序列與EIAVU5序列(整合前由整合酶進(jìn)行基因組識別所需的序列)相連。下一步包括用引物Me5和Me6由pONY4LacZ模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和用引物Me7和Me8由pLXSN模板(Miller和Rosman1989生物技術(shù)7980-990)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后通過無引物的PCR重疊這兩個(gè)PCR產(chǎn)物(引物之間的同源性由開口的框表示)，用NspⅤ和MunⅠ切割所得片斷，插入pONY4-5’MLV的NspⅤ-MunⅠ位點(diǎn)；從而用與pONY4lacZ之3’UTR/ppt/U3整合酶結(jié)合位點(diǎn)融合的3’MLVLTR取代3’EIAVLTR。所得質(zhì)粒被稱為pONY-MOUSE(見圖19完整的DNA序列)，當(dāng)在HIT系統(tǒng)中與pONY3.1和pRV67聯(lián)合時(shí)，滴度為104-5/ml。實(shí)施例15-驅(qū)動慢病毒載體基因組的早期啟動子在此實(shí)施例中，EIAV基因組由痘苗病毒早期啟動子P7.5E(Davison1989a)表達(dá)。啟動子經(jīng)改造后可產(chǎn)生具有正確5’RNA末端的EIAV基因組。另外，還將痘苗病毒早期終止序列插入EIAV基因組的下游。將所得產(chǎn)物插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSC65，它可同源重組至MVA基因組的TK區(qū)域。通過其缺乏對BudR的敏感性這一特征來選擇重組病毒(Earl等，1998)。圖11圖示說明了實(shí)施例10所述的EIAV基因組載體pONY4.0和pONY4.1以及痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pSC65(Chakrabarti等，1997)。P7.5E序列是AAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATT。早期啟動子的早期終止序列是TTTTTNT(N=任何核苷酸)(Fields)。按下述進(jìn)行DNA操作，圖20和21給出了PCR引物的序列。引物為EMVA1/2的PCR產(chǎn)生了U3區(qū)域被P7.5E啟動子取代的5’LTR。使用HindⅢ/PstⅠ位點(diǎn)將其插入質(zhì)粒pSP72(Promega)以制備pEMVA1。EIAVU3含有與痘苗病毒早期終止規(guī)則相匹配的序列(TTTTTAT)。使用引物EMVA3/4和EMVA5/6和重疊PCR，將該區(qū)域突變?yōu)門TTCCAT以防止早期終止。使用BglⅡ/PstⅠ位點(diǎn)將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入pEMVA1，產(chǎn)生pEMVA2。使用引物EMVA7/8將終止序列(TTTTTTTTT)插入3’LTRR區(qū)域的下游。使用MunⅠ/BglⅡ位點(diǎn)將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入pEMVA2得到pEMVA3。經(jīng)由NarⅠ/NspⅤ位點(diǎn)將EIAV載體基因組的其余部分(pONY4)插入該質(zhì)粒得到pEMVA4(圖22)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割，插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65中，得到pEPONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖23)。這樣就除去了兩個(gè)痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。為了制備該構(gòu)建體與pONY4.1類似的基本EIAV基因組版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA4，使其成為平端并再連接以制備出pEMVA5(圖24)。這樣就除去了lacZ基因末端和末端包膜區(qū)域之間的很多序列，因此該載體不含Tat，Rev，S2和Env。相關(guān)描述見實(shí)施例10。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65中，制備出pEPONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖24)。這樣就除去了兩個(gè)痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。使用BHKTK-ve細(xì)胞系(ECACC85011423)和構(gòu)建重組痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法(Earl等，1998a&1998b)，pEPONY4.0和pEPONY4.1都適于將基因組表達(dá)盒插入MVA基因組的TK區(qū)域(CarrollMW和MossB病毒學(xué)1997Nov24；238(2)198-211)。