專利名稱：含有血凝素活性膜蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及含有副粘病毒屬HN蛋白的假型病毒載體。
背景技術(shù)：
使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可在靶細胞中表達外源基因以用于研究，基因治療等?？梢杂孟鄬唵蔚姆椒ㄖ苽淠孓D(zhuǎn)錄病毒載體，所述載體也具有一些優(yōu)點，例如能將外源基因?qū)胨拗魅旧w。一般說來，位于病毒包膜的病毒蛋白質(zhì)在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染中起著至關重要的作用。研究人員致力于拓寬載體可感染的宿主細胞范圍，或通過修飾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包膜蛋白來開發(fā)僅感染特定細胞的病毒載體。
例如，已開發(fā)出將VSV-G蛋白整合至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包膜的系統(tǒng)，該系統(tǒng)能確保對較寬范圍宿主細胞的感染性(H.Yu等，1999，Gene Therapy，6，1876-1883)。VSV-G是水泡性口炎病毒包膜表面上表達的蛋白質(zhì)，它對相當寬的宿主細胞范圍有感染性。此外，例如，通過實驗已將仙臺病毒F蛋白用作包膜蛋白。發(fā)現(xiàn)F蛋白-假型逆轉(zhuǎn)錄病毒表現(xiàn)出對脫唾液酸糖蛋白受體-陽性細胞的特異性感染性(M.Spiegel等，1998，Hepatology，28，1429-1429；M.Spiegel等，1998，J.Virology，72，5296-5302)。
然而，這些常規(guī)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒對多種組織和細胞僅有不充足的感染性。例如，包括造血干細胞在內(nèi)的多種干細胞在基因治療或類似治療中可以是重要的靶細胞(Y.Hanazono，Molecular Medicine，Vol.36，No.7，1999)，但大多數(shù)干細胞處于不分裂的狀態(tài)(Abkowitz，J.L等，Nat Med，2(2)，190-7，1996)。一般說來，使用對這種不分裂的細胞表現(xiàn)出低感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體難以導入基因。另外，使用常規(guī)技術(shù)的載體系統(tǒng)不能將基因?qū)氚饣|(zhì)-豐富的細胞，例如肺氣道粘膜上皮細胞。將基因?qū)脒@些類型的細胞的方法需要通過物理清洗除去胞外基質(zhì)，例如粘液。然而，該方法過于復雜，而且會損害組織。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供含有膜蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述膜蛋白具有血凝素活性。
本發(fā)明人選擇具有血凝素活性的蛋白質(zhì)作為假型逆轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白質(zhì)。血凝素(HAin)是導致血凝(HA；紅細胞凝集)的蛋白質(zhì)，已知多種病毒具有此活性。本發(fā)明人認為可以在具有包膜的逆轉(zhuǎn)錄病毒的基礎上，構(gòu)建能夠?qū)Χ喾N類型的細胞和組織進行高效基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述包膜含有具有血凝素活性的膜蛋白。為了構(gòu)建所述逆轉(zhuǎn)錄病毒，本發(fā)明人使用了具有寬宿主范圍的副粘病毒的包膜蛋白。首先，基于表達仙臺病毒(SeV)包膜蛋白的載體，通過SeV F和/或HN蛋白使衍生自小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體假型化。具體地說，使用鼠干細胞病毒(MSCV)作為起始物構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒，它除了具有親嗜性包膜蛋白或兼嗜性包膜蛋白外，還具有SeVF和/或HN蛋白；檢測所得載體對人細胞的基因轉(zhuǎn)移效力(實施例1和2)。
當使用對人細胞無感染性的親嗜性包膜蛋白進行包裝時，使用僅被F蛋白或HN蛋白假型化的病毒無法對人細胞進行基因轉(zhuǎn)移。然而，原本對人細胞無感染性的病毒通過共表達F蛋白和HN蛋白而被假型化之后，能將基因?qū)肴思毎?

圖1中的Eco)。這一結(jié)果表明通過使用仙臺病毒的F蛋白和HN蛋白使衍生自非仙臺病毒之病毒的載體假型化，可以拓寬病毒載體感染的宿主范圍。
已發(fā)現(xiàn)當使用對人細胞具有感染性的兼嗜性包膜蛋白進行包裝時，通過僅表達HN蛋白或通過共表達F蛋白和HN蛋白使病毒假型化，能顯著改善基因轉(zhuǎn)移的效率(圖1中的Ampho)。結(jié)果表明僅用仙臺病毒HN蛋白即可使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體假型化，通過僅使用仙臺病毒HN蛋白進行假型化，或通過使用仙臺病毒F蛋白和HN蛋白進行假型化，可以改善逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因轉(zhuǎn)移效率。
本發(fā)明人還通過用HN蛋白假型化制備出兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并測定了所述載體對包括造血干細胞在內(nèi)的人骨髓細胞的基因轉(zhuǎn)移效率(實施例3)。使用被HN蛋白假型化的載體感染CD34+人骨髓細胞，使用CD34作為標記，通過流式細胞術(shù)分級分離含有導入基因的細胞。結(jié)果表明使用HN蛋白假型化能顯著改善對CD34+和CD34-細胞的基因轉(zhuǎn)移效率(圖3)。據(jù)信CD34+細胞級分含有造血干細胞。因此，基于HN蛋白的假型化也可用于對包括造血干細胞在內(nèi)的血細胞和造血細胞進行基因轉(zhuǎn)移。
然后，本發(fā)明人使用與多種其它類型的逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，有望更適于用作基因治療載體的慢病毒，構(gòu)建出被副粘病毒F蛋白和/或HN蛋白假型化的載體。所用慢病毒是猴免疫缺陷病毒(SIV)(實施例5)，與基因治療常用的人免疫缺陷病毒(HIV)相比，該病毒能提供多個優(yōu)點，包括較高水平的安全性。通過制備含有由SeV或滅活的仙臺病毒重建的包膜的病毒體，并使它們與被VSV-G蛋白假型化的SIV融合，產(chǎn)生含有仙臺病毒(SeV)包膜蛋白的SIV病毒顆粒。將病毒顆粒與人細胞保溫以評估載體感染的效率(實施例6和7)。結(jié)果表明與被VSV-G蛋白假型化的SIV相比，含有與SeV包膜融合所得之包膜的SIV表現(xiàn)出較高的感染性(圖8)。感染性的增加可歸功于仙臺病毒HN蛋白。
為了精確評價SeV包膜蛋白的貢獻，本發(fā)明人制備了FHN病毒體，F(xiàn)病毒體和HN病毒體，并通過使VSV-G-假型SIV與各種病毒體融合來制備載體。然后，根據(jù)感染實驗評估所得載體(實施例7)。與單獨的SIV相比，與FHN病毒體融合的載體顯示出顯著較高的基因轉(zhuǎn)移效率(圖10)。在與HN病毒體有關的實驗中，基因轉(zhuǎn)移的效率也得到改善。然而，與FHN病毒體不同的是，F(xiàn)病毒體融合未導致基因表達水平的任何增加。因此，可以證明HN蛋白對于增加基因轉(zhuǎn)移的效率是至關重要的。
此外，本發(fā)明人使用SeV包膜蛋白表達載體制備出慢病毒載體，該慢病毒載體在包裝階段被SeV包膜蛋白假型化(實施例8)。以較高滴度產(chǎn)生除VSV-G蛋白外還被F蛋白和HN蛋白假型化的SIV載體。通過離心可進一步富集該病毒載體。本發(fā)明人在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移試驗中檢測了該載體。
由于常規(guī)的病毒載體幾乎不能將基因轉(zhuǎn)移至氣管上皮的粘膜細胞，為了實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，必需進行預處理以除去物理屏障；例如，如果不用二氧化硫等損害細胞，用VSV-G-假型化HIV載體進行基因轉(zhuǎn)移就無法獲得足夠的高效力(L.G.Johnson等，Gene Therapy，7，568-574，2000)。本發(fā)明人檢測了被VSV-G蛋白和仙臺病毒F和HN蛋白假型化的SIV載體是否能使基因有效轉(zhuǎn)移至氣管上皮的粘膜細胞，而不會遭受上述損害(實施例9)。將上述用于表達GFP的假型化SIV載體施于小鼠鼻內(nèi)，給藥3天后觀察氣管組織切片上的GFP蛋白表達情況；在氣管上皮細胞中檢測到GFP熒光(圖11)。此外，在相同個體的鼻中隔粘膜的粘膜上皮和假復層纖毛上皮中也可檢測到GFP表達所致的熒光信號(圖12)。由此可證實本發(fā)明的病毒載體能將基因?qū)刖哂姓骋旱募毎缯衬ど掀ぜ毎?，而不會損害細胞或組織。
另外，本發(fā)明人構(gòu)建了經(jīng)修飾的HN蛋白的表達載體，所述蛋白中胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被改變。使用該載體產(chǎn)生出新的假型病毒載體。具體地說，本發(fā)明人構(gòu)建出表達以下三種蛋白質(zhì)的載體，第一種蛋白質(zhì)含有與SeVHN蛋白相連接的SIV包膜蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；第二種蛋白質(zhì)中的SIV包膜蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被HN蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所取代；第三種蛋白質(zhì)為SeVF蛋白，其中全部或部分胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已缺失或被SIV包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所取代；然后，本發(fā)明人進一步構(gòu)建出含有這些蛋白質(zhì)的假型SIV載體(實施例11和12)。已證實這些載體可以將基因轉(zhuǎn)移至人細胞，包括293T細胞和BEAS-2B細胞。由此發(fā)現(xiàn)HN假型化載體甚至在缺乏任何其它共存包膜蛋白，如VSV-G時，也能將基因轉(zhuǎn)移至人細胞。還證實了使用這些經(jīng)修飾HN蛋白的表達質(zhì)粒構(gòu)建出的基于MSCV的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能將基因轉(zhuǎn)移至人細胞(實施例13)。大規(guī)模制備含有經(jīng)修飾HN蛋白的假型SIV載體，富集所述載體，然后用這些載體感染人骨髓細胞。根據(jù)此結(jié)果，載體能將基因高效轉(zhuǎn)移至CD34+骨髓細胞(實施例14)。
另外，本發(fā)明人使用流感病毒血凝素(HA)蛋白的表達載體制備出HA-假型化慢病毒載體。所得病毒可將基因?qū)肴思毎?，并能通過離心被高度富集(實施例16)。另外，本發(fā)明人還制備出HA/HN-假型化慢病毒載體，其含有流感病毒HA蛋白和仙臺病毒經(jīng)修飾的HN蛋白，并且證實該載體能將基因轉(zhuǎn)移至人細胞(實施例17)。
如上所述，本發(fā)明人使用被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒，成功構(gòu)建出能確保進行高效基因轉(zhuǎn)移的病毒載體。另外，還證明病毒載體在來自體內(nèi)或體內(nèi)給藥中，能將基因高效轉(zhuǎn)移至包括造血干細胞在內(nèi)的血細胞和造血細胞，以及具有粘液的細胞，如粘膜上皮細胞。
更具體地，本發(fā)明涉及(1)基本上純的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其含有具有血凝素活性的膜蛋白；(2)根據(jù)(1)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自具有血凝素活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含于單鏈負鏈RNA病毒中；
(3)根據(jù)(2)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自副粘病毒的HN蛋白和/或正粘病毒的HA蛋白；(4)根據(jù)(2)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有血凝素活性的膜蛋白是具有血凝素活性的蛋白質(zhì)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的部分或全部，所述蛋白質(zhì)包含于單鏈負鏈RNA病毒中，其中已通過取代，缺失和/或添加修飾所述部分或全部；(5)根據(jù)(1)至(3)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其進一步含有副粘病毒的F蛋白；(6)根據(jù)(5)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中已通過缺失和/或添加修飾F蛋白的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；(7)根據(jù)(1)至(6)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其進一步含有得自對人細胞有感染性的病毒的包膜蛋白；(8)根據(jù)(7)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中載體含有得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性包膜蛋白；(9)根據(jù)(7)或(8)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中載體含有得自水泡性口炎病毒的VSV-G蛋白；(10)根據(jù)(1)至(9)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自腫瘤病毒；(11)根據(jù)(1)至(9)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自慢病毒；(12)根據(jù)(11)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中慢病毒衍生自猴免疫缺陷病毒；(13)根據(jù)(3)或(5)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中副粘病毒是仙臺病毒；(14)根據(jù)(1)至(13)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中載體以可表達的方式含有外源基因；(15)根據(jù)(14)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中載體被用于將基因轉(zhuǎn)移至具有粘液的細胞；(16)根據(jù)(15)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有粘液的細胞是粘膜上皮細胞；(17)根據(jù)(16)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中粘膜上皮細胞是鼻腔或肺支氣管的粘膜上皮細胞；
(18)根據(jù)(14)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中載體被用于將基因轉(zhuǎn)移至血細胞或造血細胞；(19)根據(jù)(18)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中血細胞或造血細胞是造血干細胞；(20)用于基因轉(zhuǎn)移的組合物，所述組合物含有根據(jù)(14)至(19)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；(21)根據(jù)(20)的組合物，其中組合物是藥物組合物；(22)將外源基因?qū)爰毎姆椒?，所述方法包括使細胞與根據(jù)(14)至(19)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體接觸的步驟；(23)用于產(chǎn)生根據(jù)(1)至(19)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細胞，所述細胞以可表達的方式含有編碼具有血凝素活性的蛋白質(zhì)的DNA；和(24)產(chǎn)生根據(jù)(1)至(19)中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，所述方法包括在根據(jù)(23)的包裝細胞中轉(zhuǎn)錄衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移載體DNA的步驟。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的基本上純的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本文所用術(shù)語“病毒載體”指的是能將核酸分子轉(zhuǎn)移至宿主的病毒顆粒。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”指的是含有逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架的載體。術(shù)語“具有逆轉(zhuǎn)錄病毒骨架”指的是構(gòu)成載體的病毒顆粒中的核酸分子基于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組。例如，其病毒顆粒中的核酸分子含有得自逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的包裝信號序列的載體是本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之一。
術(shù)語“被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”指的是含有一種或多種具有血凝素活性的蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，而在其天然對應物中卻不含所述蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語“基本上純的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體”指的是除了逆轉(zhuǎn)錄病毒的血凝素活性外，基本上不含有具有病毒血凝素活性的復制病毒的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本發(fā)明優(yōu)選的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是除了逆轉(zhuǎn)錄病毒以外基本上不含復制病毒的載體。術(shù)語“復制”指的是病毒在被病毒載體感染的宿主細胞中復制，并產(chǎn)生感染性的病毒顆粒。例如，在被假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的細胞中，當與感染早期時相比，代表血凝素活性(紅細胞凝集)的HA滴度在載體感染之后未顯著升高時，即可評估載體基本上不含有含具有血凝素活性的膜蛋白的復制病毒。
具有血凝素活性的膜蛋白可以是天然蛋白質(zhì)或人工蛋白質(zhì)；優(yōu)選蛋白質(zhì)具有病毒血凝素活性。據(jù)報道多種類型的病毒具有血凝素活性。紅細胞類型和檢測血凝素活性所用的最適反應溫度取決于特定的病毒類型。據(jù)報道對風疹病毒而言，反應需要鈣離子的存在。對蟲媒病毒而言，反應的最適pH落入很窄的范圍。病毒血凝素存在于腸道病毒或風疹病毒的毒粒自身，或存在于蟲媒病毒，腺病毒等的較小顆粒以及毒粒中。痘病毒血凝素作為含有脂質(zhì)的非-毒粒顆粒存在。本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒可含有這種蛋白質(zhì)。III-型腺病毒使大鼠紅細胞部分凝集，導致不完全的凝集；所述蛋白質(zhì)也可用作具有血凝素活性的膜蛋白。
通過本領域已知的方法(The society of research associates of TheNational Institute of Health，Eds.，General Experimental Virology，2nd Ed，pp.214-225，MARUZEN CO.)，可以檢測血凝素活性(紅細胞凝集；HA滴度)。紅細胞包括例如得自雞(包括小雞和成雞)，鵝，大鼠，豚鼠，恒河猴，綠猴和人的紅細胞。反應溫度可以是0℃，4℃，室溫，37℃等，具體溫度取決于蛋白質(zhì)的類型。各種病毒紅細胞凝集反應的條件例舉如下
表1

特別優(yōu)選本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒中具有血凝素活性的膜蛋白是病毒蛋白質(zhì)；具體地說，所述蛋白質(zhì)包括副粘病毒的HN蛋白；正粘病毒和流感病毒的HA蛋白；披膜病毒E1蛋白；痘苗病毒的A27L，H3L和D8L蛋白；黃病毒的M和E蛋白；冠狀病毒的E1和E2蛋白；布尼病毒的G1蛋白等。其中本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒中所含的具有血凝素活性的膜蛋白優(yōu)選為得自單鏈負鏈RNA病毒的蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選為副粘病毒的HN蛋白。
本文所用術(shù)語“單鏈負鏈RNA病毒”指的是基因組中含有單鏈負鏈(即(-)鏈)RNA的病毒。所述病毒包括副粘病毒(副粘病毒科；包括副粘病毒屬，麻疹病毒屬，風疹病毒屬，肺病毒屬等)，彈狀病毒(彈狀病毒科，包括水泡病毒屬，狂犬病病毒屬，Ephemerovirus屬等)，線狀病毒(線狀病毒科)，正粘病毒(正粘病毒科，包括流感病毒A，B和C，Thogoto-樣病毒等)，布尼病毒(布尼病毒科，包括布尼病毒屬，漢坦病毒屬，內(nèi)羅病毒屬，白蛉熱病毒屬等)，沙粒病毒(沙粒病毒科)等。
本文所用術(shù)語“副粘病毒”指的是屬于副粘病毒科的病毒。副粘病毒包括例如仙臺病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴副流感病毒(SV5)，人副流感病毒1-型，2-型和3-型等。仙臺病毒包括野生型毒株，突變毒株，實驗室毒株，人工構(gòu)建的毒株等。諸如DI顆粒等不完整病毒(J.Virol.68，8413-8417(1994))，合成的寡核苷酸等也可用作產(chǎn)生本發(fā)明疫苗的材料。HN蛋白是副粘病毒的蛋白質(zhì)。已知的編碼副粘病毒病毒蛋白質(zhì)的基因包括NP，P，M，F(xiàn)，HN和L基因。屬于副粘病毒科的病毒的“NP，P，M，F(xiàn)，HN和L基因”對應于編碼核衣殼，磷，基質(zhì)，融合，血凝素-神經(jīng)氨酸酶和大蛋白的基因。屬于副粘病毒科亞科的病毒的各個基因一般如下所示。NP基因一般也描述為“N基因”。
