專利名稱：一種RNAi載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種基于SFV病毒復(fù)制子載體構(gòu)建的RNAi載體及其在制備抑制靶基因表達的基因治療性藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年生命科學(xué)領(lǐng)域重要的科研成果之一。它是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制，通過雙鏈RNA(dsRNA)與同源mRNA堿基互補配對，并引導(dǎo)核酸酶迅速降解結(jié)合位點的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因的表達，具有高穩(wěn)定、高效率、高特異和高穿透的特點，故而被廣泛運用在沉默特定基因上。比此前抑制基因表達的所有方法都更高效特異和簡便易行?；谏鲜鰞?yōu)點，RNAi技術(shù)在生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，RNAi在線蟲、果蠅以及植物等模式生物中的應(yīng)用已經(jīng)取得了較多成果(尤其是功能基因組研究)，在哺乳動物中的研究和應(yīng)用也取得不少進展，特別是在抗腫瘤和抗病毒領(lǐng)域具有的重大潛在商用價值，已成為研究者及大眾熱切關(guān)注的焦點。
目前，實施RNAi的基本方法，包括以下步驟1、siRNA的設(shè)計與篩選；2、siRNA的獲得目前，較為常用的制備siRNA的方法如下(湯華主編，RNA干擾原理與應(yīng)用，科學(xué)出版社，2006)(1)化學(xué)合成直接通過化學(xué)方法合成兩條互補的21-23nt單鏈RNA，然后退火形成雙鏈RNA。這是最早應(yīng)用和目前仍為多數(shù)研究人員所采用的一種方法，簡便可靠，周期短，可引入各種有益的化學(xué)修飾，但成本較高。
(2)利用質(zhì)?；虿《倔w內(nèi)轉(zhuǎn)錄通過轉(zhuǎn)染含RNA聚合酶III啟動子(RNA polymerase III promoter，pol III)或RNA聚合酶II啟動子(pol II)及其下游一小段特殊結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒或病毒載體到宿主細胞內(nèi)，首先轉(zhuǎn)錄生成短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)，然后被Dicer酶水解成siRNA發(fā)揮基因沉默效應(yīng)。該方法相對麻煩，但可以發(fā)揮持續(xù)的抑制作用，利于長期研究。如果以病毒為載體則能進一步提高轉(zhuǎn)染效率。
目前，已有大量質(zhì)粒載體在醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域被廣泛使用，病毒載體在應(yīng)用上多用復(fù)制缺陷型腺病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒。
(3)體外轉(zhuǎn)錄及生物合成A、T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄法體外轉(zhuǎn)錄合成兩條互補的單鏈RNA，然后退火形成雙鏈siRNA。適用于篩選多種siRNA，尤其是需要制備多個siRNA而化學(xué)合成的成本較高時，但該方法不適用于對特定siRNA進行長期研究。局限性在于其設(shè)計、合成、終產(chǎn)物的純化處理等技術(shù)要求嚴格，不能引入化學(xué)修飾，而且并非所有序列均能被很好地轉(zhuǎn)錄。
B、PCR合成法以PCR方法為基礎(chǔ)合成Pol III啟動子-siRNA基因構(gòu)建體，然后直接轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)表達?？煽焖贆z測siRNA在細胞中的作用，適用于篩選最有效的siRNA/靶序列組合。主要缺點是很難轉(zhuǎn)染到細胞中。
C、重組人Dicer體外合成法用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備200-1000bp的雙鏈RNA，然后用重組Dicer或RNaseIII在體外消化，得到各種不同的siRNA的混合物。該方法省時、省力，但有序列不確定性，可能導(dǎo)致非特異性的基因沉默。同時，siRNA混合物必須經(jīng)仔細純化，且同體外轉(zhuǎn)錄法一樣，不能引入化學(xué)修飾。
3、siRNA的導(dǎo)入體外研究RNA/重組質(zhì)?？捎弥|(zhì)體/電轉(zhuǎn)法，重組病毒顆?？芍苯愚D(zhuǎn)染；體內(nèi)實驗大多直接進行局部注射或靜脈注射。但很難評價具體哪種方法能更有效地引起RNAi。
在RNAi技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于臨床之前，除siRNA自身的特異性外，還有以下問題亟待解決(陳煜，世界華人消化雜志，2006；142123)(1)siRNA導(dǎo)入細胞內(nèi)的效率低裸RNA或重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雖然對細胞系有作用，但對原代細胞的作用還不夠令人滿意。電穿孔可引起細胞大量死亡(超過50％)，所以RNAi技術(shù)要想在實際的臨床應(yīng)用中獲得成功，給藥的方式還有待于進一步研究。目前，病毒載體在臨床應(yīng)用中是被看好的一條途徑。另外，最近德國Vornloher等把siRNA附在一個靶向分子(脂溶性膽固醇)上也成功實現(xiàn)了靶向RNAi。