實(shí)施例16-驅(qū)動慢病毒載體基因組的合成的早期/晚期啟動子痘苗病毒合成的早期/晚期啟動子對RNA起始位點(diǎn)的下游序列是有要求的(Davison1989b)。為此，用于產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的啟動子要么R區(qū)域被修飾，要么使用核酶產(chǎn)生正確的5’末端。修飾R區(qū)域是困難的，因?yàn)槠鹗嘉稽c(diǎn)還未全部被鑒定，其序列也有差異(Davison1989b)。下文描述了由合成的早期/晚期啟動子(Psyn)表達(dá)EIAV基因組的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的產(chǎn)生。啟動子的下游插入了核酶以確保產(chǎn)生正確的RNA5’末端。該構(gòu)建體還含有早期終止序列。DNA操作如下引物為EMVA9/1的PCR產(chǎn)生了U3區(qū)域被Psyn啟動子和錘頭核酶取代的5’LTR(圖25和26)。使用PacⅠ/NarⅠ位點(diǎn)將其插入質(zhì)粒pEMVA4(實(shí)施例15)，制備出pEMVA6(圖27)。用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65中，制備出pSynPONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖27)。這樣就除去了兩個(gè)痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。為了制備該構(gòu)建體與pONY4.1類似的基本EIAV基因組版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA6，使其成為平端并再連接以制備出pEMVA7(圖28)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65(痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體)中，制備出pSynPONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖28)。這樣就除去了兩個(gè)痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。用構(gòu)建重組痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法(Earl等，1998a&1998b)，pSynPONY4.0和pSynPONY4.1都適于將基因組表達(dá)盒插入MVA基因組的TK區(qū)域(CarrollMW和MossB病毒學(xué)1997Nov24；238(2)198-211)。實(shí)施例17-驅(qū)動慢病毒載體基因組的T7啟動子可使用T7啟動子產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，其可制備出正確的5’末端。下文描述了由T7啟動子(T7)表達(dá)EIAV基因組的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的產(chǎn)生。還將T7終止序列插入該啟動子的下游。將所得產(chǎn)物插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSC65，它可同源重組至MVA基因組的TK區(qū)域。T7啟動子需要T7聚合酶，可以使用由痘苗病毒啟動子表達(dá)T7聚合酶的MVA病毒(Wyatt等，1995)。T7啟動子具有序列(-)TAATACGACTCACTATAGG(+2)，轉(zhuǎn)錄自A之后開始，優(yōu)選自連續(xù)幾個(gè)G開始。T7終止序列是CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。T7啟動子和終止序列描述于質(zhì)粒pCITE-4a(+)(Novagen)中。DNA操作如下引物為EMVA10/11的PCR(圖29)產(chǎn)生了U3區(qū)域被T7啟動子取代的5’LTR。使用PacⅠ/NarⅠ位點(diǎn)將其插入質(zhì)粒pEMVA4，制備出pEMVA8(圖30)。引物為EMVA11/7的PCR產(chǎn)生了具有T7終止序列的3’LTR部分，使用MunⅠ/BglⅡ位點(diǎn)將其插入pEMVA8以制備pEMVA9。用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65(痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體)中，制備出pT7PONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖30)。這樣就除去了兩個(gè)痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。為了制備該構(gòu)建體與pONY4.1類似的基本EIAV基因組版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA9，使其成為平端并再連接以制備出pEMVA10(圖31)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割過的pSC65(痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體)中，制備出pT7PONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(圖31)。