副粘病毒屬 NPP/C/V MF HN -L風疹病毒屬 NPP/V MF HN (SH) L麻疹病毒屬 NPP/C/V MF H -L歸類于副粘病毒科副粘病毒屬的仙臺病毒基因的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫登錄號為NP基因為M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218，P基因為M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008，M基因為D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056，F(xiàn)基因為D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131，HN基因為D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808和X56131，和L基因為D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。
如本文實施例中所述，通過制備滅活的副粘病毒，即具有副粘病毒包膜蛋白的病毒體，并將其與逆轉(zhuǎn)錄病毒融合，即可產(chǎn)生被副粘病毒包膜蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。通過在逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞中表達副粘病毒包膜蛋白的表達載體，也可產(chǎn)生載體。
本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體除了含有具有血凝素活性的膜蛋白，如副粘病毒的HN蛋白外，還可含有例如副粘病毒的F蛋白。本發(fā)明證實含有HN和F蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表現(xiàn)出高效基因轉(zhuǎn)移。含有F和HN蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還可含有副粘病毒的M蛋白。
另外，本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體另外還可含有得自其它病毒的包膜蛋白。例如，優(yōu)選的包膜蛋白包括得自對人細胞有感染性的病毒的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性包膜蛋白，水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白等。屬于皰疹病毒科的病毒的所述蛋白質(zhì)包括例如單純皰疹病毒的gB，gD，gH和gp85蛋白，EB病毒的gp350和gp220蛋白等。屬于嗜肝DNA病毒科的病毒的所述蛋白質(zhì)包括乙肝病毒的S蛋白等。
例如，本發(fā)明的載體優(yōu)選為含有逆轉(zhuǎn)錄病毒兼嗜性包膜(兼嗜性env)蛋白和HN蛋白的載體?；蛘撸?，載體可含有VSV-G蛋白，該蛋白質(zhì)是水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。據(jù)信VSV-G使用大多數(shù)動物細胞中都存在的磷脂作為受體，因此，通過使用含有VSV-G蛋白和HN蛋白的載體，能顯著增加可導入基因的細胞種類，也可提高轉(zhuǎn)移效率。實際上，含有VSV-G蛋白和HN蛋白的載體比僅含有VSV-G的載體表現(xiàn)出更高的基因轉(zhuǎn)移效率。因此，含有VSV-G蛋白和HN蛋白的載體是本發(fā)明優(yōu)選的載體。所述載體可進一步含有副粘病毒F蛋白。簡單地說，含有逆轉(zhuǎn)錄病毒兼嗜性包膜蛋白，F(xiàn)蛋白和HN蛋白的載體，以及含有VSV-G蛋白，F(xiàn)蛋白和HN蛋白的載體都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。另外，這些載體可進一步含有副粘病毒的M蛋白。具體地說，含有逆轉(zhuǎn)錄病毒兼嗜性包膜蛋白，F(xiàn)蛋白，HN蛋白和M蛋白的載體，以及含有VSV-G蛋白，F(xiàn)蛋白，HN蛋白和M蛋白的載體都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如上所述，含有副粘病毒F和HN蛋白的載體以及含有F，HN和M蛋白的載體也可以將基因高效轉(zhuǎn)移至具有粘液的細胞，含有造血干細胞的細胞級分等，而通過常規(guī)技術(shù)幾乎不能將基因轉(zhuǎn)移至這些細胞。
由于VSV-G蛋白是糖蛋白，并且在膜上形成穩(wěn)定的同三聚體，載體顆粒在純化過程中幾乎不會裂解；因此通過離心可使顆粒高度濃縮(Yang，Y等，Hum Gene TherSep，6(9)，1203-13.1995)。本發(fā)明人證實通過離心可濃縮被VSV-G和被F和HN假型化的SIV載體。
對制備假型載體所用的副粘病毒HN，F(xiàn)和M蛋白的類型沒有限制。特別優(yōu)選包括仙臺病毒在內(nèi)的呼吸道病毒的蛋白質(zhì)。仙臺病毒的HN，F(xiàn)和M蛋白包括例如得自Z毒株的那些蛋白質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄病毒兼嗜性包膜蛋白包括例如得自小鼠白血病病毒(MuLV)4070A毒株的包膜蛋白。也可以使用得自MuMLV10A1的包膜蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux，R.K等，J.Virol.705701-5705(1996))。親嗜性包膜蛋白包括例如得自Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)的包膜蛋白。水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包括例如得自印第安納血清型毒株的蛋白質(zhì)(J.Virology 39519-528(1981))。除此之外，蛋白質(zhì)可得自所需的毒株。
包括HN，F(xiàn)，M，VSV-G和逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的上述包膜蛋白可以是得自野生型病毒的完整蛋白質(zhì)，或者是自發(fā)或人工突變的蛋白質(zhì)。例如，身為結(jié)構(gòu)蛋白的HN蛋白既具有血凝素活性(為紅細胞凝集)也具有神經(jīng)氨酸酶活性。例如，前一活性的降低可增加病毒在血液中的穩(wěn)定性。例如，通過修飾后一活性可控制經(jīng)由HN蛋白的感染效率?；蛘撸ㄟ^修飾參與膜融合的F蛋白可以控制融合效率。此外，例如，對F蛋白和HN蛋白的可用作細胞表面抗原分子的抗原呈遞表位進行分析，基于分析結(jié)果，通過使用抗原呈遞能力被削弱的蛋白質(zhì)，即可制備出本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒。另外，可以使用致病性副粘病毒減毒毒株的包膜蛋白。
例如，通過使用經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)使本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體假型化，即可制備出高效基因轉(zhuǎn)移載體，其中所述蛋白質(zhì)是具有血凝素活性的病毒包膜蛋白，或是胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已通過缺失，取代和/或添加而被修飾的其它包膜蛋白。本發(fā)明涉及含有蛋白質(zhì)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中已通過取代，缺失和/或添加修飾具有血凝素活性的野生型膜蛋白的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。具體地說，例如，優(yōu)選使用胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被缺失，或在原始蛋白質(zhì)中替代或添加以另一種膜蛋白(例如包括慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的經(jīng)修飾的副粘病毒HN蛋白和/或F蛋白來產(chǎn)生高感染性的病毒載體。本發(fā)明提供了具有血凝素活性的膜蛋白，其中已通過取代，缺失和/或添加修飾野生型膜蛋白的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明還提供了編碼所述蛋白質(zhì)的核酸(DNA，RNA等)。特別地，本發(fā)明提供了經(jīng)修飾的病毒血凝素蛋白以及編碼所述蛋白質(zhì)的核酸，其中所述蛋白質(zhì)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已通過取代，缺失和/或添加而被修飾。例如，優(yōu)選含有SEQ ID NO40或41的氨基酸序列的經(jīng)修飾的HN蛋白。所述經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和編碼該蛋白質(zhì)的核酸可用于產(chǎn)生本發(fā)明的假型病毒。
具體地說，通過使用被經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒，可將外源基因高效導入包括人細胞在內(nèi)的多種細胞，所述蛋白質(zhì)為副粘病毒HN蛋白，其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被如SIV的慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所取代(例如由根據(jù)實施例11的pCAGGS-SIVct/HN編碼的蛋白質(zhì))；所述蛋白質(zhì)也可以是另一種經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，其中如慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被添加至副粘病毒HN蛋白中(例如根據(jù)實施例11的pCAGGS-SIVct+HN)?？梢匀笔N蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的任意部分；可以添加逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的任意部分；可以缺失，取代和/或添加部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
所述病毒載體另外還可含有經(jīng)修飾的副粘病毒F蛋白。例如，可以使用胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被缺失的副粘病毒F蛋白，或通過在此截短蛋白質(zhì)上添加如SIV的慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域而獲得的蛋白質(zhì)。具體地說，例如，構(gòu)建質(zhì)粒以用于表達胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域氨基酸已被缺失的F蛋白。可以缺失該結(jié)構(gòu)域的任何部分；可以缺失部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。含有截短的仙臺病毒F蛋白(Fct4)的假型病毒表現(xiàn)出顯著高效的基因轉(zhuǎn)移，所述F蛋白通過缺失其余部分僅含有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的4個氨基酸。因此，優(yōu)選使用因人工缺失而不含或僅含胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的幾個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生本發(fā)明的假型病毒。通過在這些截短的F蛋白上連接另一種病毒的包膜蛋白(例如慢病毒的包膜蛋白)的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，即可產(chǎn)生F蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被截然不同的肽所取代的蛋白質(zhì)。例如，所述蛋白質(zhì)包括連接有SIV包膜蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域5’末端前11個氨基酸(SIVct11)的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了副粘病毒F蛋白，其中已通過取代，缺失和/或添加修飾野生型蛋白質(zhì)的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明還提供了編碼所述蛋白質(zhì)的核酸。具體地說，本發(fā)明提供了F蛋白以及編碼該蛋白質(zhì)的核酸，其中所述F蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被包括慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所取代。例如，優(yōu)選含有SEQ ID NO42，43，44，45，46或47的氨基酸序列的經(jīng)修飾的F蛋白?？梢允褂眠@些經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和編碼所述蛋白質(zhì)的核酸產(chǎn)生本發(fā)明的假型病毒。
也優(yōu)選將屬于正粘病毒科的病毒的HA蛋白用作具有血凝素活性的病毒包膜蛋白。例如，通過使用流感病毒包膜蛋白的表達質(zhì)粒產(chǎn)生的假型病毒能感染包括人細胞在內(nèi)的多種哺乳動物細胞。流感病毒包膜可得自所需的分離的流感病毒毒株。在流感病毒出芽的過程中，神經(jīng)氨酸酶是造成與唾液酸的聯(lián)接斷裂的原因。因此，通過用神經(jīng)氨酸酶處理即可制備被HA假型化的感染性病毒顆粒?；蛘?，通過使用也編碼具有神經(jīng)氨酸酶活性的蛋白質(zhì)的病毒載體，可以自動斷開與唾液酸的聯(lián)接。在這種情況下，特別優(yōu)選使用具有神經(jīng)氨酸酶活性的病毒包膜蛋白，例如副粘病毒的HN蛋白。因此，本發(fā)明提供了被HA/HN蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還包括衍生自腫瘤病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。術(shù)語“腫瘤病毒”指的是屬于腫瘤病毒亞科的逆轉(zhuǎn)錄病毒(腫瘤病毒)。腫瘤病毒包括參與癌癥形成的逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如肉瘤病毒，白血病病毒，乳瘤病毒等。例如，Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)是最早開發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之一，現(xiàn)已得到很多改善并被廣泛使用。本發(fā)明優(yōu)選使用通過用具有血凝素活性的蛋白質(zhì)，如副粘病毒HN蛋白使MoMLV假型化而制備的病毒載體。另外，實施例中使用的鼠干細胞病毒(MSCV)是優(yōu)選的基因轉(zhuǎn)移載體，特別是在將基因轉(zhuǎn)移至血細胞，造血細胞，胚胎干細胞等時更是如此。
本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也包括得自慢病毒的那些載體。術(shù)語“慢病毒”指的是屬于慢病毒亞科的逆轉(zhuǎn)錄病毒(慢病毒)。慢病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)(例如HIV1或HIV2)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，貓免疫缺陷病毒(FIV)，梅迪-維斯納病毒，馬傳染性貧血病毒(EIAV)，山羊關節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)等。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可得自所需的毒株或亞型。例如，HIV-1包括每一種主要(M)亞型(包括A-J)，N和異常亞型(O)(Hu，D.J等，JAMA1996；275210-216；Zhu，T等，Nature 1998，5；391(6667)594-7；Simon，F(xiàn)等，Nat.Med.1998，4(9)1032-7)。分離的SIV毒株包括例如SIVagm，SIVcpz，SIVmac，SIVmnd，SIVsnm，SIVsyk等。
慢病毒可感染非分裂的細胞，病毒基因組可整合至宿主細胞染色體。據(jù)信由gag和vpr編碼的核轉(zhuǎn)位信號負責整合。當使用此特征，基于慢病毒構(gòu)建本發(fā)明的病毒載體時，可將基因?qū)牖罱M織中不分裂的細胞和幾乎不分裂的細胞，例如多種組織中的干細胞，使基因能被長期表達。
在任何其它慢病毒之前，人們使用人免疫缺陷病毒(HIV)構(gòu)建載體，本發(fā)明也優(yōu)選使用這種載體。已經(jīng)基于貓免疫缺陷病毒(FIV)(Poeschla，E.M等，Nature Medicine，4(3)，354-7，1998)和山羊關節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal，L等，Arch.Virol.，143(4)，681-95，1998)開發(fā)出載體?？梢允褂眠@些載體產(chǎn)生本發(fā)明的載體。
猴免疫缺陷病毒(SIV)作為源自猴的HIV-樣病毒被發(fā)現(xiàn)，它與HIV一起形成靈長類慢病毒組(E.Ido and M.Hayamizu，“Gene，Infection andPathogenicity of Simian Immunodeficiency Virus”，Protein，Nucleic acid andEnzyme，Vol.39，No.8，1994)。該組被進一步粗分為四個亞組(1)包括導致人獲得性免疫缺損綜合征的病毒HIV-1和分離自黑猩猩的SIVcpz的HIV-1亞組；(2)包括分離自Sooty Mangabey(Cercocebus atys)的SIVsmm，分離自恒河猴(Macaca mulatta)的SIVmac和對人的致病性較低的HIV-2(Jaffar,S等，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.，16(5)，327-32，1997)的HIV-2亞組；(3)以分離自非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)的SIVagm為代表的SIVagm亞組；和(4)以分離自山魈(Papio sphinx)的SIVmnd為代表的SIVmnd亞組。
目前尚無報道表明SIVagm和SIVmnd對天然宿主的致病性(Ohta，Y等，Int.J.Cancer，15，41(1)，115-22，1988；Miura，T等，J.Med.Primatol.，18(3-4)，255-9，1989；M.Hayamizu，Nippon Rinsho，47，1，1989)。先前的報道特別地談到根據(jù)感染實驗的結(jié)果，身為SIVagm之一并且為本文實施例所用的TYO-1毒株對于食蟹猴(Macaca facicularis)，恒河猴(Macaca mulatta)以及天然宿主沒有致病性(Ali，M等，Gene Therapy，1(6)，367-84，1994；Honio，S等，J.Med.Primatol.，19(1)，9-20，1990)。沒有報道表明SIVagm能感染人并在人體中發(fā)作，因此，據(jù)信SIVagm對人沒有致病性。一般說來，靈長類動物中的慢病毒具有嚴格的種族-特異性，有關得自天然宿主的SIVagm的種間交叉感染及其發(fā)作的例子的報道較少；如果有的話，一般發(fā)作頻率低，疾病進程緩慢(Novembre，F(xiàn).J等，J.Virol.，71(5)，4086-91，1997)。因此，據(jù)認為基于SIVagm，尤其是SIVagm TYO-1制備的病毒載體相對于基于HIV-1或其它慢病毒的載體而言更加安全，因此本發(fā)明優(yōu)選使用這些載體。
另外，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括衍生自泡沫病毒的載體。泡沫病毒包括例如泡沫病毒(DE4318387；WO9607749；Virology(1995)210，1，167-178；J.Virol.(1996)70，1，217-22)。特別地，在基因治療和施用重組疫苗時，衍生自泡沫病毒的本發(fā)明載體可用于將外源基因?qū)肴思毎?br> 可以修飾本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的LTR(長末端重復序列)。LTR是逆轉(zhuǎn)錄病毒-特異性序列，它存在于病毒基因組的兩端。5’LTR用作啟動子，可增強原病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄。因此，用另一個具有較強啟動子活性的啟動子取代基因轉(zhuǎn)移載體中表現(xiàn)出5’LTR啟動子活性的部分，可以導致基因轉(zhuǎn)移載體mRNA轉(zhuǎn)錄水平的增加，從而改善包裝效率，增加載體滴度。另外，例如，對慢病毒而言，已知通過病毒tat蛋白可增強5’LTR的轉(zhuǎn)錄活性，因此，用不依賴tat蛋白的啟動子取代5’LTR能夠從包裝載體中除去tat。感染細胞的病毒的胞內(nèi)RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，并形成兩端LTR之間相互連接而成的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，然后通過連接位點和病毒整合酶之間的相互作用整合至細胞染色體中。轉(zhuǎn)錄自原病毒的mRNA對應于自5’LTR中的轉(zhuǎn)錄起始位點至位于下游的3’LTR polyA序列的區(qū)域；病毒顆粒中未包裝5’LTR啟動子部分。因此，即使啟動子被另一個序列所取代，整合至靶細胞染色體的部分仍無變化。根據(jù)上述事實，5’LTR啟動子的取代可提供滴度較高，更加安全的載體。因此，基因轉(zhuǎn)移載體5’末端啟動子的取代可增加可包裝載體的滴度。