(2)siRNA的穩(wěn)定性RNA在體外和胞內(nèi)均極易降解，如何儲存并將siRNA高效特異地送入患者體內(nèi)的合適位置是個大難題。另外，siRNAs在病人體內(nèi)如不能迅速進入細胞內(nèi)，或者與血漿蛋白親和力低就會較早地被機體清除。穩(wěn)定性低和轉(zhuǎn)染方式低效，導(dǎo)致直接注射合成的siRNA所需的劑量極高，因此用于臨床治療將非常昂貴，不可行。此外，通過一些化學(xué)修飾等優(yōu)化手段只能相對增加其半衰期。為避免siRNA降解，利用編碼siRNA的重組載體在體內(nèi)復(fù)制是一條有效途徑，但如何選擇和設(shè)計最為安全高效的載體成為另一個難題，至今還未能找到一個理想的選擇。
(3)RNAi作用的時效性研究表明，哺乳動物RNAi與其它真核生物RNAi之間有一個明顯的區(qū)別哺乳動物細胞中對于RNAi的長期持續(xù)存在缺少放大系統(tǒng)。例如，果蠅中大約35個dsRNA可使1000個拷貝的目標mRNA沉默，并且可產(chǎn)生系統(tǒng)性RNAi甚至持續(xù)遺傳幾個世代，而在人工化學(xué)合成siRNA所致哺乳動物細胞中的RNAi平均只存在66h。這其中一個重要原因就是RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRp)的存在。RdRp已在植物、蠕蟲和真菌中發(fā)現(xiàn)，是沉默信號擴散、擴增和維持的基本條件，可通過以siRNA為引物合成新的dsRNA。然而在哺乳動物細胞中還沒有發(fā)現(xiàn)RdRp的同源物。目前，一些可能應(yīng)用于治療的實驗方案都不可避免地面臨著RNA作用時間等一些影響其持續(xù)作用的問題。對此，使用慢病毒或腺病毒等相關(guān)病毒載體獲得siRNA穩(wěn)定表達在部分研究者中被看好，但一方面安全性仍有明顯隱患(宿主基因組整合)，另一方面，這些載體體內(nèi)表達效率均不十分理想，抑制效果一般不如化學(xué)合成的siRNA，對某些細胞內(nèi)表達豐度特別高的基因更難以起到抑制作用。
如前所述，病毒載體可攜帶目的基因有效穿過細胞膜并在胞內(nèi)表達siRNA，是目前已知對siRNA轉(zhuǎn)染細胞低效性和siRNA穩(wěn)定性不佳問題最有效的解決方案。
在病毒載體的選擇上，各種病毒載體各有優(yōu)劣，主要視應(yīng)用目的綜合權(quán)衡。目前已在醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域得到使用的RNAi病毒載體，基本均為傳統(tǒng)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(含慢病毒載體)。
甲病毒載體系統(tǒng)(alphavirus Vector System，AV)是90年代末出現(xiàn)的最有前景的新一代載體系統(tǒng)之一。近年來，研究人員對Semliki森林病毒(Semliki forestvirus，SFV)研究得最多也最深入，該病毒為一種單股正鏈RNA病毒，宿主范圍廣泛，其5’編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白具有RdRp特性，病毒感染細胞后可不入核，在胞漿內(nèi)迅速自身復(fù)制并表達非結(jié)構(gòu)蛋白，3-5h內(nèi)開始大量催化亞基因組26S mRNA的復(fù)制和翻譯，并持續(xù)高表達直至最終所轉(zhuǎn)化細胞凋亡(Strauss and Strauss，Microbiol Rev.1994；58491 Review)。
重組SFV的制備簡單而迅速，每個細胞內(nèi)可產(chǎn)生105RNA和108蛋白，在2天之內(nèi)就可達到109-1010PFU/mL的高滴度，且不需要進一步的純化或離心。相比起來，逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒、腺相關(guān)病毒所花的時間和精力都要大得多，而病毒滴度遠低于SFV。腺病毒雖轉(zhuǎn)染效率、滴度也不錯，在臨床實驗中取得較好的治療效果，但機體針對該病毒的免疫反應(yīng)的問題卻較突出。SFV則沒有這些缺陷，它可以反復(fù)注射而不會引起機體針對病毒自身的免疫反應(yīng)(陳煜，世界華人消化雜志2006；142123)。LiljestromP等人將早期SFV載體中的結(jié)構(gòu)蛋白基因切除另外構(gòu)建成輔助載體，并在輔助載體的結(jié)構(gòu)基因中設(shè)置了一系列突變，用于人體更為安全(Liljestrom P，J Virol，1991，654107；Suopanki J，J Gen Virol.1998；79309)。歐洲已有研究者用AV載體研制疫苗，獲得了令人振奮的早期結(jié)果。目前，SFV載體主要用于表達蛋白。但研究表明，在去除3’末端重復(fù)序列(3’-UTR)的情況下，其亞基因組RNA仍可復(fù)制或轉(zhuǎn)錄，卻不能再進一步表達為蛋白，這使SFV復(fù)制酶用于表達siRNA成為可能(金奇，醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)，科學(xué)出版社，2001)。況且，RNAi的過程主要在胞漿中進行，SFV可在胞漿中直接復(fù)制，而且本來就是RNA病毒，因而用于表達siRNA具有先天的巨大優(yōu)勢，所能形成的RNA產(chǎn)率可使所有現(xiàn)有的RNAi質(zhì)粒/病毒難望其項背。