這樣就除去了兩個(gè)痘苗病毒啟動子和pSC65的lacZ編碼盒。用構(gòu)建重組痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法(Earl等，1998a&1998b)，pT7PONY4.0和pT7PONY4.1都適于將基因組表達(dá)盒插入MVA基因組的TK區(qū)域(CarrollMW和MossB病毒學(xué)1997Nov24；238(2)198-211)。實(shí)施例18-構(gòu)建EIAVgag/pol盒以在痘苗病毒中表達(dá)EIAVgag/pol的表達(dá)一般需要Rev/RRE，因?yàn)镽ev能使未剪接的轉(zhuǎn)錄物輸出至核外。由于痘病毒位于胞質(zhì)中，因此EIAV病毒RNA的輸出應(yīng)該不成問題。但是，如果Rev具有其它功能，例如可維持RNA穩(wěn)定性或作為翻譯增強(qiáng)子起作用，可以類似的方式將其表達(dá)為EIAVgag/pol(Martarano1994)?；蛘?，可使EIAVgag/pol序列的密碼子最優(yōu)化以克服輸出的Rev/RRE需求并增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定性。下文描述了由合成的早期/晚期啟動子(Psyn)表達(dá)EIAVgag/pol的載體的產(chǎn)生。將其插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLW-22(Wyatt和Moss附錄1，Earl等1998a&b)，它可同源重組至MVA基因組的DelⅡ區(qū)域。通過其表達(dá)的lacZ來選擇重組病毒。用XhoⅠ/NotⅠ切割pHORSE3.1(實(shí)施例9)給出5.5kb的帶，從而得到包括前導(dǎo)序列和gag/pol開放閱讀框和RRE的EIAVgag/pol(圖32)。然后將其插入用SalⅠ/NotⅠ(SalⅠ和XhoⅠ相容)切割的痘苗病毒轉(zhuǎn)移載體pLW-22中，制備出pLWHORSE3.1(圖32)。實(shí)施例19-構(gòu)建EIAVrev盒以在痘苗病毒中表達(dá)如果由痘病毒產(chǎn)生EIAV病毒載體需要Rev，可由合成的早期/晚期啟動子(Psyn)進(jìn)行表達(dá)。將該構(gòu)建體插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pMCO3，它可同源重組至MVA基因組的DelⅢ區(qū)域。通過其表達(dá)的GUS來選擇重組病毒(Carroll等，1995)。DNA操作如下質(zhì)粒pCIRev描述于實(shí)施例9。該質(zhì)粒是EIAVRev表達(dá)質(zhì)粒。用AflⅡ/NotⅠ切割(0.6kb)，通過T4DNA聚合酶使其成為平端，插入用PmeⅠ切割的pMCO3(Carroll等，1995)中，得到pMCRev(圖33)。實(shí)施例20-構(gòu)建異源包膜盒以在痘苗病毒中表達(dá)EIAV可以是具有多種包膜，如VSV-G和兼嗜性MLV包膜的假型病毒。下文描述了由P7.5早期/晚期啟動子表達(dá)兼嗜性包膜或VSV-G包膜的MVA轉(zhuǎn)移載體的產(chǎn)生。轉(zhuǎn)移載體是pYF6，它可同源重組至MVA的HA區(qū)域。通過直接對env的表達(dá)進(jìn)行活免疫染色可選擇重組病毒。為了產(chǎn)生含有VSV-G盒的轉(zhuǎn)移載體，用SmaⅠ/EcoRⅤ切割VSV-G表達(dá)質(zhì)粒pRV67(Kim等，1998)(1.7kb)，將所得片斷插入用SmaⅠ切割的pYF6中，制備出pYFVSVG(圖34)。類似地，為了產(chǎn)生類似的兼嗜性包膜構(gòu)建體，用XbaⅠ切割pHIT456(Soneoka1995)，用T4DNA聚合酶使2.2kb的帶成為平端，插入用SmaⅠ切割的pYF6中，得到pYFAmpho(圖35)。用構(gòu)建重組痘病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法(Earl等，1998a&1998b)，pYFAmpho和pYFVSVG都適于將基因組表達(dá)盒插入MVA基因組的HA區(qū)域(CarrollMW和MossB病毒學(xué)1997Nov24；238(2)198-211)。實(shí)施例21-構(gòu)建和擴(kuò)增MVA-Lenti重組體通過依次與相關(guān)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒重組，構(gòu)建出重組痘苗病毒，所述病毒含有多個(gè)編碼EIAV載體成分的插入物(圖25)。下文例舉了v.MEeG-Or的構(gòu)建(圖36)1．用攜有g(shù)ag-pol的質(zhì)粒(pLWHORSE3.1)轉(zhuǎn)染BHK-21或CEF細(xì)胞，所述細(xì)胞以前曾被MVA感染過(Carroll和Moss1997，Earl等1998a&b)。2．感染2天后，在BHK-21/CEF上檢測重組MVA病毒，在細(xì)胞上覆蓋一層瓊脂培養(yǎng)基，其中含有由pLW22表達(dá)的顏色標(biāo)記β-半乳糖苷酶的底物(Chakrabarti等，1985)。