使用通過部分消除3’LTR序列而制備的，能防止全長載體mRNA在其靶細胞中轉(zhuǎn)錄的自失活載體(SIN載體)可以改善安全性。整合至靶細胞染色體的慢病毒原病毒具有與其5’末端結(jié)合的3’LTR U3部分。因此，在靶細胞的染色體中，基因轉(zhuǎn)移載體在5’末端含有U3，相應地，覆蓋整個基因轉(zhuǎn)移載體的RNA的轉(zhuǎn)錄從此處開始。如果靶細胞中有慢病毒或相關蛋白質(zhì)，基因轉(zhuǎn)移載體可能會被重新包裝并感染其它細胞。另外一種可能性是由3’LTR啟動子表達與病毒基因組的3’末端相鄰的宿主基因(Rosenberg，N.，Jolicoeur，P.，Retroviral Pathogenesis.Retroviruses.ColdSpring Harbor Laboratory Press，475-585，1997)。據(jù)認為該事件對于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體而言卻很成問題。因此，為了解決此問題，人們開發(fā)出SIN載體(Yu，S.F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(10)，3194-8，1986)。當基因轉(zhuǎn)移載體的3’LTR中缺失U3部分時，靶細胞中既不存在5’LTR啟動子，也不存在3’LTR啟動子。在這種情況下，全長病毒RNA和宿主基因都不會被轉(zhuǎn)錄，而用內(nèi)部啟動子可獲得所需基因的轉(zhuǎn)錄；這種載體可以是安全性較高的超表達載體，因此本發(fā)明優(yōu)選該載體。可以根據(jù)本領域已知的任何方法或?qū)嵤├?中描述的方法構(gòu)建SIN載體。
通過在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄含有包裝信號的基因轉(zhuǎn)移載體DNA，并在gag和pol蛋白以及包膜蛋白的存在下形成病毒顆粒，即可產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒?；蜣D(zhuǎn)移載體DNA可以是DNA載體，例如質(zhì)粒，或是整合至包裝細胞染色體的DNA。盡管優(yōu)選整合由基因轉(zhuǎn)移載體DNA編碼的包裝信號序列(只要能維持基于序列形成的結(jié)構(gòu)即可)，但需要使載體DNA包裝信號與另一個用于提供gag和pol蛋白的包裝載體之間同源的序列最小化，以降低因多種載體之間的重組而形成野生型病毒的頻率。因此，優(yōu)選使用盡可能短的序列構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移載體DNA，所述序列含有包裝所需的序列，符合包裝效率和安全性雙重標準。
對包裝信號的類型沒有限制，只要在導入包裝載體的細胞中能夠進行包裝即可；根據(jù)包裝載體的類型，可以使用得自逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒，免疫缺陷病毒等的包裝信號。
例如，對實施例中使用的衍生自SIVagm的包裝載體而言，用于從中獲得信號的病毒類型僅限于SIV，因為HIV載體不能被包裝。然而，當使用衍生自HIV的包裝載體時，衍生自SIV的基因轉(zhuǎn)移載體也是可包裝的。因此，當混合各自衍生自不同類型的慢病毒的基因轉(zhuǎn)移載體和包裝載體時，可以降低重組病毒形成的頻率。在這種情況下，優(yōu)選使用靈長類動物慢病毒的組合(例如HIV和SIV)。
在優(yōu)選的基因轉(zhuǎn)移載體DNA中，已修飾gag蛋白以使其不表達。在活體中，病毒gag蛋白可作為外源物質(zhì)被檢測到，因此它是潛在的抗原?；蛘?，該蛋白質(zhì)可影響細胞功能。為了防止gag蛋白表達，可通過添加或缺失gag起始密碼子下游的核苷酸導入移碼突變以進行修飾。也優(yōu)選缺失gag蛋白的部分編碼區(qū)。一般說來，已知病毒包裝必需gag蛋白編碼區(qū)的5’部分。因此，在基因轉(zhuǎn)移載體中，優(yōu)選在C末端缺失gag蛋白的編碼區(qū)。優(yōu)選缺失盡可能大的gag編碼區(qū)部分，只要缺失不會對包裝效率產(chǎn)生很大影響即可。另外，優(yōu)選用除ATG外的密碼子取代gag蛋白的起始密碼子(ATG)?？梢赃m當選擇取代所用的密碼子以不對包裝效率產(chǎn)生重大影響。通過將構(gòu)建的含有包裝信號的基因轉(zhuǎn)移載體DNA導入適當?shù)陌b細胞，即可產(chǎn)生含有基因轉(zhuǎn)移載體DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的病毒載體?？梢詮陌b細胞的培養(yǎng)物上清液等中回收所產(chǎn)生的病毒載體顆粒。
對包裝細胞的類型沒有限制，只要是病毒生產(chǎn)中一般常用的細胞系即可。當用于對人進行基因治療時，得自人或猴的細胞是合適的?？捎米靼b細胞的人細胞系包括例如293細胞，293T細胞，293EBNA細胞，SW480細胞，u87MG細胞，HOS細胞，C8166細胞，MT-4細胞，Molt-4細胞，HeLa細胞，HT1080細胞，TE671細胞等。猴細胞系包括例如COS1細胞，COS7細胞，CV-1細胞，BMT10細胞等。另外，也可以使用先前已建立的包裝細胞。所述包裝細胞包括例如Bosc23細胞，PE501細胞等。
對于插入載體中的外源基因的類型沒有限制，它包括例如不編碼任何蛋白質(zhì)的核酸，例如反義核酸或核酶，還包括編碼蛋白質(zhì)的核酸。
近年來，人們注意到包括造血干細胞的多種干細胞可作為基因治療的靶(Y.Hanazono，Molecular Medicine，Vol.36，No.7，1999)。如實施例中所示，本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以將基因高效轉(zhuǎn)移至得自人骨髓的CD34+細胞；近年來，人們注意到含有CD34+細胞的級分是含有造血干細胞的細胞級分。先前的報道描述道在使用含有甲基纖維素的培養(yǎng)基的集落試驗中，CD34+細胞表現(xiàn)出多能性(Kirshenbaum，A.S等，J.Immunol.，148(3)，772-7，1992)，將CD34+細胞移植到復合免疫缺損的NOD/SCID小鼠品系可導致細胞定位于小鼠骨髓并重建造血系統(tǒng)(Larochelle，A等，Nat.Med.，2(12)，1329-37，1996)。因此，可以認為干細胞-樣不成熟的細胞至少存在于CD34+細胞級分。CD34+細胞級分中的造血干細胞處于不分裂的狀態(tài)。一般說來，當使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時，對此細胞的基因轉(zhuǎn)移效率低下(Kiem，H.P等，Curr Opin.Oncol.，7(2)，107-14，1995.)，但通過使用本發(fā)明的假型載體可大大改善感染效率。特別是，通過使用慢病毒載體，如HIV或SIV載體有望進一步增加基因轉(zhuǎn)移至不分裂細胞的效率。本發(fā)明涉及將基因?qū)胙毎蛟煅毎姆椒?，其中所述方法包括使假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與血細胞或造血細胞接觸的步驟，所述載體含有具有血凝素活性的膜蛋白，本發(fā)明還涉及假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因?qū)胙毎蛟煅毎挠猛?，其中所述載體含有具有血凝素活性的膜蛋白。通過使用具有血凝素活性的蛋白質(zhì)而被假型化的本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可將基因高效轉(zhuǎn)移至血細胞和造血細胞，因此可用于以血液細胞為靶的基因治療，例如腺苷脫氨酶(ADA)缺陷(Blaese，R.M.，Pediatr.Res.，33(1 Suppl)，S49-53，1993)，血友病(Kay，M.A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(18)，9973-5，1999)和范可尼貧血癥等。可通過例如來自體內(nèi)的方法進行給藥。
通過例如使用抗多種已知表面抗原的抗體進行流式細胞術(shù)分析，或通過集落試驗，或通過評估造血系統(tǒng)已被破壞的小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)基于造血細胞移植的重建，即可評價外源基因是否導入血細胞和造血細胞。
靶為可使用本發(fā)明載體的那些造血細胞的基因治療包括例如在抗-癌化療中使用藥物抗性基因MDR1保護干細胞(Licht，T等，Gene Ther.(2000)7，4，348-58)；導入正常FANCC基因以治療范可尼貧血癥(Liu，J.M等，Hum.Gene Ther.(1999)10，14，2337-46)；導入細胞因子組合(血小板生成素，白介素6和11和Flt-3配體)以增強來自體內(nèi)的干細胞增殖(WO 9907831)；表達嵌合蛋白，如Flt-3激動劑以治療血球減少癥(WO 9846750)；導入人β珠蛋白基因以治療β地中海貧血癥(WO 9741141)；用IL-6拮抗劑和自殺基因表達的聯(lián)合療法治療IL-6-依賴型多發(fā)性骨髓瘤(德國專利號DE19704979)；導入如受體激動劑的基因，所述激動劑包括以下物質(zhì)的組合造血因子[白細胞介素(GM-CSF，G-CSF-Ser17，M-CSF，促紅細胞生成素，IL-1，IL-14，IL-2，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13和IL-15)，白血病抑制因子(LIF)，flt3/flk2配體，人生長激素，B細胞生長因子，B細胞分化因子，紅細胞分化因子(EDF)或干細胞因子(SCF)](WO 9712985)，用于干細胞培養(yǎng)和造血疾病基因治療的c-mpl受體激動劑(WO 9712978)，用于增殖人造血祖細胞的IL-6和IL-6可溶性受體融合蛋白(Nat.Biotechnol.(1997)15，2，142-45)，用于增殖造血祖細胞的IL-6超激動劑和超拮抗劑(WO9618648)，用于治療血液病的因子-X(J.Cell.Bioche.(1995)Suppl.21A，410)，用于增殖人造血祖細胞的干細胞因子，IL-6，和可溶性IL-6受體復合物(Gene Ther.(1995)2，9，694)，靶為RNA病毒的核酶以及可用于防止HIV感染和用于胞內(nèi)免疫的反義和/或假RNA(WO 9622368)。
本發(fā)明的HN蛋白-假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對含粘液的細胞具有高度感染性，所述細胞如鼻腔粘膜上皮細胞和肺支氣管粘膜上皮細胞。本發(fā)明的載體可用于將外源基因高效轉(zhuǎn)移至含粘液的細胞，而通過任何常規(guī)方法都幾乎不能將基因轉(zhuǎn)移至這些細胞。本發(fā)明涉及將基因?qū)牒骋杭毎姆椒?，所述方法包括使假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與含粘液的細胞接觸的步驟，所述載體含有具有血凝素活性的膜蛋白，本發(fā)明還涉及假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因?qū)牒骋旱募毎挠猛?，其中所述載體含有具有血凝素活性的膜蛋白。所述含粘液的細胞特別包括粘膜上皮細胞，尤其是例如鼻腔或肺支氣管的粘膜上皮細胞。
具體的用途實例包括例如通過將基因(IL-2，IFN-γ，TGF-β等)轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細胞(APC)豐富的皮膚和粘膜以導入免疫反應(WO 9505853)；通過給粘膜以口服基因進行抗輪狀病毒的免疫接種(J.Virol.(1998)72，7，5757-61)；粘膜給藥以治療自身免疫病(WO 9746253)；粘膜給藥以防止感染(WO9621356)；給女性生殖器粘膜施用基因以防止由性傳播疾病或乳頭瘤病毒感染所引起的宮頸癌(Infect.Immun.(1998)66，1，322-29)；通過經(jīng)粘膜給藥使給藥變得更加簡單和安全(Proc.Am.Assoc.Cancer Res.(1995)36，86Meet.，418)。
通過與藥物可接受載體或介質(zhì)適當混合，可將本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制備成組合物。具體地，例如，可將載體配制成與無菌水，生理鹽水，培養(yǎng)基，血清，磷酸緩沖的生理鹽水(PBS)等適當混合的組合物。組合物還可含有包括穩(wěn)定劑，抗微生物制劑等的其它組分。本發(fā)明的組合物的劑量形式可以是例如水溶液，膠囊，懸浮液，糖漿等。含有本發(fā)明的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的組合物可用作試劑或藥物。例如，本發(fā)明的組合物可用作在體外或體內(nèi)將基因轉(zhuǎn)移至多種細胞的試劑，或用作來自體內(nèi)或體內(nèi)基因治療的藥物。一般說來，通過例如本領域技術(shù)人員已知的方法可對患者進行給藥，所述方法包括動脈內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，腸內(nèi)，口或鼻內(nèi)給藥，或來自體內(nèi)地給藥。特別合適的給藥方式是對鼻腔或支氣管粘膜給藥，和對血細胞和造血細胞進行來自體內(nèi)的給藥。
本發(fā)明的病毒載體可用于對多種其它遺傳病進行基因治療。對所治療的疾病類型沒有限制。例如，所治療的疾病及其單個致病基因包括高歇氏病，β-腦苷脂酶(染色體20)；血友病，血液凝結(jié)因子VIII(X染色體)和血液凝結(jié)因子IX(X染色體)；腺苷脫氨酶缺陷，腺苷脫氨酶；苯丙酮尿癥，苯丙氨酸羥化酶(染色體12)；脊髓病性肌萎縮，肌營養(yǎng)不良蛋白(X染色體)；家族性血膽固醇過多癥，LDL受體(染色體19)；膀胱纖維變性，CFTR基因的染色體易位。據(jù)認為涉及到多個其它基因的待治療疾病包括神經(jīng)變性疾病，如早老性癡呆和帕金森氏病，局部缺血性腦病，癡呆和難以治療的感染，如AIDS。可以考慮滅活HIV轉(zhuǎn)錄因子的療法，其中在體外將本發(fā)明基于SIV的載體導入胞外取自AIDS患者的造血干細胞，以在HIV感染之前增加得自SIV的基因組的轉(zhuǎn)錄，再將轉(zhuǎn)染的細胞返還至患者體內(nèi)。另外，對慢性病而言，可能的應用實例包括抑制VEGF和FGF2基因的表達以治療局部缺血性心臟病，以及抑制細胞增殖相關基因，如細胞增殖因子(PDGF，TGF-β等)和依賴于細胞周期蛋白的激酶的表達以對動脈硬化進行基因治療。另外，對糖尿病而言，候選基因可以是BDNF基因。另外，該方法可應用于取代療法，其中將諸如癌癥抑制基因p53(其基因突變導致癌癥產(chǎn)生)的基因整合至染色體中，該方法通過在體外將多-藥物-抗性基因?qū)氲米怨撬璧脑煅杉毎?，然后通過將這些細胞返還至患者血液，而使治療超越癌癥藥物療法的局限性。至于自身免疫病，如多發(fā)性硬化，慢性風濕性關節(jié)炎，SLE和腎小球性腎炎的基因治療，也可以通過反義表達T-細胞受體，多種粘附因子(例如ICAM-1，LFA-1，VCAM-1和LFA-4等)，細胞因子和細胞因子受體(例如TNF，IL-8，IL-6和IL-1等)，細胞增殖因子(例如PDGF和TGF-β等)和激活因子(例如MMP等)來抑制表達。至于變應性疾病的基因治療，可以通過反義表達IL-4，F(xiàn)cεR-I等來抑制表達。至于與器官移植有關的基因治療，通過將非-人動物供體的組織相容性抗原改變?yōu)槿?型，可以提高異種移植成功的百分比。另外，也可考慮以下療法，即將外源基因?qū)肴薊S細胞的染色體，從而在胚胎階段形成缺陷基因以補充全身性循環(huán)酶，生長因子等的缺陷。
例如，IL-4促使輔助T淋巴細胞分化成Th2淋巴細胞。Th2淋巴細胞分泌細胞因子，例如IL-4，IL-5，IL-9和IL-13，它們介導氣喘炎癥。IL-4是導致肺粘膜分泌粘液的分子，它與呼吸障礙有關。IL-4調(diào)節(jié)VCAM-1的表達，VCAM-1是與嗜伊紅性粒細胞表面存在的VLA4分子相互作用的細胞粘附分子。相互作用使得嗜伊紅性粒細胞從血液中遷移至肺組織中的炎癥位點。由于IL-4能增加B細胞的數(shù)目并導致產(chǎn)生負責變應性反應的抗原-特異性IgE，所產(chǎn)生的抗原-特異性IgE導致肥大細胞釋放炎性介質(zhì)，例如組胺，白三烯，從而導致支氣管縮小。根據(jù)IL-4的此作用，可以使用可溶性白介素4(IL-4)受體等的表達載體來治療氣喘患者。
附圖簡述圖1的照片顯示了用被鼠干細胞病毒(MSCV)感染的293T細胞獲得的結(jié)果，所述病毒被得自仙臺病毒的F，HN，或F和HN蛋白假型化。通過使用表達EGFP的基因轉(zhuǎn)移載體(pMSCV EGFP)完成病毒包裝。上述實驗組中的標記“F”，“HN”和“F/HN”分別對應于使用通過在包裝細胞中表達仙臺病毒的F，HN，以及F和HN蛋白而產(chǎn)生的病毒感染所獲得的結(jié)果。在“VSV-G/Null”欄中，最上方的實驗組表示被VSV-G假型化的陽性對照；中間和下方的實驗組表示未被假型化的陰性對照，它不表達用于假型化的env蛋白，如F，HN和VSV-G。右邊的實驗組中以“Eco”和“Ampho”表示的標記分別對應于使用通過在包裝細胞中表達親嗜性env和兼嗜性env而制備的病毒所獲得的結(jié)果。標記“Null”表示未表達逆轉(zhuǎn)錄病毒的env。
圖2以照片顯示了具有兼嗜性env的逆轉(zhuǎn)錄病毒的HA試驗結(jié)果，所述病毒被仙臺病毒HN假型化。圖中還顯示出病毒生產(chǎn)所用的pMSCVEGFP，pCl-Ampho和pCAGGS-HN的量(圖中的MSCVAMPHOHN)。盡管用含有兼嗜性env的對照逆轉(zhuǎn)錄病毒未檢測到紅細胞凝集(圖中的Ampho-Retro)，但用被仙臺病毒HN假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒卻觀察到凝集現(xiàn)象(圖中的HN-Ampho-Retro)。
圖3是顯示試驗結(jié)果的圖，所述試驗包括用被仙臺病毒HN蛋白假型化的，含有兼嗜性env的MSCV(圖中的HN-ampho)感染人骨髓細胞，并使用CD34為標記，通過基于流式細胞術(shù)的分級分離測定感染細胞(表達GFP的細胞)的百分比。圖中所示的“ampho”指的是未被HN蛋白假型化的對照。每個柱形圖顯示的是GFP-陽性細胞對CD34陰性(CD34-)細胞或CD34陽性(CD34+)細胞的比例。
圖4圖解顯示了以下結(jié)構(gòu)(a)用作另一個構(gòu)建體的骨架的SIVagm-基因組質(zhì)粒，(b)構(gòu)建的包裝載體，(c)基因轉(zhuǎn)移載體，和(d)VSV-G-供給載體。
圖5以照片的形式顯示了SIVagm載體-介導的將β-半乳糖苷酶基因?qū)?93T細胞的結(jié)果。上方的試驗組顯示的是在載體感染293T細胞48小時之后，使用被載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞的上清液進行X-gal染色所獲得的結(jié)果。在多個細胞中檢測到β-半乳糖苷酶的表達。下方的試驗組顯示的是未被處理的對照細胞的X-gal染色。
圖6顯示了下述試驗獲得的照片，所述試驗包括將EGFP基因?qū)隚2-M相-停滯的293T細胞和用視黃酸分化的SH-SY5Y細胞，其中基因轉(zhuǎn)移由SIVagm SIN載體介導，然后使用熒光顯微鏡觀察所獲得的表達。在熒光顯微鏡下進一步證實表達。上方的試驗組，293T，放大倍數(shù)＝x100；下方的試驗組，SH-SY5Y，放大倍數(shù)＝x200。
圖7是顯示W(wǎng)estern印跡結(jié)果的照片，所述印跡使用了以大致相同的顆粒直徑排列的FHN病毒體和F病毒體。
圖8用照片顯示出觀察感染細胞(表達GFP的細胞)所得的結(jié)果。以MOI＝10在HeLa細胞的培養(yǎng)物上清液中加入與滅活的仙臺病毒(SeV)，F(xiàn)HN病毒體和F病毒體融合的SIV(分別對應于圖中的SIV-SeV融合物，SIV-FHN病毒體融合物和SIV-F病毒體融合物)。將混合物保溫10，30和180分鐘以進行感染，然后用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。感染48小時后觀察細胞。所用SIV已被VSV-G假型化。圖中的SIV指的是未與仙臺病毒包膜融合的陰性對照。
圖9以照片顯示了電泳FHN病毒體，F(xiàn)病毒體和HN病毒體樣品，接著進行銀染所得的結(jié)果。泳道1，SeV(完整的)；泳道2，用DTT-處理的SeV；泳道3，用胰蛋白酶-處理的SeV；泳道4，F(xiàn)HN病毒體；泳道5，F(xiàn)病毒體；泳道6，HN病毒體。
圖10圖示了LacZ相對活性試驗的結(jié)果。將表達LacZ的SIV載體(被VSV-G假型化)和同樣的但進一步與病毒體融合的SIV載體導入293T細胞。星號表示對SIV而言，在t-檢驗中有顯著差異(p＜0.05)。
圖11顯示了鼻內(nèi)施用100μl SIV-F/HN/M-EGFP 108T.U.，3天后的氣管冷凍切片照片。(b)中的箭頭表示氣管上皮細胞，其中可檢測到EGFP的熒光，而在(c)中顯示的未經(jīng)處理的小鼠樣品中僅觀察到低水平的背景信號。試驗組(a)顯示了連續(xù)切片的蘇木精-伊紅(H.E.)染色模式。
圖12中的照片(b)顯示了與圖11中相同的個體的鼻中隔粘膜的觀察結(jié)果。箭頭表示表現(xiàn)出EGFP熒光的假復層纖毛上皮。(a)顯示了經(jīng)H.E.染色的連續(xù)切片照片。
圖13以照片顯示出由小鼠鼻腔切片中的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體發(fā)出的EGFP熒光強度的比較。圖中顯示出被VSV-G假型化的SIV(SIV-VSV-EGFP)，含有兼嗜性env、被F，HN和M假型化的MSCV(MSCV-F/HN/M-EGFP)以及被F，HN和M假型化的VSV-G SIV(SIV-F/HN/M-EGFP)的EGFP熒光圖像。在含有F，HN和M蛋白的MSCV-F/HN/M-EGF和SIV-F/HN/M-EGFP中檢測到相對較強的信號；SIV-F/HN/M-EGFP中的信號尤其高。
圖14顯示了在由具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域取代的HN表達質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)中，SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和HN蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(標準字體)之間的邊界處的氨基酸序列(SEQ ID NO40)。
圖15顯示了在由添加有SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的HN表達質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)中，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(下劃線)和HN蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(標準字體)之間的邊界處的氨基酸序列(SEQ ID NO41)。
圖16顯示了在由缺失了胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的F表達質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)中，F(xiàn)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(斜體)和F蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(標準字體)之間的邊界處的氨基酸序列(SEQ ID NO42至44)。
圖17顯示了在由其中的F胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域取代的F表達質(zhì)粒所編碼的蛋白質(zhì)中，F(xiàn)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域(未下劃線的斜體)，F(xiàn)蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(標準字體)和SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的11個氨基酸(SIVc11)(下劃線)之間的邊界處的氨基酸序列(SEQ ID NO45至47)。