現(xiàn)有SFV載體的最大特點是轉(zhuǎn)染、表達效率極高且不引起抗病毒免疫，但表達時間相對較短，這一特性，在機體需要長期表達時就成為缺點，不如慢病毒等。但從免疫學(xué)和安全的角度來看，這也是一個優(yōu)點，因為短時間高強度刺激是符合免疫系統(tǒng)的要求的，不整合入宿主細胞基因組，則致癌的風(fēng)險性更低；另一方面，RNA復(fù)制酶缺乏DNA聚合酶的監(jiān)督糾錯機制，本身也不利于長期表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可高效、特異抑制靶基因表達的RNAi載體。
本發(fā)明所提供的RNAi載體，是在SFV載體骨架中含有CMVIE啟動子和Sv40 polyA的重組SFV表達載體；所述CMV IE啟動子的GenBank號為U57607.1(1-589)，Sv40poly A的GenBank號為AM697713(2404-2644)。
在所述重組SFV載體骨架中，所述CMV IE啟動子位于SFV病毒5’末端非翻譯區(qū)(5’-UTR)的上游。在用CMV IE啟動子替代原SP6啟動子驅(qū)動SFV非結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄，并相應(yīng)地在SFV 3’末端非翻譯區(qū)(3’-UTR)下游加入Sv40 poly A以確保轉(zhuǎn)錄正確終止后，可以在構(gòu)建重組質(zhì)粒時直接用DNA操作，減少了須RNA操作的不便。
由于SFV載體原有的多克隆位點(MCS)所包含的酶切位點少且設(shè)計欠佳，為方便外源基因的插入及轉(zhuǎn)錄，可在所述重組SFV載體骨架中的26S亞基因組啟動子下游添加含優(yōu)化多克隆位點的shRNA表達元件；所述shRNA表達元件自上游至下游依次包含一個RNA聚合酶III(RNA pol III)啟動子、多克隆位點和由5-6個(優(yōu)選為5個)堿基“T”組成的終止信號；所述RNA pol III啟動子的選擇是廣泛的，如人或鼠的U6、H1RNP RNA啟動子，也可選擇tRNAval或tRNAmet等tRNA啟動子，優(yōu)選為改良的人tRNAmet啟動子MTD，其序列參見文獻Boden D，Pusch O，Lee F，et al.Nucleic Acids Res.2003； 31(17)5033-8。
所述shRNA表達元件中的多克隆位點所包含的酶切位點可根據(jù)實際需要進行選擇，以方便目的基因的插入。所述目的基因可為由一個莖環(huán)(loop)序列分開的針對沉默靶基因設(shè)計的小干擾RNA編碼基因的正義鏈和反義鏈序列，所述莖環(huán)的序列可由使用者根據(jù)需要自主選擇，如5’-TTCAAGAGA-3’或5’-TCAAGAG-3’等。
為方便進行真核抗性篩選，在所述shRNA表達元件中的多克隆位點和終止信號之間還包含一個真核抗性基因選擇復(fù)合體；所述真核抗性基因選擇復(fù)合體自上游至下游依次包含一個SV40早期啟動子(GenBank號為X99274，6850-7187)、一個抗生素抗性基因以及一個HSV-TK Poly A(GenBank號為AB242435，3867-3885)。
所述抗生素抗性基因的選擇是廣泛的，如Neomycin(Neo，Kan/G418耐受)、Zeomycin、Hygromycin(Hygro)抗性基因或GFP/Neo(綠色熒光蛋白報告基因和Kan/G418抗性基因)等，優(yōu)選為Neomycin抗性基因(GenBank號為AF113968，2277-3080)。
此外，為避免產(chǎn)生過多不必要的蛋白/多肽引起非特異性反應(yīng)，同時減低SFV毒性，延長宿主細胞shRNA的表達時間，還可去掉原SFV載體骨架中SFV病毒基因的3’末端非翻譯區(qū)(3’-UTR)的重復(fù)序列(repeating seqence)，以使SFV病毒26S亞基因組保持RNA復(fù)制/轉(zhuǎn)錄功能而基本喪失翻譯功能。
用于構(gòu)建所述RNAi載體的出發(fā)載體的選擇也是廣泛的，可為pSFV-1、pSFV-3、pCMV-Rep或pSCA1等任意的SFV病毒復(fù)制子載體。
其中，以pSFV-1為出發(fā)載體構(gòu)建的RNAi載體為pSFV-RNAi Ready。
所述RNAi載體可按照基因工程領(lǐng)域的常規(guī)方法構(gòu)建。
本發(fā)明提供了一種RNAi載體。該載體是利用SFV病毒復(fù)制子載體構(gòu)建的一種RNAi體內(nèi)表達載體。在本發(fā)明的RNAi載體中的多克隆位點插入針對靶基因設(shè)計的shRNA的編碼DNA，再以重組質(zhì)粒/重組病毒方式轉(zhuǎn)染細胞后，通過宿主細胞核中RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄重組體，產(chǎn)生正鏈RNA并翻譯合成病毒的復(fù)制酶，隨后，就可借助該復(fù)制酶的RdRp放大效果，啟動亞基因組中shRNA表達元件的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，大量合成子代shRNA，從而在轉(zhuǎn)染細胞中高效、特異地抑制靶基因的表達，實驗結(jié)果表明抑制效果可達90％以上，且10d后抑制效果依然存在，超過體外合成siRNA的平均時間66h，時間接近一般質(zhì)粒載體水平，而抑制效率遠遠勝出，因此，針對某些細胞內(nèi)用常規(guī)載體抑制效果欠佳的高豐度表達基因本發(fā)明的RNAi載體有突出的抑制效果。