3．挑選藍(lán)色噬斑，進(jìn)行噬斑純化直至得到均一的重組病毒群體。4．然后用重組病毒與含有其它重組基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒重組pMCRev，其中基于GUS表達(dá)進(jìn)行選擇(Carroll和Moss1995)，基因組(pEPONY4.0)，其中使用BudR基于TK陰性表型進(jìn)行選擇(Carroll和Moss1997，Earl等1998a&b)和VSVG(pYFVSVG)，其中通過直接免疫染色VSVG來鑒定重組體(Earl等1998a&b)。按下述在BHK-21或CEF細(xì)胞中擴(kuò)增重組病毒增殖痘苗病毒高度減毒的毒株MVA衍生自有復(fù)制能力的毒株Ankara，并且在原代的雞胚成纖維細(xì)胞中經(jīng)過570次傳代。起初認(rèn)為MVA復(fù)制局限于CEF細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯游锛?xì)胞中的復(fù)制極少見報(bào)道。然而，進(jìn)一步的分析表明倉鼠幼腎細(xì)胞(BHK-21)能支持高滴度的MVA產(chǎn)生。因此，MVA可在BHK-21或原代CEF細(xì)胞上生長(Carroll和Moss1997，病毒學(xué)238198-211)。為了制備CEF細(xì)胞，取出10天齡雞胚的內(nèi)臟，除去四肢和頭，鉸碎，在0.25％胰蛋白酶溶液中進(jìn)行消化并于37℃保溫。將細(xì)胞懸浮液流過一層過濾篩以進(jìn)行過濾，洗滌細(xì)胞，在SorvallRC-3B中以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘使細(xì)胞濃縮。將細(xì)胞懸浮于含有10％FCS的MEM中，等分至175cm培養(yǎng)瓶中，37℃在CO2溫箱中保溫。當(dāng)細(xì)胞單層95％鋪滿時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，用于接種另一培養(yǎng)瓶或6孔培養(yǎng)板?；蛘撸瑢⒃囵B(yǎng)物轉(zhuǎn)移至31℃的溫箱中待用(Sutter和Moss(1992)ProcNatlAcadSciUSA8910847-1085l)。制備粗的，半純化的和純化的病毒原種粗的病毒原種可用于初步的重組病毒分析或作為病毒原種用于隨后的高滴度病毒的制備。通過離心出細(xì)胞膜和核或通過防止預(yù)表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物和細(xì)胞器污染的其它步驟(包括蔗糖離心)可對痘苗病毒制品進(jìn)行半純化。所用方法為Earl等1998a&b；Earl和Moss，文獻(xiàn)同上，pp.16.17.1-16.17.16；Earl和Moss，文獻(xiàn)同上，pp.16.18.1-16.18.10；和Bronte等(1997)ProcNatlAcadSciUSA94(7)3183-3188所述方法的改良方法。粗病毒在CEF或BHK-21(得自ATCC)中培養(yǎng)MVA，在175cm2組織培養(yǎng)瓶中，在HeLa或BS-C-1(ATCC)中培養(yǎng)WR。簡單地說，用感染復(fù)數(shù)約為1pfu的MVA或WR感染鋪滿的細(xì)胞單層。將病毒懸浮于10ml含有2％FCS的MEM中，并加入含有鋪滿的細(xì)胞單層的175cm2組織培養(yǎng)瓶中。37℃接種1小時(shí)之后，再加入20ml含有2％FCS的MEM。48至72小時(shí)之后，將感染的細(xì)胞刮到培養(yǎng)基中，1500g沉淀5分鐘。為了制備粗病毒，將細(xì)胞重新懸浮于每個(gè)175cm2組織培養(yǎng)瓶中的2mlMEM(2％)中。將細(xì)胞凍融3次，超聲處理，等分至1ml冷凍管中。凍融代表性的等分試樣，滴定以測定病毒濃度。將病毒原種儲存于-20℃以下。半純化的制品按上述收集感染細(xì)胞(Earl等1998a&b；Earl和Moss，1991)。離心后將細(xì)胞重新懸浮于PBS(2ml/175cm2培養(yǎng)瓶)中，在冰上，在適當(dāng)密封的玻璃dounce勻漿器中經(jīng)30至40次摩擦以勻漿細(xì)胞。通過顯微鏡檢查細(xì)胞破裂情況。300g離心5分鐘(4℃)以除去核，細(xì)胞器和膜，保留上清液。將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于1ml/175cm2培養(yǎng)瓶中，再次離心。收集上清液，等分后冷藏。純化的制品按上述收集感染細(xì)胞(Earl等1998a&b；Earl和Moss，1991)，重新懸浮于10mMTris.Cl,pH9.0(2ml/175cm2培養(yǎng)瓶)中，從此將樣品置于冰上。按上述使用10mMTris進(jìn)行勻漿。使用XL2015超聲杯(Misonics,USA)，以最大輸出量(500W)超聲處理裂解物1分鐘(在冰上)。將樣品置于冰上1分鐘，重復(fù)超聲處理3次。每次最多超聲處理5ml樣品，超聲處理過程中要加冰。將裂解物小心地鋪在SW-27離心管中的17ml36％蔗糖(溶于10mMTris.Cl,pH9.0)墊層上。4℃，用SW-27轉(zhuǎn)子，以13500rpm(32，900×g)的轉(zhuǎn)速將裂解物離心80分鐘。