圖18顯示了經(jīng)由SeVF/HN假型SIV載體將基因轉(zhuǎn)移至293T細胞的照片。
圖19顯示了經(jīng)由SeVF/HN假型SIV載體將基因轉(zhuǎn)移至BEAS-2B細胞的照片。
圖20顯示了經(jīng)由添加有SIVc11的SeVF/HN假型SIV載體將基因轉(zhuǎn)移至293T細胞的照片。
圖21為顯示了富集的SeVF/HN假型SIV載體的照片。
圖22顯示了經(jīng)由基于MSCV的SeVF/HN假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因轉(zhuǎn)移的照片。
圖23顯示了經(jīng)由被流感病毒包膜假型化的病毒載體的基因轉(zhuǎn)移的照片。
圖24顯示了富集的被流感病毒包膜假型化的病毒載體的照片。
圖25顯示了經(jīng)由被流感病毒包膜和多種HN蛋白假型化的病毒載體的基因轉(zhuǎn)移的照片。
實施發(fā)明的最佳模式以下將使用實施例具體描述本發(fā)明；然而，本發(fā)明并不局限于此。本文提及的所有出版物都全文列入本文作為參考。
制備被仙臺病毒包膜蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過消化仙臺病毒Z毒株pSeV18+b(+)(Hasan，M.K等，1997，J.GeneralVirology 782813-2820)的全長基因組DNA，獲得F，HN和M蛋白的基因，將它們插入pCAGGS(Niwa，H等，Gene108，193-9，1991)的XhoI位點，制備出仙臺病毒F，HN和M蛋白的表達載體(分別稱為pCAGGS F，pCAGGSHN和pCAGGS M)。
在含有10％的滅活胎牛血清的D-MEM(GibcoBRL)中培養(yǎng)可用于產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的人胚腎細胞系293T細胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.90，pp.8392-8396，1993)。在塑料板(Sumitomo Bakelite)上進行培養(yǎng)。根據(jù)廠商提供的說明書，使用LIPOFECTAMINE PLUS(GibcoBRL)進行載體轉(zhuǎn)染。以1×106個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料板(Sumitomo Bakelite)，于37℃在含10％CO2氣體的CO2溫箱中保溫48小時。在轉(zhuǎn)染前30分鐘，用800μl/孔含1％牛血清白蛋白(GibcoBRL)的D-MEM(GibcoBRL)更換培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)。
所用基因轉(zhuǎn)移載體是含有EGFP基因作為報道基因的基于鼠干細胞病毒的載體(MSCV)(CLONTECH)(R.G.Hawley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9310297-10302(1996)；R.G.Hawley等，Gene Thrapy 1136-138(1994))。轉(zhuǎn)染所用DNA的量如下700ng/孔基因轉(zhuǎn)移載體和300ng/孔包裝載體(pCL-Eco，pCL-Ampho(MuMLV4070A)(皆購自IMGENEX)(Naviaux，R.K等，J.Virol.705701-5705(1996))；將這些載體與200ng/孔仙臺病毒包膜蛋白表達載體(pCAGGS F和pCAGGS HN)以及200ng/孔仙臺病毒M蛋白表達載體(pCAGGS M)聯(lián)合使用(表2)。將DNA溶解于100μl OptiMEM，然后在其中加入6μl PLUS試劑(GibcoBRL)。攪拌混合物，室溫下放置15分鐘。用100μl OptiMEM稀釋4μl LIPOFECTAMINE，然后加入至DNA和PLUS試劑(GibcoBRL)的混合物中。攪拌所得混合物，室溫下放置15分鐘。在6-孔板內(nèi)經(jīng)保溫的293T細胞中滴加通過上述方法制備的，含有DNA和LIPOFECTAMINE的復合物的溶液。緩慢攪拌之后，于37℃在含10％CO2氣體的CO2溫箱中將混合物保溫3小時。培養(yǎng)之后，在培養(yǎng)物中加入1ml/孔含有1％牛血清白蛋白(GibcoBRL)和15μg/ml胰蛋白酶(GibcoBRL)的D-MEM(GibcoBRL)。于37℃在含10％CO2氣體的CO2溫箱中將混合物保溫24小時。然后用直徑孔為0.45-μm的濾器(DISMIC-25CS濾器；ADVANTEC)過濾培養(yǎng)物上清液。將所得溶液用作載體溶液。
仙臺病毒包膜蛋白對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體假型化的作用通過上述方法制備被仙臺病毒包膜蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并評估其作用。
以1×106個細胞/孔的細胞密度將用作靶的293T細胞鋪于6-孔塑料板(Sumitomo Bakelite)，然后于37℃在含10％CO2氣體的CO2溫箱中保溫48小時。加入終濃度分別為10％和8μg/ml的的滅活胎牛血清和Polybrene(Sigma)，將所得溶液覆蓋于含有病毒載體的溶液上，從而將病毒載體導入靶細胞。導入載體48小時之后，室溫下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)將靶細胞固定20分鐘，然后用PBS(Invitrogen)清洗一次。接著，在熒光倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)，Leica)下觀察細胞以檢測靶細胞中的EGFP表達。
首先，在缺乏包裝載體時，將F蛋白表達質(zhì)粒(pCAGGS F)和HN蛋白表達質(zhì)粒(pCAGGS HN)中的任一種或兩種(這兩種蛋白質(zhì)皆為仙臺病毒包膜蛋白)與基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移載體(pMSCV EGFP)共同導入293T細胞。收集培養(yǎng)物上清液，檢測EGFP基因或EGFP蛋白是否導入作為靶細胞的293T細胞。圖1顯示了用通過以多種組合使用表2下半部分自“((1))”起的12種env制備的載體感染293T細胞所獲得的結(jié)果。如圖1中的試驗組“Null”所示，在缺乏包裝載體時，基因或蛋白質(zhì)都未被轉(zhuǎn)移，甚至當F蛋白和HN蛋白在人細胞中表達時也是如此。由此發(fā)現(xiàn)僅表達F蛋白和HN蛋白不足以產(chǎn)生能轉(zhuǎn)移基因并將EGFP蛋白導入靶細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
如圖1中的試驗組“Eco”所示，當使用對人細胞不具有感染性的親嗜性包膜蛋白進行包裝時，僅被F蛋白或HN蛋白假型化的載體不能對人細胞進行基因轉(zhuǎn)移。另一方面，被共表達的F蛋白和HN蛋白假型化的載體可將基因轉(zhuǎn)移至人細胞，而原始病毒對這些細胞無感染性。結(jié)果表明衍生自除仙臺病毒以外的病毒的載體可被仙臺病毒F蛋白和HN蛋白假型化，因此，拓寬了除仙臺病毒以外的載體所感染的宿主范圍。
如圖1中的試驗組“Ampho”所示，當使用對人細胞具有感染性的兼嗜性包膜蛋白進行包裝時，通過僅表達HN蛋白，或者通過共表達F蛋白和HN蛋白而被假型化的載體能改善基因轉(zhuǎn)移的效率。結(jié)果表明僅用仙臺病毒HN蛋白即可使衍生自除仙臺病毒以外的病毒的載體假型化，通過僅用仙臺病毒HN蛋白，或使用仙臺病毒F蛋白和HN蛋白使載體假型化，可以改善由衍生自除仙臺病毒以外的病毒的載體介導的基因轉(zhuǎn)移的效率。
另外，由于典型的仙臺病毒對含有粘液的細胞，如肺支氣管粘膜上皮細胞具有高感染性，可以使用僅被HN蛋白，或被F蛋白和HN蛋白假型化的其它載體將基因轉(zhuǎn)移至含有粘液的細胞。
產(chǎn)生HN-Ampho假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并比較假型病毒載體和兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至包括造血干細胞在內(nèi)的人骨髓細胞的效率1.培養(yǎng)293T細胞根據(jù)常規(guī)方法，在含有10％FCS和800μg/mlG418的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)293T細胞。使用10-cm板，在轉(zhuǎn)染前一天將細胞稀釋至8×106個細胞/板，然后在含有10％FCS的DMEM中培養(yǎng)。
2.轉(zhuǎn)染將5.6μg pMSCV EGFP，2.4μg pCl-Ampho(IMGENEX)和1.6μgpCAGGS-HN混合在一起。再將Lipofectamine Plus試劑盒(GIBCOBRL)中的48μl Plus溶液加入混合物中，將所得混合物靜置15分鐘。在獨立的試管中，將800μl OPTIMEM和32μl Lipofectamine溶液混合在一起?；旌螪NA混合物和Lipofectamine混合物，靜置15分鐘。除去培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物全部滴加在處于500μl含1％BSA的DMEM中的293T細胞中。于37℃在5％CO2氣氛中保溫細胞。使用5.6μg pMSCV EGFP和4.0μg pCl-Ampho進行對照轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染后3小時，用10ml含有10％FCS的Iscove改進的DMEM(IMDM)替換培養(yǎng)基。第二天，再用含有10％FCS的IMDM替換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。
3.收集病毒溶液轉(zhuǎn)染后48小時收集細胞培養(yǎng)物上清液。用0.45-μm濾器過濾上清液，然后儲存于-80℃。
4.檢測血凝素活性按照與上述相同的方法，以不同的pMSCV EGFP，pCl-Ampho和pCAGGS-HN比率制備被HN假型化的，具有兼嗜性env的逆轉(zhuǎn)錄病毒。檢測病毒的血凝素活性(紅細胞凝集活性；HA活性)。作為對照，還檢測了具有兼嗜性env的逆轉(zhuǎn)錄病毒的血凝素活性。根據(jù)常規(guī)方法進行HA活性試驗。結(jié)果表明被HN和兼嗜性env假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有HA活性，且病毒顆粒含有表現(xiàn)出血凝素活性的蛋白質(zhì)(圖2)。
5.將基因轉(zhuǎn)移至人骨髓CD34+細胞人骨髓CD34+細胞購自BIO WHITTAKER。融化之后，于37℃在5％CO2氣氛中，將細胞和第3節(jié)中收集的1×105/ml重組病毒一起，在含有50ng/mlIL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干細胞因子(GIBCO BRL)，100ng/ml Flt-3配體(Research Diagnostics，F(xiàn)landers，NJ)(以上皆為人重組蛋白質(zhì))和10％FCS的IMDM中培養(yǎng)過夜。開始培養(yǎng)之后48，51，72和75小時，用新鮮解凍的病毒溶液替換培養(yǎng)基，在細胞中加入50ng/ml IL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干細胞因子和100ng/ml Flt-3配體。在開始培養(yǎng)后120小時收集細胞。
6.通過流式細胞術(shù)進行分析用PE標記的抗-人CD34抗體(Becton Dickinson)染色收集的細胞，然后使用兩種熒光探針GFP和PE通過流式細胞術(shù)(EPICS ELITE，Coulter)進行分析。結(jié)果，在被含有野生型包膜的兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(ampho)感染的CD34-細胞和CD34+細胞中，GFP陽性細胞的比率分別僅為0.3％和3.6％。然而，在被含有假型包膜的HN-兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(HN-ampho)感染的CD34-細胞和CD34+細胞中，GFP陽性細胞的比率分別為33％和25％，由此發(fā)現(xiàn)用HN蛋白假型化能顯著增加將基因轉(zhuǎn)移至包括造血干細胞在內(nèi)的人骨髓細胞的效率(圖3)。
制備假型病毒載體的方法使用上述pMSCV EGFP或在得自Moloney鼠肉瘤病毒的LTR的控制之下表達lacZ的pLZRNL(Yee，J.-K等，Methods In Cell Biology，vol.43，pp.99-112(1994)；Xu，L等，Virology 171，331-341(1989))作為基因轉(zhuǎn)移載體，制備被多種包膜蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
于37℃，10％CO2氣氛中，在含有10％的滅活型胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培養(yǎng)293T細胞(人胎腎細胞系)。以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，然后于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。在下表2所示的組合中，在每孔的100μl Opti MEM中溶解700ng基因轉(zhuǎn)移載體(pMSCV EGFP或pLZRNL)，100ng VSV-G表達質(zhì)粒pVSV-G(衍生自印第安納血清型毒株)(Clontech)，仙臺病毒HN、F和M蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M各200ng，以及小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒包被蛋白表達質(zhì)粒pCL-Eco和pCL-Ampho各300ng(Imgenex)(Naviaux，R.K等，J.Virol.705701-5705(1996))。然后，在孔中加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀釋4μl LIPOFECTAMINE試劑(GibcoBRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將所得混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫48小時，然后收集培養(yǎng)物上清液，用0.45-μm孔徑的濾器過濾，將所得溶液用作載體溶液。
表2

(該表中“Env”欄中所示的是得自用于生產(chǎn)病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retro)，仙臺病毒(SeV)和水泡性口炎病毒(VSV)的包膜蛋白。所用基因轉(zhuǎn)移載體是pMSCV EGFP或pLZRNL，如該表中所示，它們可用于體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。在圖13的實驗中使用的是表上方的(9)所示的，使用pMSCVEGFP作為基因轉(zhuǎn)移載體制備的載體。圖1實驗中使用的是表下方(1)至(12)所示的，使用pLZRNL制備的12種載體。)[實施例5]構(gòu)建VSV-G假型慢病毒載體使用非洲綠猴免疫缺陷病毒的非致病性克隆SIVagm TYO-1毒株構(gòu)建載體。在下文中，將病毒RNA的轉(zhuǎn)錄起始位點定為+1以對核苷酸進行編號。用于插入SIVagm TYO-1的質(zhì)粒是pSA212(J.Viol.，vol.64，pp.307-312，1990)。根據(jù)所附說明書，使用Ligation High(Toyobo)進行每一個連接反應。合成所用的所有合成寡核苷酸，并用Department of Custom DNA Synthesis，Greiner Japan，在Biochemical Research Division of the Nippon Flour Mills Co.，Ltd.的反相柱或反相HPLC進行純化。合成的寡核苷酸的序列如下1F(VTRF-BglII)5’-GCAGATCTCAACCAGGAGGCGAGGCTGCATTTTGGG-3’(SEQID NO1)1R(VTRR-EcoRI)5’-GCGAATTCTACTTACTGGTGCTGTAAAGGAGCCAAA-3’(SEQID NO2)2F(RRE6964E)5’-ATCGGAATTCTTTTATTGTAAGATGGATTGGTTTTTAAAT-3’(SEQ ID NO3)2R(RRE-SA+BN)5’-CGGGATCCGCGGCCGCGGATATGGATCTGTGGAGATAGAGGAACATAT-3’(SEQ ID NO4)3F(SDFXhoSpe)5’-TCGAGACTAGTGACTTGGTGAGTAGGCTT-3’(SEQ ID NO5)3R(SDR-Sal)5’-TCGAAAGCCTACTCACCAAGTCACTACTC-3’(SEQ ID NO6)4F5’-AATTTCTCGAGCGGCCGCA-3’(SEQ ID NO7)4R5’-AATTTGCGGCCGCTCGAGA-3’(SEQ ID NO8)5-1F(5LTRU3FKpn)5’-GCGGTACCTGGATGGGATTTATTACTCCGATAGGA-3’(SEQ IDNO9)5-1R(GAGR-2Eco)5’-GCGAATTCGATAGGGCTTGAAACATGGGTACTATTTCTGC-3’(SEQ ID NO10)5-2F(RREF-EcoRI)5’-GCGAATTCCCGTTTGTGCTAGGGTTCTTAGGCTTCT-3’(SEQID NO11)
5-2R(RRESA+Rsac)5’-TCCCCGCGGATATGGATCTGTGGAGATAGAGGAACATATC-3’(SEQ ID NO12)5-3F(3LTRF BS)5’-GCGCGGCCGCGGATCCGTCGACGCACTTTTTAAAAGAAAAGGGA-3’(SEQ ID NO13)5-3R(3LTRR-SacI)5’-GCGAGCTCTAATGCAGGCAAGTTTATTAGCTTTCTA-3’(SEQID NO14)6F(CMVFEcoSac)5’-GGAATTCCCGCGGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG-3’(SEQ ID NO15)6R(EGFPRstoNB)5’-CGGGATCCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’(SEQ ID NO16)9-1F(LTRF1 CMVU3F)5’-TATATAAGCAGAGCTCGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3’(SEQ ID NO17)9-2F(LTRF2 EF1aU3F)5’-TATATAAGTGCAGTACGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3’(SEQ ID NO18)9-3F(CAGU3F)5’-TATAAAAAGCGAAGCCGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3’(SEQ ID NO19)9R(GAGR-2Eco)5’-GCGAATTCGATAGGGCTTGAAACATGGGTACTATTTCTGC-3’(SEQ ID NO20)10-1F5’-CGGGGTACCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATT-3’(SEQ ID NO21)10-1R(U3CMVR)5’-AGTTACAAGCCAGCGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCAC-3’(SEQ ID NO22)11F(LTRF LdU3FSalSC)
5’-ATGCGAGCTCGTCGACGCACTTTTTAAAAGAAAAGGGAGGACTGGATGGGATTTATTACTCCGATAGGACGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTACTAGG-3’(SEQ ID NO23)11R(3LTRR-SacI)5’-GCGAGCTCTAATGCAGGCAAGTTTATTAGCTTTCTA-3’(SEQID NO24)<通過PCR制備DNA片段>
使用PCR Supermix High Fidelity(Gibco BRL)進行所有PCR實驗。在90μl含有l(wèi)μg模板DNA的反應溶液中加入終濃度為1nmol/ml的一對合成寡核苷酸以用作引物，然后用蒸餾水將總體積調(diào)節(jié)為100μl。在GeneAmpPCR System 9600(Perkin Elmer)中進行反應。所用PCR方案如下94℃預保溫1分鐘，再于94℃變性30秒，55℃退火30秒和68℃延伸90秒，共進行10個循環(huán)，接著于68℃保溫5分鐘。反應之后，使用Wizard DNA Clean-upSystem(Promega)純化樣品，用適當限制性酶處理PCR產(chǎn)物的兩端，在1％低熔點瓊脂糖凝膠(SeaPlaque GTG瓊脂糖，F(xiàn)MC Biochem；溶解于TAE緩沖液中)分級分離。從凝膠中切下所需的DNA片段，用Wizard PCR PrepsDNA Purification System(Promega)進行純化。將純化的DNA用于連接反應。
<構(gòu)建載體>
構(gòu)建提供載體骨架結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒(圖4)。即這些質(zhì)粒是提供反式形成載體顆粒所必需的蛋白質(zhì)的“包裝載體”，提供被包裝成載體的mRNA和將所需基因傳遞至和導入靶細胞的“基因轉(zhuǎn)移載體”，和提供參與假型載體顆粒形成的包被蛋白的載體。
構(gòu)建gag，pol，tat，rev，vif或vpr/x各序列位于啟動子下游的表達質(zhì)粒以提供形成載體顆粒所需的蛋白質(zhì)。除去包裝信號Ψ的絕大部分和env以避免產(chǎn)生野生型的病毒顆粒。將SD序列插入gag上游，將RRE序列插入tat/rev第一個外顯子的下游，以在包裝載體中表達所有基因。另外，需排除整個nef序列，因為據(jù)推測該序列對載體包裝而言是不必要的(圖4b)。
將基因組兩端的LTR序列，SD，Ψ和RRE插入提供被包裝成載體的RNA的基因轉(zhuǎn)移載體。另外，用外源啟動子取代基因轉(zhuǎn)移載體中的5’LTR啟動子區(qū)域。另外，制備自失活載體(SIN載體)，其中除去了部分3’LTR序列以防止在靶細胞中轉(zhuǎn)錄全長載體mRNA；該載體含有以下插入物作為報道基因的β-半乳糖苷酶基因和用于表達報道基因的CMV啟動子(圖4c)。