本發(fā)明載體適用于需短期高效沉默目的基因的科學(xué)研究或制備研究基因功能的試劑中，特別是可用本發(fā)明的RNAi載體制備成抑制靶基因(包括癌基因、轉(zhuǎn)錄因子基因和生長因子基因等基因，例如HPV E6、E7，c-myc或VEGF基因等)表達的基因治療性藥物。因此，本發(fā)明將在生物醫(yī)藥領(lǐng)域及基因功能的研究中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為RNAi載體pSFV-RNAi Ready的物理圖譜及構(gòu)建過程示意2為本發(fā)明RNAi載體的作用原理示意3為實施例2中的各處理組與空白對照組的部分Western blot鑒定結(jié)果及其16E6蛋白表達水平變化的灰度比值柱形圖具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列如無特別說明均由上海生工合成。
實施例1、RNAi載體pSFV-RNAi Ready的構(gòu)建以pSFV-1為出發(fā)載體，構(gòu)建本發(fā)明的RNAi載體pSFV-RNAi Ready，具體構(gòu)建方法包括以下步驟1)用CMVIE啟動子+Sv40 poly A體系替換SP6啟動子(見圖1中的①)。具體方法為合成引物P1(帶下劃線堿基為Spe I識別位點)5’-caaactagtcaaacatgataagatac-3’、P2(帶下劃線堿基為Xba I識別位點)5’-ggctctagataccacatttgtagagg-3’、P3(帶下劃線堿基為Sph I識別位點)5’-gccggcatgctagttattaataggtaa tcaattacggggtc-3’、P45-catccgccatcgttagccagaggatctgacg-3’以及P55’-ctctggctaacgatggcggatgtgtgacatac-3’和P6(帶下劃線堿基為EcoR V識別位點)5’-cagtgatatccaagatg agtgtgtctttg-3’。首先在SFV3’-UTR下游加入Sv40 poly A以pIRES2-EGFP質(zhì)粒(Clontech公司)為模板，在引物P1和P2的引導(dǎo)下PCR擴增Sv40 poly A片段，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)擴增獲得了250bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致?；厥詹⒓兓?50bp的Sv40 poly A片段，再插入經(jīng)Spe I酶切并去磷酸化的載體pSFV-1中，得到含有Sv40 poly A片段的重組pSFV-1載體，命名為pSFV-Sv40 poly A。
然后，以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，在引物P3和P4的引導(dǎo)下PCR擴增CMV IE啟動子，反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)擴增獲得了621bp的DNA片段(含589bp的CMV IE啟動子序列)，與預(yù)期結(jié)果一致。再以pSFV-1為模板，在引物P5和P6的引導(dǎo)下PCR擴增SFV復(fù)制子5’端的前281bp序列。上述PCR反應(yīng)條件均為先95℃ 5min；然后95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共35個循環(huán)；再72℃延伸10min。
最后，以回收的621bp和281bp的擴增片段為模板，在引物P1和P4的引導(dǎo)下進行重疊延伸PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為先95℃ 5min；然后95℃ 1min，58℃ 1min，72℃1min，共35個循環(huán)；再72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)擴增獲得了902bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致?；厥詹⒓兓?02bp的DNA片段，對其用限制性內(nèi)切酶Sph I和EcoR V消化后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pSFV-Sv40 poly A(去掉了SP6啟動子)連接，即用CMV IE啟動子替換SP6啟動子，得到用CMVIE啟動子+Sv40 poly A體系替換SP6啟動子的重組載體，命名為pSFV-Sv40poly A/CMV IE。
2)在26S亞基因組啟動子的下游添加帶有經(jīng)改良多克隆位點的shRNA表達元件(見圖1中的②)。shRNA表達元件包括一個tRNA啟動子、多克隆位點(自上游至下游依次為限制性內(nèi)切酶BamH I、BssH II、Cla I、Nsi I、Apa I和Sma I/Xma I識別位點)和由5個堿基“T”組成的終止信號。在步驟1)獲得的重組載體中的26S亞基因組啟動子下游添加所述shRNA表達元件，具體方法為如下設(shè)計合成兩條寡核苷酸(L15’-CGCGGATCCGCGCGCATCGATGCATGGGCCCGGGATCCGG-3’和L25’-CCGGATCCCGGGCCCATGCATCGATGCGCGCGGATCCGCG-3’)，將等摩爾的L1和L2兩條鏈混合，于100℃水浴5min后，將其慢慢冷卻至室溫，使其退火成雙鏈。然后將該雙鏈接頭用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sma I雙酶切后，與經(jīng)同樣酶雙酶切的載體pSFV-Sv40 polyA/CMV IE連接，即在上述重組SFV載體中再引入一個含多種稀有酶切位點的多克隆位點，將該重組載體命名為pSFV-Sv40 poly A/CMV IE/C。