棄去上清液，將病毒沉淀物重新懸浮于無菌的PBS中，在超聲杯中超聲處理1分鐘(在冰上)。等分濃縮的病毒并儲存于-20℃以下。實(shí)施例22-由MVA-EIAV雜合體產(chǎn)生EIAV載體顆粒如上所述大規(guī)模制備重組MVA-EIAV制品。使用這些制品感染不允許MVA進(jìn)入的哺乳動物細(xì)胞以使所得上清液僅含有EIAV和非感染性的MVA(Meyer等，1991，Carroll和Moss1997)。適當(dāng)?shù)募?xì)胞系是MRC5(ATCC)。以3為感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞。感染可進(jìn)行48小時(shí)左右，然后收集上清液，EIAV載體顆?？芍苯邮褂没蛲ㄟ^超速離心或交叉-流動法進(jìn)行濃縮/純化。為了大規(guī)模生產(chǎn)制品，可在懸浮液中或在微載體上或在滾動瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。按此方法制備的攜有目的基因的EIAV載體可用于在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。參考文獻(xiàn)Blomer.U..Naldini,L..Kafri.T_Trono,D_Verma,I.M_andGage,F.H.(1997).用慢病毒載體在成年神經(jīng)元中進(jìn)行高效和持續(xù)基因轉(zhuǎn)移，病毒學(xué)雜志，71，6641-6649。Blomer,U_Naldini.L_Verma,I.M_Trono,D_andGage,F.H.(1996).將基因療法應(yīng)用于GNS，人類分子遺傳學(xué)，5SpecNo,1397-404。Clever,J_Sassetti,C_andParslow.T.G.(1995)。人免疫缺損病毒1型5’包裝信號的RNA二級結(jié)構(gòu)和針對gag基因產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)，病毒學(xué)雜志，69，2101-9。Clever.J.L..andParslow,T.G.(1997)。RNA二聚體化或衣殼化有缺陷的突變的人免疫缺損病毒1型基因組，病毒學(xué)雜志，71，3407-14。Fields,B.N_Knipe,D.M_andHowley,P.M.(1996).FieldsVirology,R.M.Chanock,J.L.Melnick,T.P.Monath,B.RoizmanandS.E.Straus.編.(philadelphia.NewYork:Lippincott-RavenPublishers).FullerS.vonBonsdorffCH,SimonsK.水泡性口炎病毒僅通過極化上皮細(xì)胞系MDCK的基底層表面感染和成熟，細(xì)胞，1984Aug;38(1)65-77Harrison,G.S_Long,c.J_Maxwell,F_Glode,L.M..andMaxwell,I.H.(1992).在含有整合的，受HIV-調(diào)節(jié)的白喉毒素A鏈基因的細(xì)胞中抑制HIV的產(chǎn)生，愛滋病研究和人逆轉(zhuǎn)錄病毒，8，39-45。HayashiT,ShiodaT,IwakuraY.ShibutaH.人免疫缺損病毒1型的RNA包裝信號，病毒學(xué)，1992Jun;188(2)590-599KimV.N_MitrophanousK_KingsmanS.M_KingsmanA.J.1998.基于人免疫缺損病毒1型的慢病毒載體的基本需求，病毒學(xué)雜志，199872811-6.Kim,S.Y_R.Bym,J.Groopman,andD.Baltimore.1989.人免疫缺損病毒感染過程中DNA和RNA合成的時(shí)序特征差異基因表達(dá)的證據(jù)，病毒學(xué)雜志，633708-3713。Lewis,P.F..andM.EmerD18n.1994.通過有絲分裂傳代是致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒而不是人免疫缺損病毒所必需的，病毒學(xué)雜志，68510-6。MannR,MulliganRC,BaltimoreD.逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝突變體的構(gòu)建及其產(chǎn)生無輔助病毒的缺損逆轉(zhuǎn)錄病毒的用途，細(xì)胞，1983May；33(1)lS3-lS9Martarano,L_Stephens,R_Rice,N..andDerse,D.(1994).馬傳染性貧血病毒反式調(diào)節(jié)蛋白Rev控制病毒mRNA的穩(wěn)定性，累積和其它的剪接方式，病毒學(xué)雜志，68，3102-11。Naldini,L_Blomer,U..Gage,F.H_Trono,D_andVerma,IM.(1996).注射了慢病毒載體的成年大鼠腦中轉(zhuǎn)基因的有效轉(zhuǎn)移，整合和持續(xù)的長期表達(dá)，ProcNatlAcidSciUSA93.11382-11388.Naldini,L..Blomer,U_Gallay.P..Ory.D_Mulligan.R_Gage,F.H_Verma,IM_andTrono.D.(1996).