在使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和HIV載體假型化時，用于提供VSV-G的載體是經(jīng)本領域檢驗的pVSV-G(圖4d)(Bums，J.C.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA908033-8037)。
下文提供了更具體的描述。
<構(gòu)建包裝載體>
使用一對引物1F和1R，以pSA212為模板，通過PCR制備對應于含有vif和tat/rev的第一個外顯子的區(qū)域(5337至5770)的DNA片段。在一個PCR引物中添加了限制性酶EcoRI的位點，因此所制備的DNA片段在其3’末端含有EcoRI位點。用BglII和EcoRI消化PCR片段，使用瓊脂糖凝膠電泳和Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)進行純化。將按上述制備的DNA片段和另一個編碼gag/pol區(qū)域的DNA片段(自XhoI位點(356)至BglII位點(5338))連接至pBluescript KS+(Stratagene)的XhoI和EcoRI位點之間。然后，通過PCR擴增Rev效應元件(RRE)和對應于含有tat/rev的第二個外顯子(6964至7993)之區(qū)域的DNA片段。通過與用于制備上述PCR片段相同的方法，使用一對引物2F和2R，以pSA212為模板，經(jīng)PCR在3’末端添加NotI位點。用EcoRI和NotI雙消化所得PCR片段，接著進行純化。將片段插入含有g(shù)ag-tat/rev的pBluescript KS+的EcoRI和NotI位點之間。
在上述含有g(shù)ag-RRE-tat/rev的pBluescript KS+的XhoI位點插入含有剪接供體(SD)位點序列的DNA片段(3F和3R)，所述片段經(jīng)合成在5’和3’末端分別具有XhoI位點和SalI位點。用XhoI和NotI消化所得質(zhì)粒。純化含有SD-gag-RRE-tat/rev的片段。通過將XhoI/NotI接頭(4F和4R)插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的EcoRI位點以制備質(zhì)粒，然后將上述SD-gag-RRE-tat/rev片段插入XhoI-NotI位點。將通過上述方法獲得的質(zhì)粒用作包裝載體pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev。
<構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移載體>
使用pSA212為模板，使用一對引物5-1F和5-1R進行PCR以擴增得自SIVagm TYO1的5’LTR區(qū)域(8547至9053+1至982；在5’和3’末端分別含有KpnI位點和EcoRI位點)；使用一對引物5-3F和5-3R進行PCR以擴增3’LTR區(qū)域(8521至9170；5’末端含有NotI和BamHI位點，3’末端含有SacI位點)；使用一對引物5-2F和5-2R進行PCR以擴增RRE序列(7380至7993；在5’和3’末端分別含有EcoRI和SacII位點)。使用一對引物6F和6R擴增得自pEGFPN2(Clontech)的CMV啟動子區(qū)域(1至600；在5’和3’末端分別含有SacII和NotI位點。在其末端消化DNA片段，純化之后，通過連接將5’LTR，RRE，CMV啟動子和3’LTR按此順序插入pBluescript KS+的KpnI-SacI位點。將得自pCMV(Clontech)，含有β-半乳糖苷酶基因的NotI片段作為報道基因插入NotI位點。用KpnI和SacI消化所得質(zhì)粒，獲得含有自5’LTR至3’LTR的區(qū)域的DNA片段。將片段插入對照載體pGL3的KpnI-SacI位點。將所得質(zhì)粒用作基因轉(zhuǎn)移載體pGL3C/5′LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3’LTR。
此外，使用一對引物6F和6R，以pEGFPC2為模板，經(jīng)PCR擴增得自pEGFPC2(Clontech)的CMV啟動子區(qū)域和編碼EGFP的區(qū)域(1至1330；在5’末端含有SacII位點，在3’末端含有NotI，BamHI位點以及翻譯終止密碼子)。分別用限制性酶KpnI和EcoRI，EcoRI和SacII，BamHI和SacI以及SacII和BamHI消化4種類型的PCR片段。純化之后，通過連接將5’LTR，RRE，CMV啟動子EGFP和3’LTR片段按此順序插入pBluescriptKS+的 KpnI和SacI(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。用KpnI和SacI消化質(zhì)粒pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR以制備含有自5’LTR至3’LTR的區(qū)域的DNA片段。將片段插入對照載體pGL3(Promega)的KpnI-SacI位點以構(gòu)建載體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。
<修飾5’LTR>
使用引物9-1F，2F，3F和9R，以pSA212為模板，經(jīng)PCR擴增含有5’LTR的TATA盒下游的gag區(qū)域(9039至9170+1至982)的片段。使用一對引物10-1F和10-1R，經(jīng)PCR擴增巨細胞病毒的CMVL啟動子(得自pCI(Promega)；核苷酸1至721)。將含有5’LTR的TATA盒下游區(qū)域的片段與含有啟動子的片段混合。使用混合物為模板，使用位于啟動子5’方向的引物(10-1F)和位于5’LTR3’方向的另一個引物(9R)，經(jīng)PCR制備含有啟動子和5’LTR的嵌合啟動子的DNA片段。將所得DNA片段插入基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMV β-gal/WT3’LTR)的KpnI-EcoRI位點以制備pGL3C/CMVLU3G2/RREc/s/CMV β-gal/WT3’LTR。類似地，也將通過上述PCR實驗獲得的DNA片段插入載體pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR 的 KpnI-EcoRI位點以制備pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR。
<制備3’LTR-修飾的SIN載體(自我失活載體)>
使用一對引物11F和11R，以pSA212為模板，經(jīng)PCR擴增含有3’LTRU3區(qū)域的5’末端27bp，3’末端15bp及其R區(qū)域的DNA片段。將該片段插入上一節(jié)中制備的含有嵌合啟動子的基因轉(zhuǎn)移載體pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/WT3’LTR的SalI-SacI位點，制備出pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3’LTRΔU3。類似地，將該片段插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR的SalI-SacI位點，制備出pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3。
<制備構(gòu)建的質(zhì)粒并證實結(jié)構(gòu)>
通過常規(guī)方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α(Toyobo)，并在瓊脂平板中保溫。使用長出的菌落作為模板，并使用能識別插入DNA片段以及對應于質(zhì)粒插入位點的部分的DNA序列的引物進行PCR。使用PLATINUM PCRSupermix(Gibco BRL)進行PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳進一步證實擴增產(chǎn)物的存在和大小，以選擇出含有所需插入物的克隆。在10ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)每個克隆，然后用QIAprep miniprep試劑盒(QIAGEN)純化質(zhì)粒。用限制性酶處理質(zhì)粒以消化插入DNA片段的兩端，并在瓊脂糖凝膠中電泳以證實DNA片段的大小。在100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)證實其質(zhì)粒含有預期大小的插入片段的克隆。用QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(QIAGEN)純化質(zhì)粒。從3個或更多個克隆中純化其中已插入PCR擴增片段的質(zhì)粒，對其進行測序，將測定的序列與pSA212的序列進行比較以選擇出不含突變的克隆。
<收集載體>
以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，于37℃在10％CO2氣氛中保溫48小時。轉(zhuǎn)染前，用800μl/孔Opti MEM更換培養(yǎng)基。將300ng上述基因轉(zhuǎn)移載體，600ng上述包裝載體和100ng VSV-G表達質(zhì)粒pVSV-G(Clontech)溶解于每孔中的100μl Opti MEM之后，在其中加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，室溫靜置15分鐘。在混合物中加入100μl含有4μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)的OptiMEM。攪拌所得混合物，室溫靜置15分鐘。將混合物滴加至上述293T細胞。緩慢攪拌經(jīng)處理的細胞，于37℃在10％CO2氣氛中保溫3小時。在每孔中加入1ml含有20％滅活的牛血清的D-MEM，于37℃在10％CO2氣氛中將培養(yǎng)板保溫12小時。用2ml/孔含有10％滅活的牛血清的D-MEM更換培養(yǎng)基之后，將培養(yǎng)板保溫24小時。然后收集培養(yǎng)物上清液，用孔徑為0.45-μm的濾器進行過濾。將經(jīng)過濾的上清液用于隨后的實驗中。
<SIVagm載體-介導的基因轉(zhuǎn)移>
以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，于37℃在10％CO2氣氛中保溫48小時。除去培養(yǎng)基，在細胞上覆蓋1ml含有載體溶液的溶液，所述載體溶液中已加入終濃度為8μg/ml的polybrane(Sigma)。于37℃在10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時已完成載體轉(zhuǎn)染。3小時后，在細胞中加入1ml培養(yǎng)基，第二天，更換培養(yǎng)基。一天后，當所用載體是β-Gal表達載體時，用β-Gal染色試劑盒(Invitrogen)使用X-gal作為底物進行染色，并在光學顯微鏡下觀察靶細胞中β-半乳糖苷酶的表達。然而，當所用載體是EGFP表達載體時，需在熒光顯微鏡下分析表達。
<載體滴定>
通過計算使用1ml載體溶液產(chǎn)生的含導入基因的細胞數(shù)目來進行載體滴定。以1×106個細胞/板的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，保溫48小時。通過與上述相同的方法，用1ml載體溶液對細胞進行感染。感染48小時后，進行X-gal染色。在放大倍數(shù)為200的光學顯微鏡下，從3個不同的視野測定一個視野中含有轉(zhuǎn)移基因的細胞數(shù)目的平均值，再乘以根據(jù)視野面積和培養(yǎng)板面積測定的系數(shù)854.865，從而測出滴度。滴度的單位被定義為轉(zhuǎn)導單位(T.U.)/ml。另外，使用SIV核心抗原EIA試劑盒(Coulter)定量載體溶液中的p27蛋白。
<評價載體>
據(jù)推測基因轉(zhuǎn)移載體中5’啟動子活性的增強可導致RNA轉(zhuǎn)錄水平的增加，并可改善包裝效率，從而增加載體滴度。因此，基于基因轉(zhuǎn)移至293T細胞的效率來評價5’啟動子已被取代的載體。通過與上述相同的方法進行基因轉(zhuǎn)移，通過X-gal染色，接著在光學顯微鏡下進行觀察，用肉眼觀察β-半乳糖苷酶的表達。
基于3’LTR啟動子已缺失的SIN基因轉(zhuǎn)移載體制備SIN SIV載體?；诤性家吧?’LTR的基因轉(zhuǎn)移載體制備SIV載體。比較這兩種載體轉(zhuǎn)移至293T細胞的效率。測定p27蛋白的量以比較參照蛋白質(zhì)的量而標準化的轉(zhuǎn)移效率。另外，通過在熒光顯微鏡下觀察進一步證實EGFP基因是否轉(zhuǎn)移至經(jīng)照射后細胞周期停滯的293T細胞，以及被視黃酸終止分化的SH-SY5Y細胞。
<基因轉(zhuǎn)移至293T細胞所獲得的結(jié)果>
使用SIVagm載體將β-半乳糖苷酶基因?qū)肴颂ツI293T細胞。使用X-gal作為底物染色含有轉(zhuǎn)移基因的細胞。如圖5所示，檢測到被染成藍色的細胞，這表明細胞中表達了β-半乳糖苷酶基因。根據(jù)實驗結(jié)果，用1ml載體溶液獲得的基因轉(zhuǎn)移效率為0.5至1×106T.U.。載體溶液中p27的量為0.5至1μg/ml，每100ngp27的轉(zhuǎn)移效率為105T.U.。
<評價SIN載體的性能>
將SIN載體的轉(zhuǎn)移效率與在相同條件下制備的含有野生型3’LTR的常規(guī)載體的轉(zhuǎn)移效率進行比較。常規(guī)載體的滴度是2.4至2.8 T.U./ml，SIN載體的滴度是2.5至2.9T.U./ml；因此，如果將常規(guī)載體的轉(zhuǎn)移效率當成100％，SIN載體的轉(zhuǎn)移效率就是105％。另外，通過測定對293T細胞的轉(zhuǎn)移效率并通過EIA檢測p27的量，可以測定轉(zhuǎn)移效率和p27的量之間的關系；SIN載體的效率是7×105T.U./100ngp27。
通過SIN載體將EGFP基因轉(zhuǎn)移至細胞周期停滯的293T細胞和終止分化的SH-SY5Y細胞。于37℃在10％CO2氣氛中，在含有10％FCS的DMEM中培養(yǎng)293T細胞。通過加入終濃度為20μg/ml的蚜腸霉素(Calbiochem-Novabiochem Intemational，Inc.)將細胞周期停滯在G1-S期(Huberman，J.A等，CellVol.23，647-648.1981；Byrnes，J.J.，Mol.Cell.Biochem.Apr，62(1)，13-24.1984)。通過用4000拉德X-射線照射2×107個細胞使細胞周期停滯在G2-M期(Kastan，M.B等，CellNov 13，71(4)587-97.1992)。在細胞停滯處理24小時之后，以1×106/孔的細胞密度將細胞鋪于包被有I型膠原的6-孔培養(yǎng)板(SUMILON)。24小時之后進行基因轉(zhuǎn)移。或者，于37℃在5％CO2氣氛中，在含有10％的滅活胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)人成神經(jīng)細胞系SH-SY5Y(Koshizawa，S.H等，Cancer Lett.Jan 1，111(1-2)，117-25.1997)，在培養(yǎng)基中加入終濃度為5μM的全反視黃酸(SIGMA)。將細胞保溫7天，然后進行基因轉(zhuǎn)移(Odelstad，L等，Brain Res.Nov 9，224(1)，69-82.1981)。
圖6上方的試驗組顯示了用熒光顯微鏡觀察到的293T細胞中的EGFP表達模式?？勺C實高效基因表達。圖6下方的試驗組顯示了SH-SY5Y中的EGFP表達。在具有似乎已分化成神經(jīng)元的軸突的細胞中發(fā)現(xiàn)EGFP表達。
經(jīng)證實本實施例中制備的SIVagm載體可介導基因高效轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)細胞。假定共轉(zhuǎn)染3種獨立的質(zhì)粒之后，在載體包裝過程中重建野生型病毒顆粒的可能性很低。另外，在天然和實驗感染中已證實用作載體基礎的SIVagm TYO-1自身不表現(xiàn)出致病性(Ohta，Y等，Int.J.Cancer41，115-22，1988；Miura，T等，J.Med.Primatol.18(3-4)，255-9.1989；Honjo，S等，J.Med.Primatol.19(1)，9-20，1990)。另外，載體是非常安全的，因為一般說來，慢病毒具有很高的物種-特異性，它對除其原始靶物種以外的動物物種僅具有微弱的致病性(Novembre，F(xiàn).J等，J.Virol.71(5)，4086-91.1997)。
在本實施例中，已從包裝載體構(gòu)建體中除去包裝信號序列，因此未將編碼病毒蛋白質(zhì)的RNA包裝成顆粒。Rev蛋白與RRE的結(jié)合導致RNA轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)并抑制剪接，從而導致病毒蛋白質(zhì)表達，并將全長RNA包裝成病毒顆粒。因此，包裝載體和基因轉(zhuǎn)移載體中插入的RRE可調(diào)節(jié)包裝載體的mRNA剪接，從而使所有基因都能表達。然后，可將基因轉(zhuǎn)移載體的mRNA轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，并包裝成載體顆粒。當從HIV-1載體中除去vif，vpr/x時有一些例子(Dull，T等，J.Virol.Nov，72(11)，8463-71.1998)，這表明蛋白質(zhì)有可能不是包裝載體顆粒和使其發(fā)揮作用所必需的。據(jù)信vpr是負責對非分裂細胞的感染性的因子(Heinzinger，N.K等，Proc.Natl.Acad.Sci.USAJul 19，91(15)，7311-5，1994)；有報道描述道HIV-1載體可將基因轉(zhuǎn)移至其中的細胞類型根據(jù)vpr的存在與否而有所不同(Kim，V.N等，J.Virol.Jan，72(1)，811-6.1998)。另據(jù)報道根據(jù)對猴的感染實驗所獲得的證據(jù)，在本文所述的實施例中從包裝載體中完全去除的nef可能是SIV-介導的免疫缺損的病原蛋白質(zhì)(von Gegerfelt，A.S等，J.Virol.73，6159-65，1999；Kestler，H.W.3d.，Naidu，Y.N.，Kodama，T.，King，N.W.，Daniel，M.D.，Li，Y.，Desrosiers，R.C.Use of infectious molecular clones of simian immunodeficiency virus forpathogenesis studies.，J.Med.Primatol.18(3-4)305-9，1989)。已從本實施例構(gòu)建的SIVagm載體中完全去除相應的序列；因此，即使形成含有得自包裝載體的病毒基因的重建病毒顆粒，也可進一步降低所述顆粒的致病性風險。
基于慢病毒的載體可將基因轉(zhuǎn)移至細胞周期停滯的培養(yǎng)細胞和神經(jīng)元，因為原始的慢病毒對非分裂細胞具有感染性(Naldini，L等，Science272263-267，1996；Sutton，R.E等，J.Virol.，73(5)，3649-60，1999)。當這種載體與原始SIV不同，已被VSV-G假型化時，載體的感染性不局限于感染CD4-和趨化因子受體-陽性細胞。已知VSV-G的受體是磷脂酰絲氨酸，它是磷脂的一種，其分子存在于多種細胞的表面(Schlegel，R等，Cell，32(2)，639-46，1983)。因此，被VSV-G假型化的SIVagm載體具有相當寬的感染范圍。據(jù)推測當基于此載體制備被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的病毒時，它們能將基因高效轉(zhuǎn)移至幾乎所有類型的動物細胞。
制備病毒體將野生型SeV(Z毒株)的毒種接種于受精卵(10-天的卵)，將卵置于35.3℃培養(yǎng)3天。然后，從卵中收集絨毛尿囊液。以4,000rpm離心15分鐘，以10,000rpm將上清液離心1小時以沉淀病毒顆粒。將沉淀物重新懸浮于BSS，覆蓋在含有蔗糖密度梯度(30％/50％)的溶液的上層，隨后以25,000rpm離心1小時。收集以30％和50％蔗糖為邊界的病毒顆粒帶，然后用大量BSS進行稀釋。然后，以9,000rpm離心樣品1小時以沉淀病毒顆粒。將所得病毒顆粒重新懸浮于BSS中，儲存于-80℃待用。
由根據(jù)參考文獻(Bagai等，1993，Biochem.Biophys.Acta 1152，15-25)所述方法獲得的仙臺病毒制備F-HN病毒體和F病毒體。具體地，用去污劑溶解仙臺病毒，然后通過離心除去不溶性的RNP。通過從已溶解F和HN蛋白和脂質(zhì)(包膜脂質(zhì))的溶液中除去去污劑以重建顆粒，從而制備出F-HN病毒體。在與實施例7中所用條件相同的條件下進行制備，不同的是離心前Triton X-100的濃度是1％(v/v)。用DTT(二硫蘇糖醇)預處理仙臺病毒以還原HN蛋白，通過與上述相同的方法用去污劑溶解仙臺病毒。通過離心除去所得的不溶性HN蛋白以及RNP。按照與上述相同的方法從溶液中除去去污劑以重建顆粒，制備出F病毒體。
所得病毒體表現(xiàn)出不均一的顆粒直徑。因此，通過以12,000rpm離心10分鐘將病毒體分成兩個含有不同大小的顆粒的級分(小病毒體平均顆粒直徑＝140nm；大病毒體平均顆粒直徑＝1.4μm)。通過SDS-PAGE評價已分級分離的病毒體。在F-HN病毒體中檢測到F蛋白和HN蛋白；在F病毒體中檢測到F蛋白。由此證實已獲得大致符合要求的病毒體(圖7)。
在37℃的條件下，以下表所述的組合，將按上述制備的病毒體或通過UV照射滅活的仙臺病毒與表達EGFP的SIV病毒融合2小時，所述SIV病毒是通過實施例7(3)所述方法制備和富集的。據(jù)報道在弱酸性pH下，VSVG和脂質(zhì)體之間的融合效率較高(Yamada，S等，1986，Biochemistry,25，3703-3708)。因此，在pH5.5或中性pH下進行融合。
表3SIV SeV條件滴度 緩沖液體積 病毒緩沖液體積(TU/ml)(μl) (μl)1 1×108BSS 50 UV滅活的SeV 1×109pfu/ml BSS 502 1×108pH5.5 50 UV滅活的SeV 1×109pfu/ml pH5.5 50檸檬酸 檸檬酸3 1×108BSS 50 FHN病毒體(小) BSS 504 1×108BSS 50 FHN病毒體(大) BSS 505 1×108BSS 50 F病毒體(小) BSS 506 1×108BSS 50 F病毒體(大) BSS 50以MOI＝10將按上述制備的混合物加入HeLa細胞的培養(yǎng)物上清液。進行對照實驗，其中SIV僅與仙臺病毒一起共感染。在此實驗中，首先，在培養(yǎng)基中加入SIV，5分鐘之后，以10倍于SIV的量加入仙臺病毒。在培養(yǎng)基中加入病毒之后，將混合物保溫10，30，或180分鐘以進行感染。然后，用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。開始感染48小時之后，進行觀察以檢測GFP熒光(圖8)。
根據(jù)所得結(jié)果，當僅用SIV感染HeLa細胞，且接觸時間為30分鐘或更短時，感染效率很低。已發(fā)現(xiàn)與僅用SIV相比，SIV和UV-照射的仙臺病毒的融合混合物傾向于更快地進行感染。與pH5.5時相比，中性pH下的感染效率較高。這可能是中性pH對SIV的影響降低的緣故。
與F-HN病毒體的融合也可增加感染，從而顯著改善感染效率。F病毒體也能有效改善感染，但與F-HN病毒體相比，改善的水平較低。當SIV僅與仙臺病毒一起共感染時，感染效率僅與只使用SIV時差不多。