然后，在上述重組載體pSFV-Sv40 poly A/CMV IE/C多克隆位點的BamH I酶切位點處添加tRNA啟動子MTD(modified human tRNAmet-derived promoter)，序列參見文獻Boden D，Pusch O， Lee F，et al.Nucleic Acids Res.2003；31(17)5033-8。具體添加方法如下合成引物P75’-TGCTGGGCCCATAACCCAGAGGTCGATGGATCGAAACCTGCGCCACTCCTGATGAGCCTCTAGACACTCTCGAGGGCGAT-3’和P85’-ATCGCCCTCGAGAGTGTCTAGAGGCTCATCAGGAGTGGCGCAGGTTTCGATCCATCGACCTCTGGGTTATGGGCCCAGCA-3’，以及P9(帶下劃線堿基為BamH I識別位點)5’-TGGATCCGGCAGAACAGTCGAGTGGCGCAGCGGAAGCGTGCTGGGCCCATAAC-3’和P10(帶下劃線堿基為BamH I識別位點)5’-TGGATCCATGATGTTAGGAGATCTAAACAGAACAGTATCGCCCTCGAGAGTGTCTAG-3’。其中，P7和P8互補，P9與P10分別與之搭上15-21bp。將四條引物混合，進行重疊延伸PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；然后94℃ 1min，58℃ 45sec，72℃ 45sec，共35個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)擴增獲得了165bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致?；厥詹⒓兓?65bp的目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶BamH I酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的重組SFV載體pSFV-Sv40 poly A/CMV IE/C連接，得到添加shRNA表達元件的重組SFV載體，命名為pSFV-Sv40/CMV/C/shRNA。
3)在所述shRNA表達元件中的多克隆位點和終止信號之間再添加一個真核抗性基因選擇復(fù)合體(見圖1中的③)。該真核抗性基因選擇復(fù)合體自上游至下游依次為一個SV40早期啟動子(GenBank號X99274，6850-7187)、一個Neomycin抗性基因(GenBank號AF113968，2277-3080)和一個HSV-TK PolyA(GenBank號AB242435，3867-3885)。在步驟2)獲得的重組SFV載體骨架中SV40 PolyA和ori之間再添加一個真核抗性基因選擇復(fù)合體，具體方法如下設(shè)計合成引物P9(帶下劃線堿基為Spe I識別位點)5’-CGGACTAGTTAGTTATTAATAGTAATCA-3’和P10(帶下劃線堿基為Spe I識別位點)5’-TTACTAGTGATCTGACGGTTCAC-3’，以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，在引物P9和P10的引導(dǎo)下PCR擴增真核抗性基因選擇復(fù)合體，PCR反應(yīng)條件為先94℃ 5min；然后94℃1min，56℃ 1min，72℃ 2min，共32個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)擴增獲得了1.4Kb的DNA片段(含SV40早期啟動子/增強子、Neomycin抗性基因和HSV-TK Poly A)，與預(yù)期結(jié)果一致?；厥詹⒓兓?.4Kb的目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶Spe I酶切后，與經(jīng)相同酶酶切的重組SFV載體pSFV-Sv40/CMV/C/shRNA連接，得到添加有真核抗性基因選擇復(fù)合體的的重組SFV載體，命名為pSFV-Sv40/CMV/C/shRNA/K。