通過慢病毒載體進(jìn)行體內(nèi)基因傳遞并穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞(見評論)，科學(xué)272.263-7.Payne,S.L..Rausch.J_Rushlow.K.Montelaro,R.C..Issel,C..Flaherty.M_Perry,S_Sellon,D_andFuller,F.(1994).鑒定馬傳染性貧血病毒的傳染性分子克隆，普通病毒學(xué)雜志，75，425-9。Yee,1.-K_M.Atsushi,P.LaPorte.K.Bouic.J.C.Burns.andT.Friedmann(1994)產(chǎn)生高滴度泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一般方法高效感染原代肝細(xì)胞，Proc.Nlt1.Acad.Sci.USA919564-9568。Zufferey,R_Nagy.D_Mandel.R.1..Naldini,L_andTrono.D.(1997).多重減毒的慢病毒載體獲得有效的體內(nèi)基因傳遞，NatBiotechnol15，871-875。Cannon1996病毒學(xué)雜志，1996708234-40.基于鼠白血病病毒的Tat可誘導(dǎo)的長末端重復(fù)取代載體抗人免疫缺損病毒基因療法所用的新系統(tǒng)，CannonPM,KimN,KingsmanSM,KingsmanAJ.CarrollMW,MossB大腸桿菌β-葡糖醛酸酶(GUS)用作重組痘苗病毒的標(biāo)記，生物技術(shù)199519352-4CarrollMW.MossB痘苗病毒高度減毒的MVA毒株的宿主范圍和細(xì)胞病理學(xué)重組病毒在非人哺乳動物細(xì)胞系中的增殖和產(chǎn)生，病毒學(xué)，1991238198-211ChakrabartiS,BrechlingK,MossB痘苗病毒表達(dá)載體β-半乳糖苷酶的共表達(dá)能可見地篩選重組病毒噬斑，分子細(xì)胞生物學(xué)，1985123403-9ChakrabartiS,SislerJR,MossB生物技術(shù)199761094-7用于蛋白質(zhì)表達(dá)的嚴(yán)密的，合成的痘苗病毒早期/晚期啟動子Davison1989a，分子生物學(xué)雜志，198920；210(4)749-69。痘苗病毒早期啟動子的結(jié)構(gòu)，DavisonAJ,MossBDavison1989b分子生物學(xué)雜志，1989210(4)771-84.痘苗病毒晚期啟動子的結(jié)構(gòu)，DavisonAJ,MossBPL.Earl(a).N.Cooper，LSWyatt,B.Moss&M.W.Carroll1998制備細(xì)胞培養(yǎng)物和痘苗病毒原種，分子生物學(xué)最新方法增刊，43Unit16.16.IohnWileyandSonsInc.PL.Earl(b),B.MossL.S.Wyatt,&M.W.Carroll1998產(chǎn)生重組痘苗病毒，分子生物學(xué)最新方法增刊43Unit16.17.分子生物學(xué)最新方法，JohnWileyandSonsInc.FlexnerC.HuginA.MossB自然1987330(614S)259-62通過載體介導(dǎo)的IL-2表達(dá)防止痘苗病毒感染免疫缺損小鼠HolzerGW,FalknerFG通過互補(bǔ)細(xì)胞系構(gòu)建必需的DNA修復(fù)酶尿嘧啶DNA糖基化酶缺損的痘苗病毒，病毒學(xué)雜志，1997714997-5002KimVN,MitrophanousK,KingsmanSM,KingsmanAJ基于人免疫缺損病毒1型的慢病毒載體的基本需求，病毒學(xué)雜志，199872811-6MackettM,SmithOL,MossB痘苗病毒可選擇的真核克隆和表達(dá)載體，ProcNatlAcadSciUSA198279237415-9MahnelH,MayrABerlMunchTierarJ.tlWochenschr1994Aug；107(8)253-6[使用疫苗株MVA進(jìn)行抗人和動物正痘病毒之免疫的經(jīng)驗(yàn)].[德文]ZenlralblBakteriol[B]1978Dec；167{5-6)375-90MartaranoL.StephensR,RiceN.DerseD馬傳染性貧血病毒反式調(diào)節(jié)蛋白Rev控制病毒mRNA的穩(wěn)定性，累積和其它的剪接方式，病毒學(xué)雜志，1994May；68(5)3102-11MayrA.SticklH,MullerHK,DannerK,SingerH[天花免疫接種株MVA標(biāo)記、遺傳結(jié)構(gòu)、親代接種的經(jīng)驗(yàn)以及具有主動防御機(jī)制的生物體的行為].ZentralbJBakteriol[B].1978Dec；167(5-6)375-90。德文。MeyerH,SutterO,MayrA高度減毒的痘苗病毒MVA基因組中缺失的圖譜及其對毒力的影響，普通病毒學(xué)雜志，1991721031-8MossB痘病毒科病毒及其復(fù)制Chapter83.p2637-2672.InFields,B.N_Knipe,D.M.&HowJey,P.M.FieldsVirology.第3版，ednVol.2edsChanock,R..M..Melnick,J.L,Monath,T.P..R.oiZman.B.