這些結(jié)果表明SIV與仙臺病毒或F-HN病毒體的融合可增強SIV的感染性。另外，還說明仙臺病毒的HN蛋白對于增強感染效率起到很大作用。
制備和評價SIV-SeV融合載體(1)制備野生型SeV將野生型SeV(Z毒株)的毒種接種于受精卵(10-天的卵)，將卵置于35.3℃培養(yǎng)3天。然后，從卵中收集絨毛尿囊液。以4,000rpm離心15分鐘之后，以10,000rpm將上清液離心1小時以沉淀病毒顆粒。將沉淀物重新懸浮于BSS，覆蓋在含有蔗糖密度梯度(30％/50％)的溶液的上層，隨后以25,000rpm離心1小時。收集以30％和50％蔗糖為邊界的病毒顆粒帶，然后用大量BSS進行稀釋。然后，以9,000rpm離心樣品1小時以沉淀病毒顆粒。將所得病毒顆粒重新懸浮于BSS中，儲存于-80℃待用。
(2)由SeV跨膜蛋白重建病毒體1.FHN病毒體將0.2ml 20％(V/V)Triton X-100/BSS加入1.8ml SeV(OD540＝5，BSS)，將混合物置于室溫下靜置1小時以溶解SeV。在實施例6中，病毒體表現(xiàn)出不均一的顆粒直徑。因此，在離心前將Triton X-100的濃度調(diào)節(jié)為2％(v/v)。通過離心(100,000x g，4℃，1小時)沉淀不溶性的RNP，然后收集已溶解F和HN蛋白的上清液。分三步在上清液中加入Bio-bead SM-2(BIORAD)(0.5g兩次，室溫1小時；1g一次，4℃15小時，再加上室溫下保溫1小時)，以通過吸附除去去污劑，接著除去珠。因此，得到約1.5ml FHN病毒體。
2.F病毒體將0.2ml 30mM二硫蘇糖醇/BSS加入2ml SeV(OD540＝5，BSS)中，于37℃將混合物保溫2小時以不可逆地還原HN蛋白。用BSS稀釋之后，通過離心分離病毒顆粒，并重新懸浮于1.8ml BSS。將0.2ml 20％(V/V)TritonX-100/BSS加入病毒懸浮液中，室溫下靜置混合物1小時以溶解SeV。然后，通過與上述相同的方法除去不溶性的RNP和還原的HN蛋白。收集已溶解F蛋白的上清液。通過與制備FHN病毒體所用相同的方法獲得約1.5ml F病毒體。
3.HN病毒體將2ml 150單位/ml胰蛋白酶(Sigma)/BSS加入2ml SeV(OD540＝5，BSS)中，于37℃保溫混合物2小時以消化F蛋白。然后，將1mg/ml胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑(Sigma)/BSS加入反應混合物中以終止反應。用BSS稀釋之后，通過離心分離病毒顆粒，并重新懸浮于1.8ml BSS。通過與制備FHN病毒體所用相同的方法獲得約1.5ml F蛋白功能已經(jīng)失活的HN病毒體。
下表顯示了三種病毒體的特征。代表F和HN蛋白的功能的HA活性，溶血活性和電泳模式的數(shù)據(jù)顯示出病毒體是必需的(圖9)。
表4FHN病毒體 F病毒體 HN病毒體HA + - +溶血活性 + - -OD5400.480 0.491 0.470蛋白濃度(mg/mL) 0.960.570.78平均粒徑(nm) 143.5 168.9 133.0(3)制備SIV-LacZ使用下列三種質(zhì)粒制備含有LacZ基因的SIV(SIV-LacZ)。
·包裝載體pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev·基因轉(zhuǎn)移載體pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3LTRΔU3·VSV-G質(zhì)粒pVSV-G將150μg包裝載體，300μg基因轉(zhuǎn)移載體和50μg VSV-G質(zhì)粒溶解于75ml DMEM中。在溶液中加入2ml Plus試劑(Life Technologies Oriental，Inc.)，將所得混合物置于室溫下放15分鐘。在混合物中加入通過混合3mlLipofectAMINE試劑(Life Technologies Oriental，Inc.)和75ml DMEM而制備的懸浮液，將所得混合物置于室溫下放15分鐘以形成DNA復合物。在293T細胞(在轉(zhuǎn)染前2天，在50個含有10％FCS/DMEM的平皿中，以2.5×106個細胞/150-mm平皿的細胞密度制備的)中滴加3ml DNA復合物溶液。于37℃，在10％CO2氣氛中轉(zhuǎn)染3小時。在細胞中加入10ml 10％FCS/DMEM，然后繼續(xù)保溫。48小時之后，收集培養(yǎng)物上清液并用孔徑為0.45-μm的濾膜進行過濾。以42,500xg離心濾液1.5小時以沉淀病毒顆粒。將沉淀物集中起來，重新懸浮于15ml逆轉(zhuǎn)錄溶液(100μM dNTPs，3mM Spermine，0.3mMSpermidine，10mM MgCl2/TBS)。于37℃逆轉(zhuǎn)錄2小時。然后離心病毒(42，500xg，2小時)，將顆粒重新懸浮于500μL PBS(含有5％FCS和2μg/mLpolybrene)，獲得SIV-LacZ-富集溶液。SIV-LacZ的滴度約為5×108T.U./mL(293T細胞)。
(4)制備融合載體用BSS將SIV-LacZ稀釋至1×108T.U./mL。在此溶液中加入等體積的病毒體/BSS溶液。將混合物置于4℃放置30分鐘以進行吸附。然后，于37℃融合2小時，用冰冷的PBS將反應溶液稀釋10倍(使最終的SIV濃度為5×106T.U./mL)。立即將該SIV用于感染實驗。
(5)感染實驗以1×105個細胞/孔的細胞密度將1ml處于10％FCS/DMEM(下文稱之為培養(yǎng)基)的293T細胞加入12-孔培養(yǎng)板的每個孔中，于37℃，10％CO2氣氛中將細胞培養(yǎng)48小時。在轉(zhuǎn)染前一刻，將培養(yǎng)基減至0.5ml。以5×106T.U./ml(100μl/孔)的濃度在每孔中加入由SIV和病毒體組成的融合載體，于37℃，10％CO2氣氛中將混合物保溫10分鐘以進行感染。用培養(yǎng)基將孔洗滌2次，在每孔中加入2ml培養(yǎng)基。然后繼續(xù)保溫培養(yǎng)板。48小時之后，用PBS將細胞洗滌2次，用0.25ml細胞裂解緩沖液(PicaGene LC-β；Toyo Ink)裂解細胞。以12,000rpm將細胞裂解液離心3分鐘，適當稀釋上清液。使用Galacto-Light PlusTM(TROPIX，Inc.)測定LacZ基因的表達水平。數(shù)據(jù)被表示為每1μg得自細胞的蛋白質(zhì)的相對LacZ活性(RLU/μg蛋白質(zhì))，從一式三份的實驗測定結(jié)果中獲得以平均值±標準誤差形式表示的數(shù)據(jù)。
與僅用SIV相比，用FHN-病毒體融合物所獲得的LacZ表達水平顯著更高(p＜0.05)。與FHN-病毒體不同，F(xiàn)-病毒體不會導致基因表達水平提高。HN-病毒體也傾向于提高表達水平，但與FHN相比，提高的水平降低(圖10)。
在上述載體中，SIV VSV-G蛋白和病毒體F蛋白負責融合。使用VSV-G蛋白融合的最適pH落入弱酸性pH的范圍。另一方面，據(jù)報道F蛋白甚至在中性pH下也參與融合。在此實施例中，在中性pH下獲得融合，因此，可假定SeV的F蛋白在融合中起主要作用。據(jù)報道只要F蛋白具有功能活性，SeV和脂質(zhì)體之間的融合是可以獲得的。因此，當假設基于FHN病毒體的融合效率與基于F病毒體的融合效率相當時，僅通過FHN病毒體即可獲得的增加的基因表達水平可歸功于額外的HN的實質(zhì)性貢獻。HN病毒體在某個水平上也表現(xiàn)出作用；這表明在某種程度上發(fā)生了基于VSV-G的融合，這可導致HN蛋白整合至SIV中。
另一方面，簡單地共感染SIV和病毒體所發(fā)揮的作用與僅使用SIV差不多(圖10)。這些發(fā)現(xiàn)表明通過在37℃保溫含有這兩者的混合物即可建立融合，因此，得自SeV的膜蛋白整合至SIV包膜；HN蛋白為改善感染率作出主要貢獻。
HN假型慢病毒載體的制備及性能分析1.細胞培養(yǎng)于37℃，10％CO2氣氛中，在含有10％的滅活型胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培養(yǎng)293T細胞(人胎腎細胞系)。
2.制備載體以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，然后于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。在下表5所示的組合中，在每孔的100μl Opti MEM中溶解1200ng基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3LTRΔU3)，360ng包裝載體(pCAGGS/SIVagmgag-tat/rev)，120ng VSV-G表達質(zhì)粒pVSV-G(Clontech)，各為240ng的仙臺病毒HN，F(xiàn)和M蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M。然后，在孔中加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀釋4μlLIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將所得混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)48小時之后，收集培養(yǎng)物上清液，用0.45-μm孔徑的濾器過濾，將所得溶液用作載體溶液。
表5 (在此表中，黑色表示添加的質(zhì)粒?！癙V”表示包裝載體pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev；“GTV”，基因轉(zhuǎn)移載體pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3LTRΔU3；“VSV-G”，VSV-G表達質(zhì)粒pVSV-G；“HN”，“F”和“M”分別表示仙臺病毒HN蛋白-，F(xiàn)蛋白-和M蛋白-表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M。)3.大規(guī)模制備和富集載體以5×106個細胞/皿的細胞密度將293T細胞鋪于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)48小時。用10ml/皿含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。在上表5所示的組合中，在每皿的1.5ml Opti MEM中溶解8μg基因轉(zhuǎn)移載體，2.4μg包裝載體，0.8μgVSV-G表達質(zhì)粒pVSV-G(Clontech)，各為1.6μg的仙臺病毒HN，F(xiàn)和M蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M。然后，在每皿中加入40μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用1.5ml Opti MEM稀釋60μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每皿中加入10ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)48小時之后，收集培養(yǎng)物上清液，用0.45-μm孔徑的濾器過濾，接著于4℃，以42，490xg(TOMY SRX-201，TA21BH)離心90分鐘。將所得沉淀物溶解于1/100體積的逆轉(zhuǎn)錄溶液(TBS，10mM MgCl2，3mM SPERMINE，0.3nMSUPERMIDINE，100mM dNTPs)，于37℃將溶液保溫2小時。逆轉(zhuǎn)錄反應之后，于4℃，以42，490xg(TOMY SRX-201，TA21BH)離心反應物2小時，將所得沉淀物溶解于PBS(5％FCS，2μg/ml polybrene)中。將溶液儲存于-80℃待用。
當將三種質(zhì)粒，即包裝載體，基因轉(zhuǎn)移載體和包被蛋白表達載體共轉(zhuǎn)染至細胞時，mRNA轉(zhuǎn)錄自基因轉(zhuǎn)移載體；包裝載體提供的病毒蛋白質(zhì)對Ψ序列的識別使得RNA被包裝成載體顆粒。然后，經(jīng)由包被蛋白載體提供的包膜蛋白的假型化，最終形成載體顆粒。檢測所制備的假型病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至細胞的能力。
<載體滴定并檢測含有轉(zhuǎn)移基因的細胞>
通過上述方法在載體介導下將基因轉(zhuǎn)移至293T細胞。使用1ml載體溶液，基于已導入基因的細胞數(shù)目測定滴度。當將編碼EGFP的基因轉(zhuǎn)移載體用作報道基因時，室溫下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)將靶細胞固定20分鐘，然后用PBS清洗一次；基于在熒光倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)，Leica)下的觀察結(jié)果評價EGFP表達。
按照表5(2)至(5)中的組合，將三種質(zhì)粒，即包裝載體(pCAGGS/SIVagmgag-tat/rev)，基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，和得自仙臺病毒的包被蛋白載體(pCAGGS-F，pCAGGS-HN，和pCAGGS-M)共轉(zhuǎn)染至細胞中。在任一組合中，基因未轉(zhuǎn)移至293T細胞。然而，通過與VSV-G共表達可成功完成基因轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)表明當僅用F和HN蛋白制備時，假型SIVagm載體無法介導足夠高效的基因轉(zhuǎn)移，但通過借助于同時存在的對人細胞具有感染性的病毒包膜蛋白，如VSV-G，即可產(chǎn)生表現(xiàn)出較高感染性的假型病毒載體。
使用假型SIVagm載體將EGFP基因?qū)?93T細胞，并測定載體滴度；所制備的病毒載體的滴度是每1ml載體溶液0.5至1×105T.U.。通過離心富集的病毒載體的滴度高達1.0×107T.U./ml。這表明通過離心可富集被仙臺病毒F和HN蛋白假型化的SIVagm載體。
體內(nèi)施用假型病毒載體導入時，應當預先處理用常規(guī)病毒載體難以導入基因的氣管上皮粘膜細胞，以除去物理屏障。因此，當想通過使用VSV-G假型HIV載體的方法將基因?qū)脒@種細胞時，僅在用二氧化硫等損害細胞之后即可確保產(chǎn)生足夠明顯的效果(L.G.Johnson等，Gene Therapy7，568-574.2000)。因此，檢測被仙臺病毒F和HN蛋白假型化的SIVagm載體是否可將基因高效轉(zhuǎn)移至氣管上皮粘膜細胞而不會損害細胞。
通過吸入seboflurene麻醉6-周齡C57BL/6小鼠(雄性)，給這些小鼠鼻內(nèi)施用通過上述方法產(chǎn)生的，表達EGFP的FHN假型SIV載體(表5(11)中的EGFP表達載體)(稱之為SIV-F/HN/M-EGFP)。將組織包埋于OCT化合物中，切成冷凍切片；在熒光顯微鏡(Zeiss)下觀察切片。
鼻內(nèi)施用100μl SIV-F/HN/M-EGFP(108T.U.)，3天后觀察氣管。在氣管上皮細胞中檢測到EGFP熒光(圖11)。另外還證實了相同個體的粘膜上皮也表達基因，發(fā)現(xiàn)熒光位于鼻中隔粘膜假復層纖毛上皮中(圖12)。
由體內(nèi)施用假型病毒載體而介導的外源基因持續(xù)表達通過與上述相同的方法，使用表達EGFP的基因轉(zhuǎn)移載體產(chǎn)生含有F和HN蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒。具體地說，產(chǎn)生對應于表2(9)的假型MSCV(MSCV-F/HN/M-EGFP)和對應于表5(11)的假型SIV(SIV-F/HN/M-EGFP)。將對應于表5(1)的VSV-G假型SIV(SIV-VSV-EGFP)用作對照。給小鼠鼻內(nèi)施用表達EGFP的病毒載體，給藥90天后，制備鼻粘膜組織切片以觀察EGFP表達。
根據(jù)所得結(jié)果，所用的每一個載體都能導致EGFP表達；當施用含有F和HN蛋白的MSCV-F/HN/M-EGFP和SIV-F/HN/M-EGFP時，檢測到EGFP的強熒光信號。特別地，與其它載體的觀察結(jié)果相比，施用SIV-F/HN/M-EGFP載體能給出更強的熒光信號。因此，可以證實載體具有高效轉(zhuǎn)移基因的能力(圖13)。
構(gòu)建新的仙臺病毒包膜蛋白表達質(zhì)粒[1]構(gòu)建胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被取代的HN蛋白的表達質(zhì)粒構(gòu)建HN表達質(zhì)粒，其中HN蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被SIV包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所取代(圖14)。退火三對合成的寡核苷酸(Xho+Xma/Xma-Xho，Xma+131/135-Xma，132+Bam/Bam-136)，然后將每一對插入pBluescriptKS+(Stratagene)的XhoI-BamHI位點。將通過用XhoI和DraIII消化上述重組質(zhì)粒而獲得的含有合成寡核苷酸的純化片段，或者通過用DraIII和Bsu36I消化HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN而獲得的含有HN蛋白3’部分的純化片段插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的XhoI-Bsu36I位點。將通過上述方法獲得的質(zhì)粒用作SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已被取代的HN蛋白的表達質(zhì)粒pCAGGS-SIVct/HN。
構(gòu)建添加有SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的HN蛋白的表達質(zhì)粒構(gòu)建HN表達質(zhì)粒，其中將SIV包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域添加至HN蛋白中(圖15)。使用引物FSIVhn和RhnSIV，并使用上述的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域-被取代的HN蛋白的表達質(zhì)粒作為模板，經(jīng)PCR擴增含有SIV包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和部分HN蛋白的區(qū)域。用XhoI和AccI消化擴增的片斷之后，將三對上文[1]中制備的合成寡核苷酸插入pBluescript KS+(Stratagene)的XhoI-AccI位點，以用含有SIV包膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的片斷進行取代。
將通過用XhoI和DraIII消化重組質(zhì)粒而獲得的含有合成寡核苷酸的純化片段，或者通過用DraIII和Bsu36I消化HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN而獲得的含有HN蛋白3’部分的片段插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的XhoI-Bsu36I位點。將通過上述方法獲得的質(zhì)粒用作添加有SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的HN蛋白的表達質(zhì)粒pCAGGS-SIVct+HN。
構(gòu)建缺失胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的F蛋白表達質(zhì)粒構(gòu)建F蛋白表達質(zhì)粒，它們各自含有F蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域氨基酸5’末端的前27，14或4個殘基，因此分別缺失了15，28或38個殘基。使用引物對XhFF和NotF1650，NotF1611和NotF1581，使用將F蛋白整個區(qū)域插入pBluescript KS+(Stratagene)的SmaI位點所獲得的質(zhì)粒pBluescriptKS+/SmaI/F作為模板，經(jīng)PCR擴增分別缺失15，28和38個氨基酸的每個片斷。用XhoI和NotI消化擴增的片斷，然后各自插入通過將XhoI/NotI接頭插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的EcoRI位點而構(gòu)建出的質(zhì)粒的XhoI-NotI位點，以構(gòu)建出質(zhì)粒(15個氨基酸缺失pCAGGS-Fct27；28個氨基酸缺失pCAGGS-Fct14；38個氨基酸缺失pCAGGS-Fct4)。
構(gòu)建含有SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域-缺失型F蛋白表達質(zhì)粒通過將SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域5’末端的前11個氨基酸(SIVct11)添加至胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域-缺失的F蛋白表達質(zhì)粒以構(gòu)建質(zhì)粒(圖17)(F蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸的數(shù)目與[3]中制備的質(zhì)粒中的相應數(shù)目相同)。使用引物對XhFF和SA-F1650以及SA-F1611和SA-F1581，并使用將F蛋白整個區(qū)域插入pBluescriptKS+(Stratagene)的SmaI位點所獲得的質(zhì)粒pBluescript KS+/SmaI/F作為模板，經(jīng)PCR擴增對應于上述三種缺失了氨基酸但含有添加的SIV胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的片斷。用XhoI和NotI消化擴增的片斷，然后各自插入通過將XhoI/NotI接頭插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的EcoRI位點而構(gòu)建出的質(zhì)粒的XhoI-NotI位點，以構(gòu)建出質(zhì)粒(SIVct11添加+15個氨基酸缺失pCAGGS-Fct27/SIVct11；SIVct11添加+28個氨基酸缺失pCAGGS-Fct14/SIVct11；和SIVct11添加+38個氨基酸缺失pCAGGS-Fct4/SIVct11)。
仙臺病毒包膜-假型化慢病毒載體的制備和性能分析<細胞培養(yǎng)>
于37℃，10％CO2氣氛中，在含有10％的滅活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培養(yǎng)293T細胞(人胎腎細胞系)。
于37℃，5％CO2氣氛中，在極限必需培養(yǎng)基(MEM)(Gibco BRL)和含有10％的滅活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的RPMI1640(1∶1)的混合物中培養(yǎng)BEAS-2B細胞(得自氣管的人上皮細胞系)。
<制備載體>