4)去除SFV載體骨架中的SFV病毒基因3’-UTR終止子與Poly A之間的重復(fù)序列(見圖1中的④)用限制性內(nèi)切酶SsP I(購自Takara公司)對步驟3)得到的重組載體進行partial酶切準備多個20μl常規(guī)酶切體系(酶切體系及反應(yīng)條件參見試劑盒說明書)，分別于第1min、3min、10min中止反應(yīng)，尋找并切膠回收11.5Kb和1.5Kb的DNA片段；合成引物P13(帶下劃線堿基為SsPI識別位點)5’-gagaatattgggaagaatatgctaaac-3’和P14(帶下劃線堿基為SsPI識別位點)5’-gaaatattaaaaaccaatttcaattaattaccc-3’，以上述回收的1.5Kb DNA片段為模板，，在引物P13和P14的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增條件為先95℃預(yù)變性5min；然后95℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1.5min，32個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)擴增獲得了1.2Kb的DNA片段(所述重復(fù)序列去除)，與預(yù)期結(jié)果一致。回收并純化該1.2Kb的DNA片段，將其與前述11.5Kb片段16℃連接過夜(12-16h)，得到本發(fā)明的重組SFV載體，命名為pSFV-RNAi Ready，其物理圖譜如圖1所示。該載體的作用原理示意圖如圖2所示，將針對靶基因設(shè)計的shRNA的編碼DNA連接入該載體的多克隆位點，再將重組載體轉(zhuǎn)染細胞后，在CMV啟動子調(diào)控下于胞核內(nèi)利用PolII復(fù)制出病毒(+)股基因組RNA，病毒RNA自身催化復(fù)制出(-)股等長基因組RNA，出核后以此為模板再進行(+)股基因組RNA的大量復(fù)制(包括基因組RNA和26S亞基因組RNA)，含全部shRNA表達元件的26S mRNA經(jīng)Dicer加工后可引起RNAi。此外，在tRNA啟動子的作用下，在核內(nèi)(-)股基因組RNA亦可高效轉(zhuǎn)錄出不帶3’-polyA的shRNA。
實施例2、利用本發(fā)明的RNAi載體抑制HPV16E6基因在人宮頸癌細胞Caski中的表達以HPV16E6基因為例，檢測實施例1構(gòu)建的載體pSFV-RNAi Ready的RNAi效果，具體方法包括以下步驟1、抑制HPV16E6基因表達的小干擾RNA的設(shè)計及其編碼基因的獲得根據(jù)HPV16E6基因序列(GenBank號AF536179，83-559)，選取位于HPV16E6基因開放閱讀框架(ORTs)序列轉(zhuǎn)錄起始位點ATG下游104-124處長度21bp的序列為靶點序列進行設(shè)計，得到抑制HPV16E6基因表達的小干擾RNA，序列如下正義鏈5’-UGUGUGUACUGCAAGCAACUU-3’；反義鏈5’-GUUGCUUGCAGUACACACAUU-3’。
經(jīng)Blast比對后排除非特異性同源序列。將該雙鏈RNA序列命名為siRNA-HPV16E6，其反義鏈與HPV16E6 mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點下游的106-124位置序列5’-UGUGUGUACUGCAAGCAAC-3’(19bp)互補。
再根據(jù)siRNA-HPV16E6作用的靶序列和siRNA設(shè)計方案設(shè)計能夠產(chǎn)生siRNA-HPV16E6的siRNA序列，并添加上BssH II粘端、19N鏈、莖環(huán)序列、反向互補19N鏈、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)和Cla I粘端，命名為siDNA-HPV16E6，具體序列如下(下劃線堿基序列為針對HPV16E6 mRNA的靶序列)siDNA-HPV16E6正義鏈(序列表中序列1)5’- GTGTGTGTACTGCAAGCAAC GTTGCTTGCAGTACACACATTTTT -3’BssHII粘端 19N鏈 環(huán)序列 反向互補19N鏈 轉(zhuǎn)錄終止區(qū) Cla I粘端siDNA-HPV16E6反義鏈(序列表中序列2)3’- CACACACATGACGTTCGTTG CAACGAACGTCATGTGTGTAAAAAA -5’人工合成上述siDNA-HPV16E6的正義鏈和反義鏈(上海吉凱公司)，并加水分別溶解至1μg/μl。
2、抑制HPV16E6基因表達的重組RNAi載體的構(gòu)建1)將步驟1合成的siDNA-HPV16E6的正義鏈和反義鏈退火成為雙鏈DNA，20μl復(fù)性反應(yīng)體系為正義鏈1μl，反義鏈1μl，20×SSC(sigma公司，Cat.S6639)1μl，水17μl。反應(yīng)條件為95℃加熱10min。取出，室溫下冷卻1h，稀釋至濃度為40ng/μl。
2)將步驟1)獲得的雙鏈siDNA-HPV16E6用限制性內(nèi)切酶Sma I和BamH I進行雙酶切后與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pSFV-RNAi Ready用T4 DNA連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含50mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板上進行篩選陽性轉(zhuǎn)化子，挑取長出的單克隆，接種于5mL含50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖菌，提質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BssH II和Cla I進行雙酶切鑒定，對酶切產(chǎn)物進行4％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果經(jīng)酶切獲得了約60bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再對質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的含有抑制HPV16E6基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組RNAi載體，命名為pSFV-RNAi-HPV16E6。