&Straus,S.E.Lippincott-RavenPublishers.Philadelphia.NewYork,1996MossB,CarrollMW,WyattLS,BenninkJR,HirschVM,OoldsteinS,ElkinsWR,FuerstTR,Lifsonm.PiatakM,RestifoNP,OverwijkW.ChamberlainR,RosenbergSA,SutterG,宿主范圍受限的，非復(fù)制痘苗病毒載體用作候選疫苗，AdvExpMedBioi1996；3977-13PanicaliD.PaolettiE構(gòu)建痘病毒作為克隆載體將單純皰疹病毒的胸苷激酶基因插入傳染性痘苗病毒的DNA中ProcNatlAcadSciUSA1982794927-31SoneokaY,CannonPMRamsdaleEE,GriffithsJC.RomanoG,KingsmanSM,KingsmanAJ1995核酸研究，199523628-33。用于產(chǎn)生高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的瞬時(shí)3質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)SutterG,MossB非復(fù)制的痘苗病毒能有效表達(dá)重組基因ProcNatlAcadSciUSA1992Nov15；89(22)10847-51TaylorJ.WeinbergR.TartagliaJ.RichardsonC.AlkbatibG,BriedisD,AppelM,NortonE,PaolettiE非復(fù)制病毒載體用作有效疫苗表達(dá)麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)糖蛋白的重組canarypox病毒，病毒學(xué)，1992Mar；187(1)321-8PaolettiE,TartagliaJ.TaylorJ安全有效的痘病毒載體-NYVAC和ALVAC.DevBioiStand1994；8265-9WyattLS,MossB,RozenblattS用于在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)基因表達(dá)的編碼噬菌體T7RNA聚合酶的復(fù)制缺損的痘苗病毒，病毒學(xué)，1995Jun20；210(1)202-5WyattLS,CarrollMW,CzemyCP,MerchlinskyM,SislerJRMossB修飾痘苗病毒Ankara的宿主范圍限制的標(biāo)記恢復(fù)，病毒學(xué)，1998251334-42WyattLS.ShorsST.MUIphyBR,MossB開發(fā)能有效抗動物模型中的副流感病毒3感染的復(fù)制缺損的重組痘苗病毒疫苗，疫苗，1996Oct；14(1S)1451-8權(quán)利要求1．衍生自含有缺失gag基因的非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中g(shù)ag中的缺失除去了gag編碼序列中核苷酸350下游的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。2．權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中缺失從核苷酸350至少延伸至gagpol編碼區(qū)的C末端。3．權(quán)利要求1或2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中缺失另外還除去了gag編碼區(qū)的核苷酸300。4．權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中缺失保留了gag編碼區(qū)的前150個(gè)核苷酸。5．權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中缺失保留了gag編碼區(qū)的前109個(gè)核苷酸。6．權(quán)利要求1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中缺失僅保留了gag編碼區(qū)的前2個(gè)核苷酸。7．衍生自非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中非靈長類動物慢病毒基因組中缺失了一個(gè)或多個(gè)輔助基因。8．權(quán)利要求7的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中輔助基因選自dUTP酶，S2，env和tat。9．衍生自慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中非靈長類動物慢病毒基因組中缺失了tat基因，但包括5’LTR末端和gagATG之間的前導(dǎo)序列。10．上述任一權(quán)利要求的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其至少含有馬慢病毒的一個(gè)成分。11．權(quán)利要求10的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中馬慢病毒是EIAV。12．