以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，然后于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。在下表6所示的組合中，在每孔的100μl Opti MEM中溶解1200ng基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包裝載體(pCAGGS/SIVagmgag-tat/rev)，仙臺病毒HN，F(xiàn)蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-SIVct/HN，pCAGGS-SIVct+HN，pCAGGS-Fct4，pCAGGS-Fct14，pCAGGS-Fct27，pCAGGS-Fct4/SIVct11，pCAGGS-Fct14/SIVct11和pCAGGS-Fct27/SIVct11。然后，在孔中加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀釋4μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將所得混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)16至24小時之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM更換每個孔中的培養(yǎng)基。隨后再培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物上清液。然后用0.45-μm孔徑的濾器過濾上清液，將所得溶液用作載體溶液。
表6 <SIVagm載體-介導的基因轉(zhuǎn)移>
以1×106個細胞/孔的細胞密度將用作靶細胞的293T細胞和BEAS-2B細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，于37℃，10％CO2氣氛中保溫；將293T細胞保溫48小時，BEAS-2B細胞保溫24小時。然后從培養(yǎng)板中除去培養(yǎng)基，在細胞上覆蓋1ml通過在載體溶液中加入終濃度為8μg/ml的polybrene(Sigma)所獲得的混合物。于37℃保溫培養(yǎng)板3小時以將載體轉(zhuǎn)染至細胞；在10％CO2氣氛中保溫293T細胞，在5％CO2氣氛中保溫BEAS-2B細胞。3小時之后，在細胞中加入1ml含有20％的滅活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的培養(yǎng)基，于37℃保溫培養(yǎng)板48小時；在10％CO2氣氛中保溫293T細胞，在5％CO2氣氛中保溫BEAS-2B細胞。
<載體滴定>
使用1ml載體溶液，基于已導入基因的細胞數(shù)目測定滴度。根據(jù)上述方法，用1ml載體溶液進行感染。感染48小時之后，室溫下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)將細胞固定20分鐘，用PBS清洗一次。在放大倍數(shù)為200的熒光倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)，Leica)下，從3個不同的視野測定單個視野中含有轉(zhuǎn)移基因的細胞數(shù)目的平均值，再乘以根據(jù)視野面積和培養(yǎng)板面積來確定的系數(shù)854.865，從而測出滴度。滴度的單位被定義為轉(zhuǎn)導單位(T.U.)/ml。
<大規(guī)模制備和富集載體>
以5×106個細胞/皿的細胞密度將293T細胞鋪于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)48小時。用10ml/皿含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。在每皿的1.5ml Opti MEM中溶解8μg基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFLacZ/3LTRΔU3)，2.4μg包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，各為1.6μg的仙臺病毒HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-SIVct+HN，和F蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-Fct4。然后，在每皿中加入40μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用1.5ml Opti MEM稀釋60μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每皿中加入10ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)16至24小時之后，用20ml含有1％牛血清白蛋白和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM更換每皿中的培養(yǎng)基。隨后再培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物上清液。然后用0.45-μm孔徑的濾器過濾上清液。然后，于4℃，以16,000xg(Beckman J-25I，JA-18)離心濾液1小時。將所得沉淀物溶解于PBS(含5％FCS和2μg/ml polybrene)中。將所得溶液儲存于-80℃。
<結(jié)果>
以多種組合將基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，仙臺病毒HN蛋白表達質(zhì)粒(pCAGGS-SIVct/HN或pCAGGS-SIVct+HN)，和F蛋白表達質(zhì)粒(pCAGGS-Fct4，pCAGGS-Fct14，pCAGGS-Fct27，pCAGGS-Fct4/SIVct11，pCAGGS-Fct14/SIVct11，pCAGGS-Fct27/SIVct11)共轉(zhuǎn)染至細胞。然后，將基因成功導入293T細胞和BEAS-2B細胞(圖18，19和20)。僅用經(jīng)修飾的HN和F蛋白表達質(zhì)粒而無需共表達VSV-G，即可獲得基因轉(zhuǎn)移。由此闡明可以提供被仙臺病毒F和HN蛋白修飾的基于SIVagm的假型慢病毒載體。假型載體對293T細胞的滴度約為3.6×104T.U./ml。當聯(lián)合使用F蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-Fct4和Fct4/SIVct11時滴度最高；在兩種F蛋白表達質(zhì)粒與三種HN蛋白表達質(zhì)粒的組合中，聯(lián)合使用HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-SIVct+HN時獲得最高滴度。
檢測通過離心是否能富集表現(xiàn)出最高滴度的載體，所述載體是通過共轉(zhuǎn)染F蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-Fct4和HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-SIVct+HN而制備的。結(jié)果證實通過離心可以高水平富集F-HN假型載體(圖21)。
<檢測的寡核苷酸>
經(jīng)由Department of Custom DNA Synthesis，Greiner Japan，在Biochemical Research Division of the Nippon Flour Mills Co.，Ltd.內(nèi)合成所用的除SA-F1611和SA-F1581外的合成寡核苷酸，并用反相柱或PAGE進行純化。在Sawady Technology Co.合成SA-F1611和SA-F1581，經(jīng)HPLC純化之后再使用。
Xho+Xma5’-TCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGACGCCAACGACCC-3’(SEQ ID NO25)Xma-Xho5’-CCGGGGGTCGTTGGCGTCTGGTCCTTCACCTCCGTCGTTGCTCCTGATTTTTAACTCAGACCACATC-3’(SEQ ID NO26)Xma+1315’-CCGGGGAAAGGGGGTGCAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGA-3’(SEQ ID NO27)135-Xma5’-ACCCTCTGTCCATAAACAGGTAGAGATGGCTGGATATGGATGTGTTGCACCCCCTTTCC-3’(SEQ ID NO28)132+Bam5’-GGGTTAGGTGGTTGCTGATTCTCTCATTCACCCAGTGGG-3’(SEQ ID NO29)Bam-1365′-GATCCCCACTGGGTGAATGAGAGAATCAGCAACCACCTA-3’(SEQ ID NO30)FSIVhn5’-GAGACTCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGG-3’(SEQ IDNO31)RhnSIV5’-AGAGGTAGACCAGTACGAGTCACGTTTGCCCCTATCACCATCCCTAACCCTCTGTCCATAAAC-3’(SEQ ID NO32)
XhFF5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’(SEQID NO33)NotF16505’-AIAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3’(SEQ ID NO34)NotF16115’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGTCATCTGGATTACCCAT-3’(SEQ ID NO35)NotF15815′-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTAIAAAGCAC-3’(SEQ ID NO36)SA-F16505’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTTCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3’(SEQ ID NO37)SA-F16115’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTGGAGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTACGGTCATCTGGATTACCCAT-3’(SEQ ID NO38)SA-F15815’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTCCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’(SEQ ID NO39)[實施例13]仙臺病毒包膜-假型化逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備和性能分析<細胞培養(yǎng)>
于37℃，10％CO2氣氛中，在含有10％的滅活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培養(yǎng)293T細胞(人胎腎細胞系)。
<制備載體>
以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，然后于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。在下表7所示的組合中，在每孔的100μl Opti MEM(Gibco BRL)中溶解700ng基因轉(zhuǎn)移載體pMSCVEGFP，300ng親嗜性包膜和gag-pol表達質(zhì)粒(IMGENEX)，200ng仙臺病毒F蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-Fct4，各為200ng的HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN和pCAGGS-SIVct+HN。然后，在孔中加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用100μlOpti MEM稀釋4μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將所得混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)16至24小時之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM更換每個孔中的培養(yǎng)基。隨后再培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物上清液。然后用0.45-μm孔徑的濾器過濾上清液，將所得溶液用作載體溶液。
表7 <SIVagm載體-介導的基因轉(zhuǎn)移>
以1×105個細胞/孔的細胞密度將用作靶細胞的293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。然后從培養(yǎng)板中除去培養(yǎng)基，在細胞上覆蓋1ml通過在載體溶液中加入終濃度為8μg/ml的polybrene(Sigma)所獲得的混合物。于37℃，10％CO2氣氛中保溫培養(yǎng)板3小時以將載體轉(zhuǎn)染至細胞。3小時之后，在細胞中加入1ml含有20％的滅活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的培養(yǎng)基，于37℃，10％CO2氣氛中保溫培養(yǎng)板48小時。
<載體滴定>
使用1ml載體溶液，基于已導入基因的細胞數(shù)目測定滴度。根據(jù)上述方法，用1ml載體溶液進行感染。感染48小時之后，室溫下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)將細胞固定20分鐘，用PBS清洗一次。在放大倍數(shù)為200的熒光倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)，Leica)下，從3個不同的視野測定單個視野中含有轉(zhuǎn)移基因的細胞數(shù)目的平均值，再乘以根據(jù)視野面積和培養(yǎng)板面積而確定的系數(shù)854.865，從而測出滴度。滴度的單位被定義為轉(zhuǎn)導單位(T.U.)/ml。
<結(jié)果>
將基因轉(zhuǎn)移載體pMSCV EGFP，親嗜性包膜和gag-pol表達質(zhì)粒，仙臺病毒F蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-Fct4，HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN和pCAGGS-SIVct+HN聯(lián)合共轉(zhuǎn)染至細胞。成功獲得對293T細胞的基因轉(zhuǎn)移(圖22)。當使用經(jīng)修飾的HN和F蛋白表達質(zhì)粒時，可將基因成功導入含親嗜性包膜的病毒所不能感染的人293T細胞。由此闡明可以提供被仙臺病毒F和HN蛋白修飾的基于MSCV的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。另外，聯(lián)合使用F蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-Fct4和三種HN蛋白表達質(zhì)粒；當聯(lián)合使用HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-SIVct+HN時，假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的滴度最高(1.1×105T.U./ml)。
產(chǎn)生VSV-G/HN假型慢病毒載體并與VSV-G假型慢病毒載體比較對包括造血干細胞的人骨髓細胞的基因轉(zhuǎn)移效率<細胞培養(yǎng)>
于37℃，10％CO2氣氛中，在含有10％的滅活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培養(yǎng)293T細胞(人胎腎細胞系)。
<載體滴定>
使用1ml載體溶液，基于已導入基因的細胞數(shù)目測定滴度。根據(jù)上述方法，用1ml載體溶液進行感染。感染48小時之后，室溫下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)將細胞固定20分鐘，用PBS清洗一次。在放大倍數(shù)為200的熒光倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)，Leica)下，從3個不同的視野測定單個視野中含有轉(zhuǎn)移基因的細胞數(shù)目的平均值，再乘以根據(jù)視野面積和培養(yǎng)板面積確定的系數(shù)854.865，從而測出滴度。滴度的單位被定義為轉(zhuǎn)導單位(T.U.)/ml。
<大規(guī)模制備和富集載體>
以5×106個細胞/皿的細胞密度將293T細胞鋪于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)48小時。用10ml/皿DMEM更換培養(yǎng)基。將細胞用于轉(zhuǎn)染。按照下表8所示的組合，在每皿1.5ml的Opti MEM(GibcoBRL)中溶解8μg基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，2.4μg包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，各為1.6μg的VSV-G表達質(zhì)粒pVSV-G以及仙臺病毒HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN和pCAGGS-SIVct+HN。然后，在每皿中加入40μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用1.5ml Opti MEM稀釋60μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每皿中加入20ml含有20％的滅活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)16至24小時之后，用20ml含有的滅活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的DMEM更換每皿中的培養(yǎng)基。隨后再培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物上清液。然后用0.45-□m孔徑的濾器過濾上清液。然后，于4℃，以42,390xg(TOMY SRX-201，TA21BH)離心濾液90分鐘。將所得沉淀物溶解于1/100體積的逆轉(zhuǎn)錄反應溶液(TBS，10mM MgCl2，3mM SPERMINE，0.3nM SUPERMIDINE，100mM dNTPs)。于37℃將溶液保溫2小時。逆轉(zhuǎn)錄之后，于4℃，以42,490xg(TOMY SRX-201，TA21BH)離心反應物2小時，將所得沉淀物溶解于PBS(含有5％FCS和2μg/ml polybrene)中。將所得溶液儲存于-80℃待用。
表8 <將基因轉(zhuǎn)移至人骨髓CD34+細胞>
人骨髓CD34+細胞購自BIO WHITTAKER。解凍之后，于37℃，5％CO2氣氛中，在含有50ng/ml IL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干細胞因子(GIBCOBRL)，100ng/ml Flt-3配體(Research Diagnostics，F(xiàn)landers，NJ)(皆為人重組體)和10％FCS的Iscove改進的DMEM(IMDM)中將細胞培養(yǎng)48小時。保溫之后，除去培養(yǎng)基，將2×106或107T.U./ml的病毒溶液加入2×105個細胞。然后在細胞中加入50ng/ml IL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干細胞因子(GIBCO BRL)和100ng/ml Flt-3配體。保溫96小時之后收集細胞。
<流式細胞術(shù)分析>
用經(jīng)PE標記的抗-人CD34抗體(Becton Dickinson)染色收集的細胞，然后使用兩種對應于GFP和PE的熒光信號，通過流式細胞術(shù)(EPICS ELITE，Coulter)進行分析。
<結(jié)果>
當以m.o.i.＝10使用VSV-G假型載體時，CD34+細胞中GFP陽性細胞的比率為9.7％；使用假型載體VSV-G和HN，SIVct/HN以及SIVct+HN時，CD34+細胞中GFP陽性細胞的比率分別為43.9，25.2和19.7％(表9)。另一方面，以m.o.i.＝50使用VSV-G假型載體時，CD34+細胞中GFP陽性細胞的比率為51.4％；使用VSV-G和HN，SIVct/HN以及SIVct+HN假型載體時，CD34+細胞中GFP陽性細胞的比率分別為43.0，70.8和68.4％(表10)。
基于上述發(fā)現(xiàn)，進一步證實了通過共表達VSV-G蛋白和HN蛋白而制備的假型載體能確保增加對包括造血干細胞在內(nèi)的人骨髓細胞的基因轉(zhuǎn)移效率。
表9m.o.i.＝10時的GFP陽性細胞群體(％) 表10m.o.i.＝50時的GFP陽性細胞群體(％) [實施例15]構(gòu)建流感病毒包膜蛋白表達質(zhì)粒構(gòu)建編碼得自流感病毒(H1N1)的血凝素蛋白(HA)的表達質(zhì)粒。使用引物HAFNot和HARNot，以質(zhì)粒pDREF HisD(Microbiol.Immunol.，44(8)，677-685，2000)為模板，經(jīng)PCR擴增片斷。擴增的片斷用NotI消化，然后插入通過在pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)中添加XhoI-NotI位點而制備的載體的NotI位點。將通過上述方法獲得的質(zhì)粒用作HA蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HA。
經(jīng)由Department of Custom DNA Synthesis，Greiner Japan，在Biochemical Research Division of the Nippon Flour Mills Co.，Ltd.內(nèi)合成所用的合成寡核苷酸，并用反相柱或PAGE進行純化。
HAFNot5’-GAGAGCGGCCGCCCAAAATGAAGGCAAAACTACTG-3’(SEQ ID NO48)HARNot5’-GATGCGGCCGCTCAGATGCATATTCTGCAC-3’(SEQID NO49)[實施例16]流感病毒包膜假型慢病毒載體的制備和性能分析<細胞培養(yǎng)>
于37℃，10％CO2氣氛中，在含有10％的滅活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培養(yǎng)293T細胞(人胎腎細胞系)。
<制備載體>