3)以將上述雙鏈siDNA-HPV16E6兩端的酶切位點分別更換為Hind III和EcoR I，合成并重組入無關(guān)siRNA質(zhì)粒pSilencer1.0-U6(購自Ambion)相應(yīng)的多克隆位點處得到的重組質(zhì)粒為對照，命名為pSilencer-RNAi-HPV16E6。
4)在pSFV-RNAi Ready的多酶切位點中連入一個EGFP基因(GenBank號EF028672，45-758)，以作為對照方便觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。EGFP基因可從其它質(zhì)粒如pIRES2-EGFP中經(jīng)PCR擴增或直接酶切獲得。將連接有EGFP基因的重組質(zhì)粒命名為pSFV-GFP。
3、轉(zhuǎn)染Caski細胞及轉(zhuǎn)染細胞HPV16E6基因表達水平的檢測將步驟2經(jīng)測序鑒定正確的重組載體pSFV-RNAi-HPV16E6用電穿孔法(Amaxa電轉(zhuǎn)儀)轉(zhuǎn)染Caski細胞(武漢大學(xué)細胞保藏中心)，另設(shè)Caski細胞空白對照組、pSFV-GFP對照組、化學(xué)合成siRNA(上海吉瑪)處理組、陰性對照siRNA(上海吉瑪)組和無關(guān)RNAi質(zhì)粒pSilencer-RNAi-HPV16E6處理組，同樣方法轉(zhuǎn)染Caski細胞。具體步驟為Caski細胞用含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化、離心收集細胞，選擇針對宮頸癌細胞的Nucleofector液轉(zhuǎn)染液100μl(Amaxa電轉(zhuǎn)試劑盒)重懸細胞，加入2μg線性化載體或終濃度為250nmol/L的siRNA，混勻后將細胞、DNA混合物移入移入Amaxa特制電擊池，選擇宮頸癌細胞轉(zhuǎn)染程序電轉(zhuǎn)3s。電轉(zhuǎn)結(jié)束后取出電擊池，向電擊池中加入0.5mL培養(yǎng)液，沖洗并移入6孔板中培養(yǎng)。每12h熒光顯微鏡觀察pSFV-GFP組轉(zhuǎn)染情況。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、120h和10d鏡下觀察并收集各細胞，Western Blot法檢測細胞內(nèi)HPV16E6蛋白的表達，具體步驟為收集細胞到蛋白上樣緩沖液中，沸水浴10min，10000rpm離心10min，取上清，經(jīng)15％的SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗人HPV16E6單抗(Chemicon公司)為一抗，HRP標記的羊抗小鼠IgG(上海華美)為二抗進行免疫酶反應(yīng)，DAB顯色，Gel-Pro Analyzer軟件對各處理組與空白對照組的灰度掃描比值分析細胞中16E6蛋白表達水平的變化。
轉(zhuǎn)染后48h的Western Blot鑒定結(jié)果如圖3所示(Control為對照組)，上述WesternBlot鑒定與熒光顯微鏡觀察計數(shù)結(jié)果表明，利用Amaxa公司的電轉(zhuǎn)方法，pSFV-RNAiReady載體對Caski細胞轉(zhuǎn)染率可達75.7％，所攜shRNA高水平表達，對HPV16E6蛋白表達水平的抑制率達到95.6％(總的抑制率為72.4％)。與化學(xué)合成siRNA組與空白對照組比，使用本發(fā)明載體RNAi抑制效果峰值無明顯降低，且出現(xiàn)早(轉(zhuǎn)染后24h內(nèi))，持續(xù)時間長(10d抑制效果依然存在)，而化學(xué)合成siRNA組(接近100％轉(zhuǎn)染成功)對HPV16E6蛋白的抑制率約為76.5％，轉(zhuǎn)染后48h達到峰值，72h后基本喪失；無關(guān)RNAi質(zhì)粒組總抑制效果僅為約60％，由于其質(zhì)粒的抑制率遠小于pSFV-RNAi Ready，細胞轉(zhuǎn)染率應(yīng)該更高，提示本發(fā)明載體對外源RNA(shRNA)的表達效率大大超過常規(guī)的RNAi載體。上述檢測結(jié)果表明用本發(fā)明的RNAi載體可高效、特異地抑制靶基因的表達。
4、產(chǎn)生重組SFV病毒顆粒并感染細胞方法將步驟2經(jīng)測序鑒定正確的重組載體pSFV-RNAi-HPV16E6及SFV-helper質(zhì)粒(購自Invitrogene)共同轉(zhuǎn)染BHK-21包裝細胞，將轉(zhuǎn)染細胞置于含600μg/L G418和10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基進行篩選，將篩選出的陽性轉(zhuǎn)染細胞進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后取培養(yǎng)液上清離心收集病毒，然后將病毒顆粒加入傳代24小時貼壁的Caski細胞培養(yǎng)體系(MOI 10)，常規(guī)培養(yǎng)，并分別于24、72、120h和10d收集細胞提總蛋白，用步驟3相同的Western Blot法檢測細胞內(nèi)HPV16E6蛋白的表達水平；另外，取病毒轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h細胞，PBS清洗，2％多聚甲醛固定10min，作X-gal染色，計數(shù)5個高倍鏡視野下，核藍染細胞和未藍染細胞的比例，分析病毒基因轉(zhuǎn)染細胞的能力。