權(quán)利要求11的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基本上衍生自EIAV。13．用于生產(chǎn)上述任一權(quán)利要求中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)，其包括含有非靈長類動物慢病毒的gag-pol基因和包膜基因的包裝細(xì)胞。14．由權(quán)利要求13的生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。15．雜合病毒載體系統(tǒng)，其含有衍生自痘病毒的第一病毒載體和衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的第二病毒載體。16．可由權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)或權(quán)利要求14或15的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。17．被權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)或權(quán)利要求14或15的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。18．權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)或權(quán)利要求14或15的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；驒?quán)利要求17的細(xì)胞用于制備藥物的用途。19．權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)或權(quán)利要求14或15的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒或權(quán)利要求17的細(xì)胞用于制備將NOI傳遞至有此需求的靶位點(diǎn)的藥物組合物的用途。20．包括用權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)或權(quán)利要求14或15的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蚶脵?quán)利要求17的細(xì)胞轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法。21．傳遞系統(tǒng)，其形式為權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)或權(quán)利要求14或15的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；驒?quán)利要求17的細(xì)胞。22．權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)或權(quán)利要求14或15的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或權(quán)利要求16的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；驒?quán)利要求17的細(xì)胞的傳遞系統(tǒng)，其中傳遞系統(tǒng)含有非逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，腺病毒和/或質(zhì)粒。23．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。24．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)。25．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。26．用參照附圖，基本上如上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。27．參照附圖，基本上如上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的用途。28．用參照附圖，基本上如上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法。29．傳遞系統(tǒng)，其形式為參照附圖，基本上如上文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。全文摘要衍生自含有缺失gag基因的非靈長類動物慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,其中g(shù)ag中的缺失除去了gag編碼序列中核苷酸350下游的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。文檔編號A61K48/00GK1285000SQ9881376公開日2001年2月21日申請日期1998年12月22日優(yōu)先權(quán)日1997年12月22日發(fā)明者A·J·金斯曼,M·W·卡洛爾,J·羅爾,K·米特洛法諾斯,N·金申請人:牛津生物醫(yī)學(xué)(英國)有限公司