以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，然后于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。在每孔的100μl OptiMEM(Gibco BRL)中溶解1200ng基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和240ng HA蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HA。然后，在孔中加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀釋4μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將所得混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)16至24小時之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白，5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和50單位神經(jīng)氨酸酶(Roche)的DMEM更換每個孔中的培養(yǎng)基。隨后再培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物上清液。然后用0.45-μm孔徑的濾器過濾上清液，將所得溶液用作載體溶液。
<SIVagm載體-介導的基因轉(zhuǎn)移>
以1×106個細胞/孔的細胞密度將用作靶細胞的293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。然后從培養(yǎng)板中除去培養(yǎng)基，在細胞上覆蓋1ml通過在載體溶液中加入終濃度為8μg/ml的polybrene(Sigma)所獲得的混合物。于37℃，10％CO2氣氛中保溫培養(yǎng)板3小時以將載體轉(zhuǎn)染至細胞。3小時之后，在細胞中加入1ml含有20％的滅活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的培養(yǎng)基，于37℃，10％CO2氣氛中保溫細胞48小時。
<載體滴定>
使用1ml載體溶液，基于已導入基因的細胞數(shù)目測定滴度。根據(jù)上述方法，用1ml載體溶液進行感染。感染48小時之后，室溫下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)將細胞固定20分鐘，用PBS清洗一次。在放大倍數(shù)為200的熒光倒置顯微鏡(DMIRB(SLR)，Leica)下，從3個不同的視野測定單個視野中含有轉(zhuǎn)移基因的細胞數(shù)目的平均值，再乘以根據(jù)視野面積和培養(yǎng)板面積確定的系數(shù)854.865，從而測出滴度。滴度的單位被定義為轉(zhuǎn)導單位(T.U.)/ml。
<大規(guī)模制備和富集載體>
以5×106個細胞/皿的細胞密度將293T細胞鋪于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)48小時。用10ml/皿含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。將細胞用于轉(zhuǎn)染。在每皿1.5ml的Opti MEM(Gibco BRL)中溶解8μg基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFLacZ/3LTRΔU3)，2.4μg包裝載體(pCAGGS/SITVagm gag-tat/rev)和1.6μg HA蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HA。然后，在每皿中加入40μl PLUS試劑(GibcoBRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用1.5ml OptiMEM稀釋60μl LIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每皿中加入10ml含有1％牛血清白蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)16至24小時之后，用20ml含有1％牛血清白蛋白，5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和500單位神經(jīng)氨酸酶(Roche)的DMEM更換每皿中的培養(yǎng)基。隨后再培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物上清液。然后用0.45-μm孔徑的濾器過濾上清液。然后，于4℃，以16,000xg(Beckman J-25I，JA-18)離心濾液90分鐘。將沉淀物溶解于PBS(含有5％FCS和2μg/ml polybrene)中。將所得溶液儲存于-80℃待用。
<結(jié)果>
以多種組合將基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和HA蛋白表達質(zhì)粒(pCAGGS-HA)共轉(zhuǎn)染至細胞。然后，將基因成功導入293T細胞(圖23)。無需共表達VSV-G即可獲得基因轉(zhuǎn)移。由此闡明可以使用流感病毒HA蛋白提供基于SIVagm的假型慢病毒載體。假型載體對293T細胞的滴度為1.3×104T.U./ml。另外，還檢測了通過離心是否能富集通過上述方法制備的載體。結(jié)果證實通過離心可以高水平富集HA假型載體(圖24)。
被流感病毒和仙臺病毒包膜假型化的慢病毒載體的制備和性能分析<細胞培養(yǎng)>
于37℃，10％CO2氣氛中，在含有10％的滅活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改進型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培養(yǎng)293T細胞(人胎腎細胞系)。
<制備載體>
以5×105個細胞/孔的細胞密度將293T細胞鋪于6-孔塑料培養(yǎng)板，然后于37℃，10％CO2氣氛中保溫48小時。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更換培養(yǎng)基。然后將細胞用于轉(zhuǎn)染。按照下表11所示的組合，在每孔的100μlOpti MEM(Gibco BRL)中溶解1200ng基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和各為240ng的仙臺病毒HN蛋白表達質(zhì)粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN，pCAGGS-SIVct+HN和HA蛋白表達質(zhì)粒。然后，在孔中加入6μl PLUS試劑(Gibco BRL)。攪拌混合物，然后在室溫下靜置15分鐘。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀釋4μlLIPOFECTAMINE試劑(Gibco BRL)所獲得的溶液。攪拌混合溶液，然后在室溫下再靜置15分鐘。邊緩慢攪拌邊將所得混合物滴加至上文制備的293T細胞中。然后于37℃，10％CO2氣氛中將細胞保溫3小時。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2氣氛中培養(yǎng)16至24小時之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白，5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和50單位神經(jīng)氨酸酶(Roche)的DMEM更換每個孔中的培養(yǎng)基。隨后再培養(yǎng)24小時，收集培養(yǎng)物上清液。然后用0.45-μm孔徑的濾器過濾上清液；將所得溶液用作載體溶液。
表11 <結(jié)果>
以多種組合將基因轉(zhuǎn)移載體(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，包裝載體(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，HA蛋白表達質(zhì)粒(pCAGGS-HA)，和仙臺病毒HN蛋白表達質(zhì)粒(pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN，pCAGGS-SIVct+HN)共轉(zhuǎn)染至細胞。然后將基因成功導入293T細胞(圖25)。神經(jīng)氨酸酶負責在流感病毒出芽過程中裂解與唾液酸的連接，因此制備HA假型載體需要神經(jīng)氨酸酶。因此，檢測多種HN表達質(zhì)粒是否具有仙臺病毒HN蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性；同時存在HN蛋白導致產(chǎn)生所需的載體。結(jié)果表明可以提供新的HA/HN假型慢病毒載體。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供了被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。優(yōu)選將本發(fā)明的載體用于基因治療等。特別是，所述載體可用于對導氣管進行體內(nèi)給藥，也可用于對靶造血干細胞進行回體(ex vivo)給藥。
序列表<110>株式會社載體研究所(DNAVEC Research INC.)<120>含有血凝素活性膜蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體<130>D3-107PCT<140><141><150>JP 2000-169090<151>2000-06-01<160>49<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>1gcagatctca accaggaggc gaggctgcat tttggg 36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>2gcgaattcta cttactggtg ctgtaaagga gccaaa 36<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>3atcggaattc ttttattgta agatggattg gtttttaaat 40<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>4cgggatccgc ggccgcggat atggatctgt ggagatagag gaacatat48<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>5tcgagactag tgacttggtg agtaggctt 29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>6tcgaaagcct actcaccaag tcactactc 29<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>7aatttctcga gcggccgca 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>8aatttgcggc cgctcgaga 19<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>9gcggtacctg gatgggattt attactccga tagga35<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>10gcgaattcga tagggcttga aacatgggta ctatttctgc 40<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>11gcgaattccc gtttgtgcta gggttcttag gcttct 36<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>12tccccgcgga tatggatctg tggagataga ggaacatatc 40<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>13gcgcggccgc ggatccgtcg acgcactttt taaaagaaaa ggga 44<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>14gcgagctcta atgcaggcaa gtttattagc tttcta 36<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>15ggaattcccg cggtagttat taatagtaat caattacggg 40<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>16cgggatccgc ggccgcttac ttgtacagct cgtccatgcc 40<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>17tatataagca gagctcgctg gcttgtaact cagtctctta 40<210>18<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>18tatataagtg cagtacgctg gcttgtaact cagtctctta 40<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>19tataaaaagc gaagccgctg gcttgtaact cagtctctta 40<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>20gcgaattcga tagggcttga aacatgggta ctatttctgc 40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>21cggggtacct caatattggc cattagccat attattcatt 40<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>22agttacaagc cagcgagctc tgcttatata gacctcccac 40<210>23<211>99<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>23atgcgagctc gtcgacgcac tttttaaaag aaaagggagg actggatggg atttattact 60ccgataggac gctggcttgt aactcagtct cttactagg99<210>24<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>24gcgagctcta atgcaggcaa gtttattagc tttcta 36<210>25<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>25tcgagatgtg gtctgagtta aaaatcagga gcaacgacgg aggtgaagga ccagacgcca 60acgaccc 67<210>26<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>26ccgggggtcg ttggcgtctg gtccttcacc tccgtcgttg ctcctgattt ttaactcaga 60ccacatc 67<210>27<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>27ccggggaaag ggggtgcaac acatccatat ccagccatct ctacctgttt atggacaga 59<210>28<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>28accctctgtc cataaacagg tagagatggc tggatatgga tgtgttgcac cccctttcc 59<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>29gggttaggtg gttgctgatt ctctcattca cccagtggg 39<210>30<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>30gatccccact gggtgaatga gagaatcagc aaccaccta 39<210>31<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>31gagactcgag atgtggtctg agttaaaaat cagg 34<210>32<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>32agaggtagac cagtacgagt cacgtttgcc cctatcacca tccctaaccc tctgtccata 60aac 63<210>33<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的序列<400>33ccgctcgagc atgacagcat atatccagag 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權(quán)利要求
1.基本上純的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其含有具有血凝素活性的膜蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自包含于單鏈負鏈RNA病毒中的具有血凝素活性的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自副粘病毒的HN蛋白和/或正粘病毒的HA蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有血凝素活性的膜蛋白是包含于單鏈負鏈RNA病毒中的具有血凝素活性的蛋白質(zhì)的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中所述部分或全部已通過取代，缺失和/或添加而進行修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其進一步含有副粘病毒的F蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中F蛋白的部分或全部胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域已通過缺失和/或添加而修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其進一步含有得自對人細胞有感染性的病毒的包膜蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體含有得自逆轉(zhuǎn)錄病毒的兼嗜性包膜蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述載體含有得自水泡性口炎病毒的VSV-G蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自腫瘤病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體衍生自慢病毒。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述慢病毒衍生自猴免疫缺陷病毒。
13.根據(jù)權(quán)利要求3或5的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中所述副粘病毒是仙臺病毒。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中的載體以可表達的方式含有外源基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中的載體被用于將基因轉(zhuǎn)移至具有粘液的細胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中具有粘液的細胞是粘膜上皮細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中的粘膜上皮細胞是鼻腔或肺支氣管的粘膜上皮細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中的載體被用于將基因轉(zhuǎn)移至血細胞或造血細胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中的血細胞或造血細胞是造血干細胞。
20.用于基因轉(zhuǎn)移的組合物，所述組合物含有根據(jù)權(quán)利要求14至19中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其是藥物組合物。
22.將外源基因?qū)爰毎姆椒?，所述方法包括使細胞與根據(jù)權(quán)利要求14至19中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體接觸的步驟。
23.用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細胞，所述細胞以可表達的方式含有編碼具有血凝素活性的蛋白質(zhì)的DNA。
24.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，所述方法包括在根據(jù)權(quán)利要求23的包裝細胞中轉(zhuǎn)錄衍生自逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因轉(zhuǎn)移載體DNA的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有血凝素活性膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。利用這種具有血凝素活性的膜蛋白，本發(fā)明構(gòu)建了假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。該病毒載體能將基因高效轉(zhuǎn)移至宿主細胞。特別是證實了通過所述載體可將基因高效轉(zhuǎn)移至通過常規(guī)技術(shù)幾乎不能將基因轉(zhuǎn)移至其中的細胞，例如包括造血干細胞的血液細胞和造血細胞以及包括粘膜上皮細胞的粘膜細胞。本發(fā)明的病毒載體作為基因治療的載體非常有用。
文檔編號C12N15/867GK1444650SQ01813585
公開日2003年9月24日 申請日期2001年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月1日
發(fā)明者米滿吉和, 中島俊洋, 中丸健治, 小林雅典, 長谷川護, 上田泰次, 飯?zhí)镎虏? 榊原裕幸 申請人:株式會社載體研究所