結(jié)果顯示MOI為10時，該重組病毒對Caski細胞轉(zhuǎn)染率可提高到96.7％；對HPV16E6蛋白總抑制率在90％以上，且10d后抑制效果依然存在。上述檢測結(jié)果表明用本發(fā)明的RNAi載體可高效、特異地抑制靶基因的表達，且持續(xù)時間長。
序列表<160>2<210>1<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgcgcgtgtg tgtactgcaa gcaacttcaa gagagttgct tgcagtacac acatttttta60t61<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcacacacat gacgttcgtt gaagttctct caacgaacgt catgtgtgta aaaaatagc 59
權(quán)利要求
1.一種RNAi載體，是在SFV載體骨架中含有CMV IE啟動子和Sv40 poly A的重組SFV表達載體；所述CMV IE啟動子的GenBank號為U57607.1(1-589)，Sv40 polyA的GenBank號為AM697713(2404-2644)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNAi載體，其特征在于在所述重組SFV載體骨架中，所述CMV IE啟動子替換原SP6啟動子，且位于SFV病毒基因5’末端非翻譯區(qū)的上游。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNAi載體，其特征在于在所述重組SFV載體骨架中的26S亞基因組啟動子下游添加shRNA表達元件；所述shRNA表達元件自上游至下游依次包含一個RNA pol III啟動子、一個多克隆位點和由5-6個堿基“T”組成的終止信號；所述tRNA啟動子為人或鼠的U6 RNA啟動子、H1RNP RNA啟動子，或tRNAval啟動子、tRNAmet啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNAi載體，其特征在于所述tRNA啟動子為RNAmet啟動子MTD。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNAi載體，其特征在于在所述shRNA表達元件中的多克隆位點和終止信號之間還包含一個真核抗性基因選擇復(fù)合體；所述真核抗性基因選擇復(fù)合體自上游至下游依次包含一個SV40早期啟動子、一個抗生素抗性基因以及一個HSV-TK Poly A；所述SV40早期啟動子的GenBank號為X99274(6850-7187)，HSV-TK Poly A的GenBank號為AB242435(3867-3885)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的RNAi載體，其特征在于所述抗生素抗性基因為Neomycin、Zeomycin、Hygromycin或GFP/Neo抗性基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNAi載體，其特征在于將所述重組SFV表達載體骨架中SFV病毒基因的3’末端非翻譯區(qū)的重復(fù)序列去除。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的RNAi載體，其特征在于用于構(gòu)建所述RNAi載體的出發(fā)載體為pSFV-1、pSFV-3、pCMV-Rep或pSCA1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的RNAi載體，其特征在于以pSFV-1為出發(fā)載體構(gòu)建的RNAi載體為pSFV-RNAi Ready。
10.權(quán)利要求1-9任一項所述的RNAi載體在制備抑制靶基因表達的基因治療性藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種RNAi載體及其應(yīng)用，其目的是提供一種基于SFV病毒復(fù)制子載體的重組SFV表達載體及其在制備抑制靶基因表達的基因治療性藥物中的應(yīng)用。該RNAi載體是在SFV載體骨架中含有CMV IE啟動子和Sv40 poly A的重組SFV表達載體；所述CMV IE啟動子的GenBank號為U57607.1(1－589)，Sv40 poly A的GenBank號為AM697713(2404－2644)。本發(fā)明載體適用于需短期高效沉默目的基因的科學(xué)研究或制備研究基因功能的試劑中，特別是可用本發(fā)明的RNAi載體制備成抑制靶基因表達的基因治療性藥物。因此，本發(fā)明將在生物醫(yī)藥領(lǐng)域及基因功能的研究中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A61K48/00GK101067139SQ20071009914
公開日2007年11月7日 申請日期2007年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月14日
發(fā)明者楊崢嶸, 黃來強, 王海峰 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院